专利名称：应用于组织工程的细胞三维培养方法
技术领域：
本发明涉及组织工程领域，更具体地说，是涉及一种应用于组织工程的细胞三维培养方法。
背景技术：
细胞在组织中是三维分布的，构建工程化组织，建立一种细胞三维培养方法很重要。将细胞悬液直接接种在支架材料上进行细胞三维培养，由于重力作用，细胞沉降在支架底部，难以均匀分布，在操作过程中有大量细胞未能黏附在支架材料上而浪费了大量细胞；利用液态胶原、ECM胶等进行细胞三维培养，操作比较麻烦价格也比较昂贵，也难以达到细胞在支架中均匀分布；直接利用凝血酶-纤维蛋白，在操作过程中也难以使细胞均匀分布。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术中存在的不足，提供一种应用于组织工程的细胞三维培养方法。
本发明应用于组织工程的细胞三维培养方法，通过下述技术方案予以实现(1)首先将100-500IU/mL工作浓度的凝血酶和20-60mmol工作浓度的氯化钙添加在支架材料中，(2)接着将10-50mg/mL工作浓度的血纤维蛋白原和10-50U/mL工作浓度的XIII因子溶解在哺乳动物细胞培养用的液体培养基中，(3)然后将1×107-2×108/mL浓度的细胞添加在上述液体培养基中并充分混匀细胞，(4)再将上述细胞悬液接种在上述步骤(1)的支架材料中，细胞悬液在5-20秒内凝固，形成细胞-支架-血纤维蛋白凝胶三维复合体，
(5)37℃下放置1小时完全凝固后，添加上述液体培养基在5％二氧化碳的培养箱中培养该复合体，每1-2天换一次液体培养基，培养？(范围)天后即得细胞的三维培养复合体。
本发明所述支架材料为应用于组织工程的各种支架材料，例如用壳聚糖、胶原、明胶、甲壳素天然聚合物及其衍生物以及聚乳酸、聚羟基乙酸合成的高分子聚合物，又例如脱细胞脱蛋白的生物衍生支架材料、生物陶瓷支架材料、多孔羟基磷灰石。
本发明所述凝血酶和纤维蛋白原以及XIII因子是以人和其他哺乳动物来源的凝血酶、纤维蛋白原和XIII因子。
本发明所述细胞为来源于人和其他哺乳动物的细胞，例如心肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、干细胞。
本发明上述步骤(2)中液体培养基为DMEM培养基或RPMI1640培养基。
本发明与胶原凝胶和ECMge1胶相比，该发明提供的方法比前两者更省钱和方便。
1.通过提高催化剂的剂量能很快凝固为凝胶(5-10秒)，这样细胞在悬液中还来不及沉下去胶就凝固了，细胞在支架中很均匀，而胶原凝固较慢(约60秒)，操作复杂，要用碱中和价格也较贵。
2.构建三维培养系统时，比把细胞直接接种在支架材料上要节省细胞，几乎百分百的细胞都直接在三维支架中了，而直接接种在支架材料上的细胞，在操作过程中有很多细胞脱落，最终细胞黏附率最大为50％(细胞接种密度为1×107/ml)3.价格比用ECMge1(Sigma)便宜，前者1ml为1000元，后者1ml约500元，操作也简单，常温下操作或者得保持低温。
本发明利用血液凝固过程的最后阶段反应即凝血酶断裂纤维蛋白原的αβ和AB链而释放酸性多肽，使纤维蛋白原转化为纤维蛋白单体，各单体自发聚集成无桥键相连的多聚体；同时凝血酶激活XIII因子，激活的XIII因子在Ca2+的作用下催化各纤维蛋白单体间两条γ链的谷氨酰胺残基和赖氨酸残基的ε-氨基酸形成共价键，丛而形成稳定的网状的纤维蛋白多聚体。利用这个原理，将凝血酶、氯化钙等催化剂添加在支架材料上，以含血纤维蛋白原和XIII因子的培养基悬浮各种细胞，然后将该细胞悬液接种于该支架材料上，很快就形成细胞-支架-血纤维蛋白凝胶三维复合体，由于凝固时间很短，细胞在三维支架中可均匀分布。利用该方法，可很方便快速构建细胞三维培养复合体，支架材料是什么形状，形成的细胞三维培养复合体就是什么形状。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1心肌细胞的三维培养1.在无菌条件下将胶原海绵支架材料浸泡在含400IU/ml牛凝血酶的PBS溶液中，浸泡2小时后用滤纸吸干备用(也可以在制备胶原海绵过程中直接添加凝血酶，得到含凝血酶的胶原海绵)；2.在无菌条件下取新生大鼠心肌细胞，离心收集细胞沉淀，以含25mg/ml牛血纤维蛋白原、20U/mlXIII、40mmolCaCl2的DMEM高糖培养基(含15％胎牛血清)重悬心肌细胞，细胞浓度为1×108/ml；3.将细胞悬液滴加在1中制备的胶原海绵支架材料中，几秒钟后细胞悬液就凝固了，形成形成心肌细胞-胶原-血纤维蛋白凝胶三维复合体；4.37℃下放置1小时后添加DMEM高糖培养基培养基在37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养该复合体，每天换一次培养基，第三天至第五天换用含10mmolBrdU的培养基两次，以后仍用原来的培养基，培养四周。
