专利名称：一种工厂化培养发菜细胞的方法
技术领域：
本发明涉及工厂化培养领域，尤其涉及一种工厂化培养发菜细胞的方法。
背景技术：
发菜，为发状念珠蓝细菌的俗称，又名发状念珠藻，是一种名贵陆生性食用蓝藻，因营养丰富、还具有一定的药用价值、且发音与“发财” 二字接近而受到广大消费者，尤其是闽、粤、港澳台及东南亚地区消费者的青睐。国际市场上，发菜供应主要来自蒙古，但加工出售产品的只有日本，其原料为从蒙古进口野生发菜，受原料供应影响，产量不大。长期以来发菜作为一种名贵食品受到消费者的喜爱，但发菜生长极为缓慢，自然蕴藏量相当有限，对发菜无节制的采收已导致发菜资源遭受严重破坏，以致濒临枯竭。2000年7月起国务院于禁止发菜的采收、加工和销售，发菜被列为国家一级重点保护植物，以发菜为原料的生产因此而无法进行，因此急需开展发菜的人工规模化培养。目前已经实现发菜细胞实验室小规模人工培养，但尚未见有人工大规模培养发菜细胞的装置及方法的报道。2003年I月22日，中国国家知识产权局公开了名为“一种培养发菜细胞的方法”的发明专利，该专利公开的技术方案将野生发菜经培养液浸泡及匀浆处理，然后经光照培养得发菜细胞，此法成功地将野生发菜由陆生环境下转入液体培养基中，使人工培养发菜细胞成为可能。2006年6月28日，中国国家知识产权局公开了名为“发菜细胞固态培养方法”的发明专利，该专利公开的技术方案将活化的发菜细胞悬液，接种于固态培养基质表层，喷洒一定量事先配制好的培养液，在人工控制或自然条件下培养发菜细胞，并进行干湿节律培养，控制适宜的培养条件，实现完全人工培养或野外扩大培养。该技术突破了传统培养方式，力口快了增值速度。2007年10月31日中国国家知识产权局公开了名为“稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法”的发明专利，该专利公开的技术方案采取混合营养或异养培养模式，添加有机碳源提高了发菜细胞的生长速度，缩短了发菜细胞的培养周期。2010年9月29日，中国国家知识产权局公开了名为“一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法”的发明专利，该专利公开的技术方案步骤为(I)取发菜细胞种子液接种到培养容器中，培养基是改良的BGll培养基，培养8 10天，(2)像上述培养液中加入中浓度为f20g/L的葡萄糖，培养2 8天，收集发菜细胞，取离心上清液提取培养液中的胞外多糖。此发明涉及的方法有效缩短了发菜细胞的培养周期同时提高了胞外多糖的产量。但以上这些技术方案仅限于实验室小规模培养，所用培养容器也仅限于三角瓶及几十升的玻璃罐，至今没有工厂化培养发菜细胞的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述问题，提供一种能适应各种培养环境、能生产出高质量发菜细胞并且能大规模连续生产的一种工厂化培养发菜细胞的方法。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为:一种工厂化培养发菜细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤:
a制作发菜培养装置:培养装置由加样装置、实时监测装置、进气及排气装置和排液装置构成；
b配制培养液:配制发菜培养液，通过配液管将配制好的培养液输送到培养装置内；c培养条件:向培养装置内加入原始发菜细胞种，向培养液通氧、调整培养液环境使培养液达到以下指标，即温度24 28°C、光照320(T40001ux、光暗周期12h:12h、pH值
8.(T9.5 ;通气培养1(Γ15天，期间内通过取样管定期取样检测其吸光值； d采收:当吸光值达到OD75tol为0.6时，进行采收。前述的一种工厂化培养发菜细胞的方法，在步骤b中，培养液的成分及重量比例为:无水 CaCl2 26g、MgSO4.7H20 75g、NaSiO3.9H20 58g、K2HPO4.3H20 67g、NaNO3 1.5kg、微量元素10g、膜过滤纯净水I吨。前述的一种工厂化培养发菜细胞的方法，在步骤c中，通过漩涡式通氧泵实现通氧。前述的一种工厂化培养发菜细胞的方法，在步骤c中，采收时，将350目过滤网平铺在塑料网床上，塑料网床下方放置集液装置；打开排液阀门，将发菜细胞培养液缓缓流入过滤网过滤，每次采收培养装置内1/3`体积的发菜细胞培养液后关闭阀门，同时通过配液管注入相同体积的培养液。前述的一种工厂化培养发菜细胞的方法，待发菜细胞培养液的水分滤干后，用去离子水彻底清洗发菜细胞，冲洗后的发菜细胞用酸度计测PH值，显示中性为合格，将冲洗好后的发菜细胞转入托盘中并放入_20°C冰箱冷冻，待冷冻完全采用真空冷冻干燥机进行干燥。本发明对发菜采取连续培养和连续收获,可使培养液中的发菜保持在生长速度最快的密度条件下，不会因发菜细胞密度过高而抑制其生长速度，或因发菜细胞密度过低而阻碍其生长，适用于发菜细胞的大规模工厂化生产。
