专利名称：用于抗肿瘤的siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种SiRNA及其应用，特别是涉及一种用于抗肿瘤的siRNA及其应用。
背景技术：
粘附斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是一类胞质非受体蛋白酪氨酸激酶，它在细胞信号转导中处于十分重要的位置，介导多条信号通路，可以调节细胞生长、并与胚胎发育、肿瘤发生与迁移有关。肿瘤细胞的侵袭性生长是一个多步骤的复杂过程，有多种生物化学因子参与其中。肿瘤细胞必须黏附于细胞外基质，通过促进依赖于PTK激酶活性的细胞外基质信号转导，进而影响细胞的黏附、运动与迁移。其中，FAK介导的信号转导系统是其中重要的细胞信号转导途径之一。RNA干扰(RNAi )是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA (dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。因而，利用RNA干扰技术，并结合FAK的功能，为肿瘤的治疗提供良好的指导意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于抗肿瘤的siRNA及其应用。通过利用RNA干扰技术，能有效抑制FAK基因的表达，因而，能更加有效地进行肿瘤治疗。为解决上述技术问题，本发明的用于抗肿瘤的siRNA (针对FAK基因)，包括选自下列核苷酸序列中的一种:
I)如 SEQ ID N0.7-8 所示的 RNA 序列；2)如 SEQ ID N0.9-10 所示的 RNA 序列；3)如 SEQ ID N0.11-12 所示的 RNA 序列；4)如 SEQ ID N0.15-16 所示的 RNA 序列；5)如 SEQ ID N0.17-18 所示的 RNA 序列；6)如 SEQ ID N0.19-20 所示的 RNA 序列；7)如 SEQ ID N0.21-22 所示的 RNA 序列；8)如 SEQ ID N0.23-24 所示的 RNA 序列；9)如 SEQ ID N0.25-26 所示的 RNA 序列；10)如 SEQ ID N0.27-28 所示的 RNA 序列；11)如 SEQ ID N0.29-30 所示的 RNA 序列；12)如 SEQ ID N0.31-32 所示的 RNA 序列；13)如 SEQ ID N0.33-34 所示的 RNA 序列；14)如 SEQ ID N0.35-36 所示的 RNA 序列；15)如 SEQ ID N0.37-38 所示的 RNA 序列；
16)如 SEQIDN0.39-40 所示的 RNA 序列；17)如 SEQIDN0.41-42 所示的 RNA 序列；18)如 SEQIDN0.43-44 所示的 RNA 序列；19)如 SEQIDN0.45-46 所示的 RNA 序列；20)如 SEQIDN0.47-48 所示的 RNA 序列；21)如 SEQIDN0.49-50 所示的 RNA 序列；22)如 SEQIDN0.51-52 所示的 RNA 序列；23)如 SEQIDN0.53-54 所示的 RNA 序列；24)如 SEQIDN0.55-56 所示的 RNA 序列；25)如 SEQIDN0.57-58 所示的 RNA 序列；26)如 SEQIDN0.59-60 所示的 RNA 序列；27)如 SEQIDN0.61-62 所示的 RNA 序列；28)如 SEQIDN0.63-64 所示的 RNA 序列；29)如 SEQIDN0.65-66 所示的 RNA 序列；30)如 SEQID`N0.67-68 所示的 RNA 序列；31)如 SEQIDN0.69-70 所示的 RNA 序列；32)如 SEQIDN0.71-72 所示的 RNA 序列；33)如 SEQIDN0.73-74 所示的 RNA 序列；34)如 SEQIDN0.75-76 所示的 RNA 序列；35)如 SEQIDN0.77-78 所示的 RNA 序列；36)如 SEQIDN0.79-80 所示的 RNA 序列；37)如 SEQIDN0.81-82 所示的 RNA 序列；38)如 SEQIDN0.83-84 所示的 RNA 序列；39)如 SEQIDN0.85-86 所示的 RNA 序列；40)如 SEQIDN0.87-88 所示的 RNA 序列；41)如 