专利名称：一株腐皮镰刀菌菌株及发酵生产大黄酸的方法
技术领域：
本发明属于药用微生物技术领域，具体涉及到从药用植物掌叶大黄中分离出的一株内生真菌腐皮镰刀菌R13 (Fusarium solani R13),该菌株通过液体发酵能产生大黄酸和大黄素，可用于大量生产大黄酸或其类似物。
背景技术：
大黄是寥科大黄属植物掌叶大黄(Rheum palmatum L.)、唐古特大黄(Rheumtanguticum Maxim, ex Balf.)或药用大黄(Rheum officinale Bai 11)的干燥根及根莖，又名将军，具泻热通便、凉血解毒、逐瘀通经的功效，是临床最常用的药物之一。它的活性成分大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等具有具抗菌、抗肿瘤、抗病毒、保肝、强心、延缓衰老、调节免疫功能等作用。随着大黄中有效成分的分离纯化以及色谱技术的广泛应用，从上世纪80年代开始大黄中单体的研究。例如大黄酸(Rhein, 4，5-dihydroxyanthraquinone)属单蒽核类1，8-二羟基蒽醌衍生物，是掌叶大黄、虎仗等多种传统中药的主要有效成分之一。近年来发现大黄酸具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、保肝抗纤维化、抗突变、抗多药耐药和联合用药、改变肾脏基因表达谱、改善细胞代谢、调脂作用等药理学作用。大黄素具有诸多抗炎、抗病毒、抑菌、免疫调节、保护肝肾、促进胃肠蠕动、抗氧化、清除自由基、改善微循环等药理学作用。大黄已广泛应用于临床，如用于黄疸、急性胰腺炎等的治疗，大黄酸的1,8-二乙酰化物(Diacerein)已用于治疗骨关节炎，其有效物质形式应为大黄酸。大黄酸已经从传统的泻药成分转变成为一种具有广泛生理作用的新型药物单体。经过结构修饰制备大黄酸偶联物以及衍生物，可改善大黄酸溶解性。利用大黄酸的骨趋向性作为药物骨靶向制剂载体，研制高 效低毒的新型抗肿瘤药也日益成为关注的重点。随着大黄酸药物单体需求研究，单体大黄酸生产愈发重要。内生真菌(Endophytic fungus)是指生活在健康植物组织内部,但不引起植物病害的真菌，在植物组织中普遍存在。内生真菌与宿主在长期的生态系统演化中形成了互惠共生关系，可产生与宿主相同或不同的具有生物活性的次生代谢产物。1993年，Strobel从短叶红豆杉中分离到一株能够产生紫杉醇的内生真菌(Taxomyces andreanae),这为抗肿瘤药物的研究增添了新的途径。一系列的科学研究表明，植物内生真菌既能够产生与宿主植物相同或相似的有效活性物质，也能够产生其他有活性的天然产物。内生真菌的天然产物种类十分丰富，几乎涵盖了所有的天然产物的类型，因此内生真菌为天然产物的发现提供了广泛的资源。
发明内容
本发明涉及一种从掌叶大黄(Rheum Palmatum L.)中分离出的一株产大黄酸的内生真菌。该内生真菌经形态学和rDNA ITS序列分析鉴定是腐皮镰刀菌属(Fusariumsolani)，是一种丝状真菌。可用于大量生产大黄酸或其类似物。
本发明的技术方案。本发明采用严格的表面灭菌方法，从植物掌叶大黄活体植物中分离得到植物内生真菌R13,经rDNA ITS序列分析，即核糖rDNA内部转录间隔区(Ribosomal DNA InternalTranscribed Spacer)序列分析技术,结合微生物学形态学鉴定证明该菌株属于腐皮镰刀菌属(Fusarium solani)。该菌株已于2013年I月9日送交保藏湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC N0:M2013009o本发明所述的腐皮镰刀菌R13菌株的分离及筛选流程。