图1为单个圆柱形筒的结构 图2为若干圆柱形筒构成的培养单元的结构 其中，1-T型夹；2_排气管；3-PH计；4_温度计；5_氧电极；6_进样管；7-阀门；8-配液分管；9_配液总管；10_三通；11_上盖；12_圆柱形筒体；13-气泡石；14_底盖；15_螺纹；16-阀门；17_取样口 ；18_三通；19_排液总管；20_排液分管；21_止逆阀；22_进气分管；23-进气总管；24_不锈钢架；25_轮子。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。一种工厂化培养发菜细胞的方法，所述培养方法包括定做发菜培养装置、配制培养液、控制培养条件、采收及干燥发菜细胞，其特征在于: (I)定做发菜的培养装置:所述装置包括一个圆柱形筒体12、一个圆形上盖和一个圆形底盖。所述圆柱形筒体12及上、底盖均为透明PC塑料制成。所述圆柱形筒体12的内径为30cm、高150cm。所述圆柱形筒体12的内壁厚度为Icm,上下两端带螺纹处厚度为2cm,圆形上盖的厚度为7cm,圆形底盖的厚度为10cm。主要由加样装置、实时监测装置、进气及排气装置和排液装置四部分组成，还设有位于圆柱形筒体12底部的轮子25、支撑圆柱形筒体12的不锈钢架子24、检测培养液PH值的PH计3、检测培养液温度的温度计4。(2)配制培养液:首先在配液池内配好培养液，通过配液管(包括配液总管9和配液分管8)将配制好的培养液输送到培养装置内，所述培养液的成分及重量比例为:无水CaCl2 26g，MgSO4.7H20 75g，NaSiO3.9H20 58g, K2HPO4.3H20 67g, NaNO3 1.5kg，微量元素IOg,膜过滤纯净水I吨。(3)培养条件:首先向培养装置内加入培养液和原始发菜细胞种，然后开启漩涡式通氧泵通氧，进气装置包括进气分管22和进气总管23、检测氧含量的氧电极5，气体通过进气管输送到气泡石，气体经气泡石形成众多细小的气泡，将培养液与发菜种子搅拌均匀，使发菜种子能循环悬浮于培养液中，以利于光合效率。通过实时监测装置对圆柱形筒体12内的培养环境进行实时监管与调控，保证发菜能在一个恒定的环境中健康生长。最后调整培养液内环境使其达到以下指标:温度24 28°C (优选为24 26°0，光照320(T40001uX或40^50 μ mo I.πΓ2.s—1，光暗周期 12h:12h (即光照 12h，光暗 12h)，pH 值 8.(T9.5 (优选为
9.0 9.5)。(4)采收及干燥:当接种发菜种液及培养液后，控制培养液的温度及PH值，通气培养1(Γ15天，在此时间内通过取样管定期取样检测其吸光值，当吸光值达到OD75tlnm为0.6时，即可进行采收，采收时，将350目的过滤网平铺在塑料网床上，塑料网床下方放置集液装置，将培养液回收处理；打开排液阀门，排液装置设有排液总管19和排液分管20，将发菜细胞液缓缓流入过滤网过滤，每次采收培养装置内1/3体积的发菜培养液，关闭阀门，同时通过进液管注入相同体积的培养液；待水分滤干后，用去离子水彻底清洗发菜细胞，冲洗后的发菜细胞用酸度计测得其PH值，显示中性是为合格，将冲洗好后的发菜细胞转入托盘中放入-20°C冰箱冷冻，待冷冻完全将其采用真空冷冻干燥机进行干燥。本发明的培养方法所用的培养装置(圆柱形筒体12)是全封闭的，可以在厂房内培养，可以在塑料大棚或玻璃温室内培养，也可以在露天条件下培养。一种规模化培养发菜细胞的装置，装置主体包括圆柱形筒体12、圆形上盖11、圆形底盖14，其特征在于:所述的上盖11设有若干孔，圆形上盖11开有五个孔，分别为PH计、温度计、氧电极安装孔、排气管孔、培养液及种液进样管孔，分别与在线实时监测装置、进样管6、排气管2连接；所述的底盖14设有若干孔，分别为进气管孔和排液管孔，分别与进气管(包括进气总管23和进气分管22)和排液管(包括排液总管19和排液分管20)连接。在线实时监测装置包括PH计3、 温度计4和氧电极5，分别用于监测发菜细胞培养液(即发菜细胞种液和培养液组成)的PH值、温度和氧含量。进气管末端安装有气泡石13，气泡石13位于圆柱形筒体12的底部且在圆形底盖14上方。