专利名称：一种培育转基因杂交水稻的方法
一种培育转基因杂交水稻的方法技术领域
本发明属于转基因生物安全技术领域，涉及一种培育转基因杂交水稻的方法，特别涉及一种培育安全转基因杂交水稻的方法。
背景技术：
杂种优势是自然界普遍存在的现象。杂交育种就是通过不同品种间的杂交，在杂交后代的分离群体中筛选集合双亲优良性状的个体并最终形成品种。但由于长期定向选择，种内可用的优异基因逐渐减少，通过常规杂交育种方法选育能够满足人们需求的优良品种正面临很大的挑战，于是育种家们开始寻求将丰富的生物资源库中的优异基因用于杂交育种的新方法和新途径。
植物转基因技术的迅猛发展，为育种家们提供了培育优质杂交种的新方法。利用转基因技术培育杂交种，不但可以实现I个或多个目标基因的定向转移，而且能打破有利基因和不利基因的连锁，缩短育种进程。但转基因飘流及其可能引起的环境后果等转基因安全性问题越来越受到人们的关注，已成为限制转基因杂交种应用的瓶颈问题之一。因此，探寻培育安全的转基因杂交种的新方法势在必行。
蛋白内含肽(Intein)是一类介导翻译后蛋白剪接的内部蛋白元件，前体蛋白中Intein催化一系列反应，将其自身从前体蛋白中移去，并将两侧称为Extein的蛋白片段以正常的肽键连接起来形成成熟蛋白，这个过程称为蛋白剪接。蛋白剪接是一个非常快速的过程，Intein-Extein连接处的3个保守的氨基酸残基直接参与蛋白的拼接反应,包括Intein N末端的Ser或Cys(基序A的第一个氨基酸),Intein C末端的Asn或Gln (基序G的最后一个氨基酸),C-extein起始端的Ser、Thr或Cys。Intein首先是在酵母中发现的。1990年Kane等[Kane PM, Yamashiro CT, Wolczyk DF, Neff N, Goebl M, Stevens TH(1990)Protein splicing converts the yeast TFPlgene product to the69_kD subunit ofthe vacuolar H(+)-adenosine triphosphatase.Science250:651 - 657]在研究酵母(Saccharomyces cerevisiae))液泡 H(+) 2ATPase 的 69kD 亚基基因 vmal 时，首次发现蛋白质的自我剪接现象。Intein普遍存在于三界生物系统(古细菌、真细菌和真核生物)中，目前在 InBase 库中注册的 intein 已有 580 多个(http: //www.neb.com/neb/inteins.html )。Intein 一般由128-1650个氨基酸残基所组成，含有高度保守的基序A、B、F和G[NorenCJ, Wang J, Perler FB(2000)Dissecting the chemistry of protein splicing and itsapplications.Angew Chem Int Ed Engl39 (3): 450 - 466]。根据 Intein 是否含有居家核酸内切酶(homing endonuclease)结构域，可将其分为大Intein和小Intein,大Intein含有居家核酸内切酶结构域、N端和C端剪接域，其中居家核酸内切酶结构域不参与蛋白剪接，推测其功能是通过自导引的机制来促进Intein的转移[Gimble FS, Thorner J(1992)Homing of a DNA endonuclease gene by meiotic gene conversion in Saccharomycescerevisiae.Nature357:301 - 306]。另外，根据N端和C端剪接域是否为共价连接，可将 Intein 分为 cis-splicing inteins 和 trans-splicing inteins [Wu H，Xu MQj LiuXQ(1998)Protein trans-splicing and functional min1-1nteins of a cyanobacterialDnaB Intein.Biochim Biophys Actal387:422 - 432]。发明内容
本发明的目的是提供一种培育转基因杂交水稻的方法。
本发明所提供的培育转基因杂交水稻的方法，具体包括如下步骤:
(I)将目的基因分成5’端序列和3’端序列两部分；在所述目的基因的5’端序列的3’末端直接连接内含肽(intein)的N端剪接区的核苷酸序列，形成融合基因片段A ;在所述目的基因的3’端序列的5’末端直接连接内含肽(intein)的C端剪接区的核苷酸序列，形成融合基因片段B;
(2)为如下 I)或 II):
I)为如下 al)_a5):
al)将所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者中的一个导入水稻三系杂交体系中的恢复系，得到转基因水稻恢复系；另一个导入所述水稻三系杂交体系中的保持系，得到转基因水稻保持系；
a2)通过确定所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻保持系基因组中的拷贝数(可采用Southern杂交检测)及在染色体上的插入位点(可进行染色体定位分析)，得到满足如下条件的所述转基因水稻恢复系和所述转基因水稻保持系，分别记作转基因水稻恢复系-1和转基因水稻保持系-1:
所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻保持系基因组中均以单拷贝的形式插入，并且所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻保持系基因组中所位于的染色体编号相同；
a3)筛选(如抗生素压力筛选)获得转基因水稻恢复系-1纯合系和转基因水稻保持系-1纯合系；
a4)将步骤a3)所得的转基因水稻保持系-1纯合系与所述水稻三系杂交体系中的不育系杂交，获得含有所述融合基因片段A或所述融合基因片段B的转基因水稻不育系；
a5)将步骤a3)所得的转基因水稻恢复系_1纯合系与步骤a4)所得的转基因水稻不育系杂交，获得同时含有所述融合基因片段A和所述融合基因片段B的转基因杂交水稻;
II)为如下 bl)_b4):
bl)将所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者中的一个导入水稻两系杂交体系中的恢复系，得到转基因水稻恢复系；另一个导入所述水稻两系杂交体系中的不育系，得到转基因水稻不育系；
b2)通过确定所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻不育系基因组中的拷贝数(可采用Southern杂交检测)及在染色体上的插入位点(可进行染色体定位分析)，得到 满足如下条件的所述转基因水稻恢复系和所述转基因水稻不育系，分别记作转基因水稻恢复系-1和转基因水稻不育系-1:
所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻不育系基因组中均以单拷贝的形式插入，并且所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻不育系基因组中所位于的染色体编号相同；
b3)筛选(如抗生素压力筛选)获得转基因水稻恢复系-1纯合系和转基因水稻不育系-1纯合系；
b4)将步骤a3)所得的转基因水稻恢复系_1纯合系与转基因水稻不育系_1纯合系杂交，获得同时含有所述融合基因片段A和所述融合基因片段B的转基因杂交水稻。
在本发明的一个实施例中，具体是将所述融合基因片段A导入所述水稻三系杂交体系中的恢复系，得到转基因水稻恢复系；将所述融合基因片段B导入所述水稻三系杂交体系中的保持系，得到转基因水稻保持系。
在本发明中，所述内含肽具体为来自于集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC6803)的DnaE内含肽。
在蛋白水平上，所述DnaE内含肽的N端剪接区的氨基酸序列具体为序列表中序列I。所述DnaE内含肽的C端剪接区的氨基酸序列为序列表中序列2。
在基因水平上，所述DnaE内含肽的N端剪接区的核苷酸序列具体为序列表中序列3。所述DnaE内含肽的C端剪接区的核苷酸序列为序列表中序列4。
在本发明中，所述目的基因具体为具有草甘膦抗性的G2-aroA基因；所述G2-aroA基因的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
进一步,所述G2_aroA基因的所述5’端序列为序列5的第1_885位；所述G2_aroA基因的所述3’端序列为序列5的第886-1335位。
在本发明的一个实施例中，所述水稻三系杂交体系中的恢复系具体为水稻品种中恢8006 ;所述水稻三系杂交体系中的保持系具体为水稻品种内香2B ;所述水稻三系杂交体系中的不育系具体为水稻品种内香2A。
在本发明中，所述方法步骤al)或bl)中，将所述融合基因片段A或所述融合基因片段B导入所述水稻三系杂交体系中的恢复系或所述水稻三系杂交体系中的保持系，具体是通过导入含有所述融合基因片段A或所述融合基因片段B的重组表达载体实现的；
进一步，含有所述融合片段A的所述重组表达载体具体为在植物表达载体PCAMBIA1300的多克隆位点(如Hind III和EcoR I之间)处自上游到下游依次插入ubi启动子、叶绿体导肽、融合 基因片段A、nos终止子后所得的重组质粒；含有所述融合片段B的所述重组表达载体具体为在植物表达载体PCAMBIA1300的多克隆位点(如Hind III和EcoRI之间)处自上游到下游依次插入ubi启动子、叶绿体导肽、融合基因片段B、nos终止子后所得的重组质粒。
其中，所述ubi启动子的核苷酸序列为序列表中序列6所示；所述叶绿体导肽的核苷酸序列为序列表中序列7所示；所述nos终止子的核苷酸序列为序列表中序列8所示。
本发明具有如下优点:本发明采用两个基因片段分别导入三系杂交体系的恢复系和保持系，或两系杂交体系的恢复系和不育系中，这样在杂交时，亲本A和亲本B的花粉虽仍可随风传播，但其花粉中只带有单个基因片段，即使飘流至其它非转基因作物或近缘种，也不会产生有功能的完整目的蛋白。杂种Fl的花粉虽仍可随风传播，但两个基因片段随花粉同时飘流出去的频率很低，使得基因飘流频率可降低到阈值允许范围内，从而达到培育安全转基因杂交种的目的。