SEQIDN0.89-90 所示的 RNA 序列；42)如 SEQIDN0.91-92 所示的 RNA 序列；43)如 SEQIDN0.93-94 所示的 RNA 序列；44)如 SEQIDN0.95-96 所示的 RNA 序列；45)如 SEQIDN0.97-98 所示的 RNA 序列；46)如 SEQIDN0.99-100 所示的 RNA 序列；47)如 SEQIDN0.101-102 所示的 RNA 序列；48)如 SEQIDN0.103-104 所示的 RNA 序列；49)如 SEQIDN0.105-106 所示的 RNA 序列；50)如 SEQIDN0.107-108 所示的 RNA 序列；51)如 SEQIDN0.109-110 所示的 RNA 序列；52)如 SEQIDN0.111-112 所示的 RNA 序列；53)如 SEQIDN0.113-114 所示的 RNA 序列；54)如 SEQIDN0.115-116 所示的 RNA 序列；
55)如 SEQ ID N0.117-118 所示的 RNA 序列；56)如 SEQ ID N0.119-120 所示的 RNA 序列；57)如 SEQ ID N0.121-122 所示的 RNA 序列；58)如 SEQ ID N0.123-124 所示的 RNA 序列；59)如 SEQ ID N0.125-126 所示的 RNA 序列；60)与 SEQ ID N0.7-12 或 SEQ ID N0.15-126 限定的 RNA 序列具有 90% 以上同源性,且具有相同功能的RNA序列。其中，所述siRNA优选为如SEQ ID N0.7_8、9_10或11-12所示的RNA序列。另外，本发明还公开一种编码如上所述用于抗肿瘤的siRNA的DNA序列。本发明还公开了一种表达载体，该表达载体包含有如上所述用于抗肿瘤的siRNA序列。本发明又公开了一种宿主细胞，所述宿主细胞是一种可表达如上所述用于抗肿瘤的siRNA序列的细胞，如可包含有如上所述的表达载体。本发明的用于抗肿瘤的siRNA在制备抗肿瘤药物或在制备抗肿瘤药物组合物中的应用。所述肿瘤包括:肝癌。本发明又公开了一种抗肿瘤药物，含有有效量的如上所述用于抗肿瘤的siRNA和药学上可接受的载体。
该抗肿瘤药物可以采用常规方法制备成相应制剂，如可被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。针剂、溶液等宜在无菌条件下制造。该抗肿瘤药物可以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、鼻内等给药途径。本发明抗肿瘤药物的用量和疗程可根据剂型、患者的年龄、疾病的轻重程度作适当调整，即具体施用剂量取决于多种因素，如给药方式、用药者健康状况等因素，这些都是在熟练医师技能范围内。再者，本发明还公开了一种药盒，含有如上所述用于抗肿瘤的SiRNA或含有上所述的抗肿瘤药物。该药盒可根据制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。本发明实验证明FAK基因在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，因此，FAK基因可作为诊断肝癌的特异标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速。同时，本发明的用于抗肿瘤的siRNA能抑制人FAK基因表达，减少肝癌细胞侵袭，因此，本发明的siRNA可应用于在制备抗肿瘤的药物中，如应用于制备抑制肝癌的药物中，为治疗或防治肿瘤(如肝癌)新药的开发提供新的途径。
下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明:图1是RT-PCR验证FAK基因在10例肝癌病人癌组织和癌旁组织中的表达情况示意图，其中，“N”指癌旁组织，“C”指肝癌组织；图2是荧光定量PCR检测FAK基因在95例肝癌病人中的表达情况图3是Panomics分析FAK基因在146例肝癌病人中的表达情况图；图4是siRNA转染SMMC7721细胞后的FAK表达图；图5是siRNA转染WRL68细胞后的FAK表达图；图6是siRNA转染QGY7701细胞后的FAK表达图；图7是siRNA转染SMMC7721细胞后的相对荧光值图；图8是siRNA转染WRL68细胞后的相对荧光值图；图9是siRNA转染QGY7701细胞后的相对荧光值图；图10是siRNA转染SMMC7721后的细胞划痕