首先，从中国四川省若尔盖草原采集掌叶大黄活体植株，选择健康完好的植物进行表面清洗和消毒，在无菌的环境下，对根、茎、叶和花进行切段，接着放入马铃薯葡萄糖培养基(PDA)培养皿中，于培养箱中培养，观察菌落生长情况，一般5-10天可看到切段周围有丝状真菌长出；对长出的真菌进行分离纯化后保种并进行液体发酵培养，提取菌丝体中的蒽醌，以标准品大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素对照，进行高效液相色谱(HPLC)检测，根据色谱图筛选产大黄酸的菌株；对初筛菌株进行高效液相色谱质谱连用(LC-MS)分析，进一步的确定产大黄酸的能力，对分析后确定产大黄酸的菌株进行系统分类学研究，包括形态学和分子生物学水平鉴定。菌株分类学地位的鉴定。1.固体培养特征。采用PDA培养基(土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，加水定容1L，PH自然)培养腐皮镰刀菌Rl3菌株。菌落形态:28°C培养3 4天，菌落直径达30mm，7天时基本长满培养皿，菌落为圆形，前期为白色，后期为紫红色；菌落中间紫红色 ，绒毛状，菌落边缘相对整齐，白色，中间颜色较深，边缘较浅，随着培养时间的增长，整个平板培养基都呈红色。菌丝形态:菌丝分枝，有隔，菌丝宽度2-3 μ m。产孢特征:小型分生孢子多为单细胞，少数为1-2个分隔，有卵形、肾形等。大型分生孢子散生于菌丝上，大多数有3个分隔且分隔明显，形状为镰刀形，顶端形状渐尖。2.rDNA ITS 序列分析。2.1提取菌丝体总DNA。2.2 以 ITSl(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’ -TCCTCCGCTTATTGATAGC-3’ )为引物，扩增出rDNA ITS序列，经过测序，得到核苷酸序列SQE ID NOl0该序列包含了其两端的18S rDNA、28S rDNA的部分序列和中间ITSl区、5.8S r DNA、ITS2区的完整序列。2.3 将测序结果递交 http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast 进行序列比对，最后根据BLAST结果和形态学特征得出该分离的内生真菌属于腐皮镰刀菌属(Fusariumsolani)。2.4腐皮镰刀菌R13中大黄酸产量确定。2.4.1腐皮镰刀菌R13接种至改良的察氏培养基中，液体发酵培养10d，每天收集发酵液并提取发酵液，采用高效液相(HPLC)定量分析提取液，结果表明，液体发酵72小时后开始产大黄酸，经过192小时发酵后,发酵液中大黄酸产量达到最大值5.672mg/L0本发明效果。
1.本发明为大黄酸和大黄素的开发提供了一株新的微生物菌株。2.本发明所述对象属于微生物，可以通过发酵的方式获得化合物，微生物生长繁殖迅速，不受气候与地域的限制，产量提升空间较大。3.本发明能够避免对植物掌叶大黄野生植物的过度开发，达到环境和生态的保护。
序列表1:本发明分离得到的腐皮镰刀菌R13的rDNA ITS基因序列。图1:分离得到的掌叶大黄内生真菌腐皮镰刀菌R13菌落形态图。图2:腐皮镰刀菌R13发酵提取液和大黄酸标准品HPLC图谱。图3:大黄素标品和大黄酸标品的HPLC-MS质谱图。图4:腐皮镰刀菌R13代谢物的HPLC-MS质谱图。图5:腐皮镰刀菌R13聚类分析图。图6:腐皮镰刀菌R13菌丝细胞、镰刀孢子显微照片。图7:腐皮镰刀菌R13中大黄酸产量图。
生物材料样品保藏信息。保藏日期:2013年I月9日。保藏编号:CCTCCN0:M2013009o分类命名:腐皮镰刀菌R13 (Fusarium solani R13)。保减单位名称:中国典型培养物保减中心。保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学 具体实施方式