图1为重组表达载体基因表达框示意图。其中，A为含有融合基因片段A的重组表达载体pEnln ；B为含有融合基因片段B的重组表达载体pIcEc。A、B中UbiP均表示玉米多聚泛素蛋白基因Ubiqutin启动子；CTS均表示菊花Rubisco小亚基的叶绿体信号肽；NosT均表示胭脂碱合成酶基因Nos的终止子；35SP均表示花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子；hptll均表示潮霉素磷酸转移酶基因，提供潮霉素抗性；PolyA Signal均表示多聚腺苷酸加尾信号；RB均表示T-DNA右边界；LB均表示T-DNA。
图2为不同类型转基因水稻的PCR检测结果。其中，A为转基因水稻中恢8006/pEnln ；B为转基因水稻内香2B/pIcEc。A和B中，泳道M均为TranslOObp DNA分子量标准；泳道1-15 (或16)均为阳性待测转基因水稻。
图3为不同类型转基因水稻的Southern检测结果。其中，B’为转基因水稻内香2B/pIcEc。具体的，I:Ec-l/EcoRI ；2:Ec-l/XhoI ；3:Ec-5/EcoRI ；4:Ec-5/XhoI ；5:Ec_28/EcoRI ；6:Ec-28/XhoI ；7:Ec-8/EcoRI ；8:Ec-8/XhoI ；9:转基因水稻内香 2B/pCAMBIA1300/EcoRI (阴性对照)；10:pIcEc (阳性对照)。D，为转基因水稻中恢8006/pEnIn。具体的，1:En-l/EcoRI ；2:En_l/XhoI ；3:En-6/EcoRI ；4:En_6/XhoI ；5:En-9/EcoRI ；6:En_9/XhoI ；7:En-12/EcoRI ；8:En_12/XhoI ；9:En-34/EcoRI ；10:En_34/XhoI ; 11:转基因水稻中恢8006/pCAMBIA1300/EcoRI (阴性对照)；12:pEnIn (阳性对照)。
图4为T1代转基因杂交种的草甘膦抗性筛选结果。其中左图为T1代转基因杂交种，右图为转基因水稻中恢8006/pEnIn。
图5为T1代转基因杂交种的PCR检测结果。具体的，泳道I为DNA分子量标准Trans5K DNA Marker ;泳道2为T1代转基因杂交种扩增融合基因片段EnIn ;泳道3为中恢8006/pCAMBIA1300扩增融合基因片段EnIn ;泳道4为以水代替模板扩增融合基因片段EnIn ;泳道5为T1代转基因杂交种扩增融合基因片段IeEe ;泳道6为内香2B/pCAMBIA1300扩增融合基因片段;泳道7为水代替模板扩增融合基因片段1忑。。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中未详细说明的操作步骤参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。
植物表达载体pCAMBIA1300:购自澳大利亚CAMBIA公司。
植物表达载体pBI121:上海希匹吉生物技术有限公司，货号CPC087
水稻恢复系中恢8006:记载在“曹立勇，沈希宏，占小登等.杂交水稻新品种国稻6号的选育及栽培技术.粮食作物，2008 (3):55-56”一文，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
水稻不育系内香2A及其保持系内香2B:记载在“任鄄胜，李仕贵，肖培村等.水稻线粒体基因atp6启动子突变导致的一种细胞质雄性不育型.西南农业学报，2009 (22):544-549” 一文，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
玉米品种郑单958:购自北京德农种业有限公司。
Impactvectorl.4 质粒:购自 Wageningen UR (荷兰)。
pMD19-T质粒:购自六合通经贸有限公司(产品目录号:D102A)。
所用培养基配方如下表:
权利要求
1.一种培育转基因杂交水稻的方法，包括如下步骤: (1)将目的基因分成5’端序列和3’端序列两部分；在所述目的基因的5’端序列的3’末端直接连接内含肽的N端剪接区的核苷酸序列，形成融合基因片段A ;在所述目的基因的3’端序列的5’末端直接连接内含肽的C端剪接区的核苷酸序列，形成融合基因片段B ; (2)为如下I)或II):1)为如下al) -a5): al)将所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者中的一个导入水稻三系杂交体系中的恢复系，得到转基因水稻恢复系；另一个导入所述水稻三系杂交体系中的保持系，得到转基因水稻保持系； a2)通过确定所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻保持系基因组中的拷贝数及在染色体上的插入位点，得到满足如下条件的所述转基因水稻恢复系和所述转基因水稻保持系，分别记作转基因水稻恢复系-1和转基因水稻保持系-1: 