图11是siRNA转染SMMC7721和SK-1tepl后的细胞侵袭图。
具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例1FAK基因在肝癌组织中的表达1、组织分离实验用组织来源于原发性肝癌的手术病人。手术切除的肝脏一经离体，迅速切取病灶及周围5公分外癌旁组织，立即分装在冻存管内，放入液氮中(_80°C)保存。癌和癌旁的诊断均以病理诊断为最终依据。2、总 RNA 提取采用Trizol (Invitrogen公司)试剂,按照其说明书进行组织的总RNA提取。具体步骤如下:I) Homogenize勻衆:组织勻衆:每IOOmg组织加入Iml TRIzol试剂，并用勻衆器匀浆。2)加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀Imin左右，室温静置5min。3) 4°C，12，OOOrpm 离心 15min。4)小心取出上清液，避免触及中间层，将上清夜转入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5min。5) 4°C, 12000rpm 离心 15min。6)吸去上清,保留沉淀，并向沉淀中加入lml75%乙醇,4°C、12000rpm离心15min
洗涤沉淀。7)吸去上清，沉淀室温自然晾干后加入适量RNase-free的水，用Tip头吹吸，充分溶解沉淀。8)取 l-2iiL，测定 RNA 浓度以及 A260/A280 值。一般 A260/A280 比值在 1.8-2.1。RNA存放在_80°C冰箱待用。3、逆转录合成cDNA用PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time(TAKARA 公司)逆转录 cDNA,反应体系(总量为10 ii I)如表I所示。
表I反应体系
权利要求
1.一种用于抗肿瘤的siRNA,其特征在于,包括选自下列核苷酸序列中的一种:1)如SEQID N0.7-8所示的RNA序列；2)如SEQID N0.9-10所示的RNA序列；3)如SEQ ID N0.11-12 所示的 RNA 序列；4)如SEQ ID N0.15-16 所示的 RNA 序列；5)如SEQ ID N0.17-18 所示的 RNA 序列；6)如SEQ ID N0.19-20 所示的 RNA 序列；7)如SEQ ID N0.21-22 所示的 RNA 序列；8)如SEQ ID N0.23-24 所示的 RNA 序列；9)如SEQ ID N0.25-26 所示的 RNA 序列；10)如SEQ ID N0.27-28 所示的 RNA 序列；11)如SEQ ID N0.29-30 所示的 RNA 序列；12)如SEQ ID N0.31-32 所示的 RNA 序列；13)如SEQ ID N0.33-34 所示的 RNA 序列；14)如SEQ ID N0.35-36 所示的 RNA 序列；15)如SEQ ID N0.37-38 所示的 RNA 序列；16)如SEQ ID N0.39-40 所示的 RNA 序列；17)如SEQ ID N0.41-42 所示的 RNA 序列；18)如SEQ ID N0.43-44 所示的 RNA 序列；19)如SEQ ID N0.45-46 所示的 RNA 序列；20)如SEQ ID N0.47-48 所示的 RNA 序列；21)如SEQ ID N0.49-50 所示的 RNA 序列；22)如SEQ ID N0.51-52 所示的 RNA 序列；23)如SEQ ID N0.53-54 所示的 RNA 序列；24)如SEQ ID N0.55-56 所示的 RNA 序列；25)如SEQ ID N0.57-58 所示的 RNA 序列；26)如SEQ ID N0.59-60 所示的 RNA 序列；27)如SEQ ID N0.61-62 所示的 RNA 序列；28)如SEQ ID N0.63-64 所示的 RNA 序列；29)如SEQ ID N0.65-66 所示的 RNA 序列；30)如SEQ ID N0.67-68 所示的 RNA 序列；31)如SEQ ID N0.69-70 所示的 RNA 序列；32)如SEQ ID N0.71-72 所示的 RNA 序列；33)如SEQ ID N0.73-74 所示的 RNA 序列；34)如SEQ ID N0.75-76 所示的 RNA 序列；35)如SEQ ID N0.77-78 所示的 RNA 序列；36)如SEQ ID N0. 