。下文将通过实施例对本发明做进一步说明，但实施例不以任何方式限制本发明。实施例1。大黄内生真菌的初步筛选。1.1从中国四川省若尔盖草原采集健康的掌叶大黄野生植株。1.2挑选健康的植株自来水冲洗10分钟，无菌水浸泡10分钟，除去表面污垢。1.3进行表面消毒，步骤如下。1.3.1分别从根、茎、叶三个部位截取长为2.0cm小段，先后用体积分数75%乙醇灭
菌30S，无菌水浸泡。1.3.25%次氯酸钠溶液5min、2.5min> Imin (消毒时间根据材料大小可微调),无菌水漂洗3次，每次3min。1.3.3无菌脱脂棉浙干植株上的液体，然后将材料切小块转入PDA培养皿中，每皿4 5块材料，并将最后一次漂洗的无菌水涂布于PDA培养基，作为对照，用以检验表面灭菌是否彻底。1.3.4将培养皿放置培养箱中，25°C避光培养7 15天，对长出的真菌进行分离纯化，然后转入大试管中4°C保藏。1.3.5将纯化后的菌株用改良的察氏培养基进行液体发酵培养，25°C、200r/min摇床培养10天，收集发酵液和菌丝体。改良的察氏培养基:蛋白胨10g，蔗糖30g，磷酸氢二钾lg，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.0lgo实施例2。腐皮镰刀菌R13的验证。2.1制备种子培养液:将腐皮镰刀菌R13接种于含有IOOml改良的察氏培养基的锥形瓶中，于25 °C、200r/min摇床培养24h。2.2扩大培养:将腐皮镰刀菌R13种子液以5% (体积比)接种量接种于扩大培养液中，于 25°C、200r/min，培养 10h。2.3收集发酵液和菌丝体:将步骤2.2的培养物过滤，分别收集发酵液和菌丝体，菌丝体用无菌蒸馏水冲洗3次，60°C烘干至恒重，用75%酒精浸提24小时，然后将浸提液与发酵液合并。2.4利用中华人民共和国药典当中大黄浸膏的提取方法，提取3步骤中的游离蒽醌。具体提取步骤。2.4.1每IOOml发酵液中加入2.5mol/L硫酸溶液10ml，超声处理3分钟，然后沸水加热回流30分钟。2.4.2加热回流完成后，立即冷却，加入乙醚提取，提取3次，合并提取液，旋转蒸发掉乙醚，加甲醇溶解，即得粗提液。2.5用高效液相色谱(HPLC)`分析检测粗提液，标品:大黄酸，大黄素，大黄素甲醚，大黄酚，芦荟大黄素。色谱条件:甲醇:0.1%磷酸(80:20，V/V)为流动相。流速lmL/min，检测波长 245nm,柱温 30°C,色谱柱(75mmX4.6mm, 3.5 μ m)。2.6对步骤2.5所得的数据进行分析(见图2)，大黄酸标品出现吸收峰的保留时间是2.959min，腐皮镰刀菌R13发酵液提取物在保留时间2.953min时也出现一个明显的吸收峰，由此推断从掌叶大黄植株分离得到的一株内生真菌产大黄酸类似物。2.7用高效液相质谱联用(HPLC-MS)检测粗提液，并以大黄酸和大黄素标准品作对照。技术条件如下:Thermo Scientific液质联用(LC-MS)色谱仪。电喷雾离子源，毛细管电压3.5kV，脱溶温度270°C，采用选择离子监测(SIM)模式定性检测。大黄酸和大黄素定性离子范围分别为 m/z282.950-283.050 和 m/z268.960-269.050。Thermo Hypersil GoldC18色谱柱(150mmX2.1mm，5.0 μ m)，流动相为甲醇:0.1%乙酸铵(2mM)，比例为90:10。流速为0.2mL/min。分别对掌叶大黄的游离蒽醌和R13中游离蒽醌进行分析。2.8将标准品和提取物经过HPLC-MS检测和分析，大黄酸标品产生一个m/z为282.99的[Μ-ΗΓ离子峰，发酵液提取物也产生一个m/z为282.99的[Μ_Η]_离子峰，与大黄酸标品一致，确定腐皮镰刀菌R13产大黄酸。通过质谱分析，检测到发酵液中还含有另外一种游离蒽醌大黄素，产生一个m/z为268.91的[M_H]_离子峰，大黄素标准品的m/z为269.01，质谱图基本一致，确定腐皮镰刀菌R13产大黄素见图3、图4。