圆柱形筒体12安装于不锈钢架24上，每个不锈钢架24安装若干(4个以上)圆柱形筒体12，若干圆柱形筒体12依次水平排列组合为一个单兀。圆柱形筒体12及上、底盖均为PC塑料制成，此PC塑料具有强度高、耐高温、无毒、透明性好等特点，其还具有优良的抗冲击性和高度的尺寸稳定性。圆柱形筒体12内径为30cm、高150cm,为封闭透明圆柱形筒；圆形上盖11和底盖14及圆柱形筒体12上、下端均具有粗牙普通螺纹，圆形上盖11和底盖14上的螺纹15为突出型，圆柱形筒体12上、下端的螺纹为凹入型，螺纹设置是为方便拆卸，便于对圆柱形筒体12内壁的清洗。所述圆柱形筒体12的内壁厚度为Icm,上、下两端带螺纹处厚度为2cm,圆形上盖的厚度为7cm,圆形底盖的厚度为10cm。排气管2上装有T型夹1，T型夹I随需要开闭。进样管6与圆柱形筒体12连接处加装三通10，一端连接培养液分管，一端连接发菜细胞种液进样口，另一端连接圆柱形筒体12，三通10上装有阀门7。进气管(包括进气总管23和进气分管22)连通圆柱形筒体12的一端安装止逆阀21，防止圆柱形筒体12内的培养液倒流入进气管。进气管内的空气由漩涡式通氧机提供，在漩涡式通氧机与进气管之间加装空气过滤装置。排液管与圆柱形筒体12连接处加装三通18，一端连接排液总管19，一端连接取样口 17，另一端连接圆柱形筒体12，三通19上装有阀门16。本发明所述方法也适用于螺旋藻、小球藻、盐藻等微藻的培养，同时也适用于生物燃料等新能源产业。上述实施例 不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围。
权利要求
1.一种工厂化培养发菜细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤: a制作发菜培养装置:培养装置由加样装置、实时监测装置、进气及排气装置和排液装置构成； b配制培养液:配制发菜培养液，通过配液管将配制好的培养液输送到培养装置内； c培养条件:向培养装置内加入原始发菜细胞种，向培养液通氧、调整培养液环境使培养液达到以下指标，即温度24 28°C、光照320(T40001ux、光暗周期12h:12h、pH值8.(T9.5 ;通气培养1(Γ15天，期间内通过取样管定期取样检测其吸光值； d采收:当吸光值达到OD75tol为0.6时，进行采收。
2.根据权利要求1所述的一种工厂化培养发菜细胞的方法，其特征在于: 在步骤b中，培养液的成分及重量比例为:无水CaCl2 26g、MgSO4.7H20 75g、NaSiO3.9H20 58g、K2HPO4.3H20 67g、NaNO3 1.5kg、微量元素 10g、膜过滤纯净水 I 吨。
3.根据权利要求2所述的一种工厂化培养发菜细胞的方法，其特征在于:在步骤c中，通过漩涡式通氧泵实现通氧。
4.根据权利要求2或3所述的一种工厂化培养发菜细胞的方法，其特征在于:在步骤c中，采收时，将350目过滤网平铺在塑料网床上，塑料网床下方放置集液装置；打开排液阀门，将发菜细胞培养液缓缓流入过滤网过滤，每次采收培养装置内1/3体积的发菜细胞培养液后关闭阀门，同时通过配液管注入相同体积的培养液。
5.根据权利 要求4所述的一种工厂化培养发菜细胞的方法，其特征在于:待发菜细胞培养液的水分滤干后，用去离子水彻底清洗发菜细胞，冲洗后的发菜细胞用酸度计测PH值，显示中性为合格，将冲洗好后的发菜细胞转入托盘中并放入-20°C冰箱冷冻，待冷冻完全采用真空冷冻干燥机进行干燥。
全文摘要
本发明涉及工厂化培养领域，尤其涉及一种工厂化培养发菜细胞的方法，包括如下步骤a制作发菜培养装置培养装置由加样装置、实时监测装置、进气及排气装置和排液装置构成；b配制培养液配制发菜培养液，通过配液管将配制好的培养液输送到培养装置内；c培养条件向培养装置内加入原始发菜细胞种，向培养液通氧、调整培养液环境使培养液达到一定指标；通气培养10~15天，期间内通过取样管定期取样检测其吸光值；d采收当吸光值达到OD750nm为0.6时，进行采收。本发明对发菜采取连续培养和连续收获，可使培养液中的发菜保持在生长速度最快的密度条件下，不会因发菜细胞密度过高而抑制其生长速度，或因发菜细胞密度过低而阻碍其生长。
文档编号C12M1/04GK103173389SQ20131008316
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月15日 优先权日2013年3月15日
发明者于亮, 方芸, 周村, 程珍珠, 赵亚娟, 周宇 申请人:博赢(昆山)生物科技有限公司