79-80 所示的 RNA 序列；37)如SEQ ID N0.81-82 所示的 RNA 序列；38)如SEQ ID N0.83-84 所示的 RNA 序列；39)如SEQ ID N0.85-86 所示的 RNA 序列； 40)如SEQ ID N0.87-88 所示的 RNA 序列； 41)如SEQ ID N0.89-90 所示的 RNA 序列； 42)如SEQ ID N0.91-92 所示的 RNA 序列； 43)如SEQ ID N0.93-94 所示的 RNA 序列； 44)如SEQ ID N0.95-96 所示的 RNA 序列； 45)如SEQ ID N0.97-98 所示的 RNA 序列； 46)如SEQ ID N0.99-100 所示的 RNA 序列； 47)如SEQ I D N0.101-102 所示的 RNA 序列； 48)如SEQ ID N0.103-104 所示的 RNA 序列； 49)如SEQ ID N0.105-106 所示的 RNA 序列； 50)如SEQ ID N0.107-108 所示的 RNA 序列； 51)如SEQ ID N0.109-110 所示的 RNA 序列； 52)如SEQ ID N0.111-112 所示的 RNA 序列； 53)如SEQ ID N0.113-114 所示的 RNA 序列； 54)如SEQ ID N0.115-116 所示的 RNA 序列； 55)如SEQ ID N0.117-118 所示的 RNA 序列； 56)如SEQ ID N0.119-120 所示的 RNA 序列； 57)如SEQ ID N0.121-122 所示的 RNA 序列； 58)如SEQ ID N0.123-124 所示的 RNA 序列； 59)如SEQ ID N0.125-126 所示的 RNA 序列； 60)与SEQID N0.7-12或SEQ ID N0.15-126限定的RNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的RNA序列。
2.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于:所述siRNA为如SEQID N0.7_8、9_10或11-12所示的RNA序列。
3.—种编码如权利要求1所述的用于抗肿瘤的siRNA的DNA序列。
4.一种表达载体,其特征在于:所述表达载体包含有如权利要求1所述的用于抗肿瘤的siRNA序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于:所述宿主细胞是一种可表达如权利要求1所述的用于抗肿瘤的siRNA序列的细胞。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于:所述宿主细胞包含有权利要求4所述的表达载体。
7.—种如权利要求1所述的用于抗肿瘤的siRNA在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤药物组合物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于:所述肿瘤包括:肝癌。
9.一种抗肿瘤药物，其特征在于:含有有效量的如权利要求1所述的用于抗肿瘤的siRNA和药学上可接受的载体。
10.一种药盒，其特征在于:含有如权利要求1所述的用于抗肿瘤的siRNA或含有如权利要求9所述的抗肿瘤药物。
全文摘要
本发明公开了一种用于抗肿瘤的siRNA及其应用，该siRNA包括选自下列核苷酸序列中的一种如SEQ ID NO.7-12或SEQ ID NO.15-126所示的RNA序列，与SEQ ID NO.7-12或SEQ ID NO.15-126限定的RNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的RNA序列。本发明的siRNA能抑制人FAK基因表达，可应用于在制备抗肿瘤的药物中，为治疗或防治肿瘤(如肝癌)新药的开发提供新的途径。
文档编号C12N15/113GK103184223SQ20131008439
公开日2013年7月3日 申请日期2013年3月15日 优先权日2013年3月15日
发明者黄健, 刘星 申请人:黄健, 刘星