所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻保持系基因组中均以单拷贝的形式插入，并且所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻保持系基因组中所位于的染色体编号相同； a3)筛选获得转基因水稻恢复系-1纯合系和转基因水稻保持系-1纯合系；a4)将步骤a3)所得的转基因水稻保持系-1纯合系与所述水稻三系杂交体系中的不育系杂交，获得含有所述融合基因片段A或所述融合基因片段B的转基因水稻不育系； a5)将步骤a3)所得的转基因水稻恢复系-1纯合系与步骤a4)所得的转基因水稻不育系杂交，获得同时含有所述融合基因片段A和所述融合基因片段B的转基因杂交水稻； II)为如下bl) -b4): bl)将所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者中的一个导入水稻两系杂交体系中的恢复系，得到转基因水稻恢复系；另一个导入所述水稻两系杂交体系中的不育系，得到转基因水稻不育系； b2)通过确定所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻不育系基因组中的拷贝数及在染色体上的插入位点，得到满足如下条件的所述转基因水稻恢复系 和所述转基因水稻不育系，分别记作转基因水稻恢复系-1和转基因水稻不育系-1: 所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻不育系基因组中均以单拷贝的形式插入，并且所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻不育系基因组中所位于的染色体编号相同； b3)筛选获得转基因水稻恢复系-1纯合系和转基因水稻不育系-1纯合系；b4)将步骤a3)所得的转基因水稻恢复系-1纯合系与转基因水稻不育系-1纯合系杂交，获得同时含有所述融合基因片段A和所述融合基因片段B的转基因杂交水稻。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述内含肽为来自于集胞藻6803的DnaE内含肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述DnaE内含肽的氨基酸序列为序列表中序列I。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述DnaE内含肽的所述N端剪接区的氨基酸序列为序列I ;所述DnaE内含肽的所述C端剪接区的氨基酸序列为序列2。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述DnaE内含肽的所述N端剪接区的核苷酸序列为序列3 ;所述DnaE内含肽的所述C端剪接区的核苷酸序列为序列4。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述目的基因为具有草甘膦抗性的G2-aroA基因；所述G2_aroA基因的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述G2-aroA基因的所述5’端序列为序列5的第1-885位；所述G2-aroA基因的所述3’端序列为序列5的第886-1335位。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述水稻三系杂交体系中的恢复系为水稻品种中恢8006 ;所述水稻二系杂交体系中的保持系为水稻品种内香2B ;所述水稻三系杂交体系中的不育系为水稻品种内香2A。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于:所述方法中，步骤al)或bl)中，将所述融合基因片段A或所述融合基因片段B导入所述水稻三系杂交体系中的恢复系或所述水稻三系杂交体系中的保持系，是通过导入含有所述融合基因片段A或所述融合基因片段B的重组表达载体实现的。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于:所述方法中，含有所述融合片段A的所述重组表达载体为在植 物表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点处自上游到下游依次插入ubi启动子、叶绿体导肽、所述融合基因片段A、nos终止子后得到的重组质粒；含有所述融合片段B的所述重组表达载体为在植物表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点处自上游到下游依次插入ubi启动子、叶绿体导肽、所述融合基因片段B、nos终止子后得到的重组质粒。
全文摘要
本发明公开了一种培育转基因杂交水稻的方法。该方法包括如下步骤将目的基因拆成5’端和3’端两部分，分别与Intein的N端和C端剪接区的序列连接，形成融合基因A和融合基因B，将两融合基因分别导入三系杂交体系的保持系和恢复系，或者两系杂交体系的不育系和恢复系，杂交后获得杂交种，所得杂交种同时含两个基因片段，在intein介导的蛋白剪接下，两无活性的蛋白片段重新组装成完整有活性的目标蛋白，赋予杂交种目标性状。这样两亲本中虽含有部分基因片段，但不具功能，不会产生转基因飘流引起的环境安全问题，杂交种的花粉虽能扩散出去，但同时含两个基因片段的概率大大降低，很大程度上降低了转基因飘流频率，且还能避免自留种，更好的保护知识产权。
文档编号C12N15/82GK103160529SQ20131008520
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者王旭静, 王志兴, 贾士荣, 靳茜, 唐巧玲 申请人:中国农业科学院生物技术研究所