实施例3。腐皮镰刀菌R13分子生物学特征和形态学鉴定。采用CTAB方法提取腐皮镰刀菌R13总DNA，总DNA的PCR扩增及其扩增体系与反应条件:ITSl:5' -TC CGTAGGTGAACCTGCGG-3' ；ITS4:5/ -TCCTCCG CTTATTGATATGC-3'。50 μ L PCR反应体系:25μ L C2 X Taq PCR Master Mix、lyL基因组DNA、引物 ITSl 和引物ITS4各2μ L、25y L灭菌超纯水。PCR扩增程序:95°C 3min, 94°C 30s, 55V lmin, 72。。80s, 35个循环；72°C IOmin0将PCR产物纯化后进行序列测定。将测序结果递交至http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast。进行比对,再利用MEGA4.0对所克隆的片段进行聚类分析(见图5)，结果菌株形态学特征(见图6)，该菌被鉴定为腐皮镰刀菌属(Fusarium solani)。实施例4。腐皮镰刀菌R13产大黄酸的定量分析。高效液相(HPLC)定量分析:HPLC检测标品大黄酸，甲醇定容，配制成0.4-160 μ g/mL的梯度，绘制标准曲线。色谱条件:甲醇-0.1%磷酸(80:20, V/V)为流动相。流速ImL/min，检测波长245nm，柱温30°C，C18色谱柱(75mmX 4.6mm, 3.5 μ m)。精密称取大黄酸标品
2.5mg，定容至25mL ，得母液浓度为0.lg/L。将母液浓度依次稀释成浓度梯度为0.4、4、40、80、100、160μ g/mL，吸取10 μ L进样，建立标准曲线。大黄酸产量分析:先将菌种接种到改良察氏培养基，进行种子培养，25°C，200r/min，摇瓶培养2d ;将种子发酵液接种于液体改良察氏培养基中，接种量5%，25 °C，200r/min,摇瓶培养10d，按照步骤2.4提取每天的发酵液，最后用高效液相定量，得大黄酸的产量，见图7。本发明分离的腐皮镰刀菌R13，为大量生产大黄酸和大黄素提供了新的来源。本发明实施可以采用常规的发酵方法进行生产。
权利要求
1.一株从寥科大黄属掌叶大黄活体中分离得到的内生真菌，其特征在于该菌株是腐皮镰刀菌R13 {Fusarium solani R13)，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为=CCTCCNO: M 2013009。
2.根据权利要求I所述的腐皮镰刀菌，其特征在于其18SrDNA ITS序列为SQE ID NO1。
3.根据权利要求I所述的腐皮镰刀菌，其特征在于其液体发酵能合成大黄酸。
4.根据权利要求I所述的腐皮镰刀菌，其特征在于用改良查氏培养基发酵72小时后，开始产生大黄酸且分泌于发酵液中。
全文摘要
本发明提供的大黄酸高产菌株腐皮镰刀菌R13(FusariumsolaniR13)，其保藏号是CCTCC NO:M 2013009，保藏单位是中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期是2011年1月9日。该菌株是从蓼科大黄属掌叶大黄活体中分离筛选得到的内生真菌，该菌株经液体发酵后能产生与其宿主掌叶大黄相同或相似的物质大黄酸和大黄素，该类大黄酸、大黄素以游离态存在发酵上清液中。本发明还提供了发酵生产大黄酸的方法，通过液态发酵在25-28℃代谢产生大黄酸产率可达到5mg/L以上。
文档编号C12R1/77GK103255063SQ20131008411
公开日2013年8月21日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者张 杰, 游霞, 冯甦, 于志伟, 赵建, 侯若彤 申请人:四川大学