结果心肌细胞-胶原-血纤维蛋白凝胶三维复合体中的心肌细胞在第四天后开始跳动，两周后该复合体开始一致跳动。
实施例2成骨细胞的三维培养1.在无菌条件下将胶原海绵支架材料浸泡在含100IU/mL的凝血酶和20mmol氯化钙的PBS溶液中，2小时后用滤纸吸干备用。
2.在无菌条件下取新生大鼠成骨细胞，经体外传代扩增培养后，离心收集细胞沉淀，以含50mg/mL工作浓度的血纤维蛋白原和10U/mL工作浓度的XIII因子的DMEM/F12培养基(含10％胎牛血清)重悬成骨细胞，使细胞浓度为2×107/mL。
3.将细胞悬液滴加在1中制备的胶原海绵支架材料中，约15秒钟后细胞悬液就凝固了，形成成骨细胞-胶原-血纤维蛋白凝胶三维复合体，以普通胶原海绵支架材料(未添加凝血酶和氯化钙)和直接用普通DMEM/F12培养基(未添加牛血纤维蛋白原和XIII)悬浮细胞的成骨细胞-胶原三维复合体为对照组。
4.37℃下放置20分钟后添加DMEM/F12培养基培养基37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养该复合体，每2天换一次液体培养基，即得成骨细胞的三维培养复合体。
结果倒置显微镜下发现细胞均匀分布在支架材料中，对照组中有大量细胞从支架脱落且细胞分布不均匀；体外培养一月后进行石蜡切片和组织化学染色观察，发现该复合体碱性磷酸酶为强阳性，有大量钙化结节形成，对照组中碱性磷酸酶活性较弱，钙化结节也很少。
实施例3软骨细胞的三维培养1.在无菌条件下将壳聚糖海绵支架材料浸泡在含200IU/mL的凝血酶和60mmol的氯化钙的PBS溶液中，2小时后用滤纸吸干备用。
2.在无菌条件下分离家兔软骨细胞，经体外传代扩增培养后，离心收集细胞沉淀，以含10mg/mL工作浓度的血纤维蛋白原和50U/mL工作浓度的XIII因子DMEM/F12培养基(含10％胎牛血清)重悬软骨细胞，使细胞浓度为1×107/mL。
3.将细胞悬液滴加在1中制备的壳聚糖海绵支架材料中，约10秒钟后细胞悬液就凝固了，形成形成软骨细胞-胶原-血纤维蛋白凝胶三维复合体，以普通壳聚糖海绵支架材料(未添加凝血酶和氯化钙)和直接用普通DMEM/F12培养基(未添加牛血纤维蛋白原和XIII)悬浮细胞的软骨细胞-壳聚糖三维复合体为对照组。
4.37℃下放置20分钟后添加DMEM/F12培养基在37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养该复合体，每2天换一次液体培养基，即得软骨细胞的三维培养复合体。
结果倒置显微镜下发现细胞均匀分布在支架材料中，对照组中有大量细胞从支架脱落且细胞分布不均匀；体外培养该复合体一月后进行石蜡切片和组织化学染色观察，该复合体II型胶原免疫染色为强阳性，糖胺多糖含量比对照组高1-2倍，甲苯胺蓝染色也比对照组深，对照组中II型胶原免疫染色阳性较实验组弱。
权利要求
1.一种应用于组织工程的细胞三维培养方法，其特征是，包括下述步骤(1)首先将100-500IU/mL工作浓度的凝血酶和20-60mmol工作浓度的氯化钙添加在支架材料中，(2)接着将10-50mg/mL工作浓度的血纤维蛋白原和10-50U/mL工作浓度的XIII因子溶解在哺乳动物细胞培养用的液体培养基中，(3)然后将1×107-2×108/mL浓度的细胞添加在上述液体培养基中并充分混匀细胞，(4)再将上述细胞悬液接种在上述步骤(1)的支架材料中，细胞悬液在5-20秒内凝固，形成细胞-支架-血纤维蛋白凝胶三维复合体，(5)37℃下放置1小时完全凝固后，添加上述液体培养基在5％二氧化碳的培养箱中培养该复合体，每1-2天换一次液体培养基，即得细胞的三维培养复合体。
2.根据权利要求1所述的应用于组织工程的细胞三维培养方法，其特征是，所述支架材料为应用于组织工程的各种支架材料，例如用壳聚糖、胶原、明胶、甲壳素天然聚合物及其衍生物以及聚乳酸、聚羟基乙酸合成的高分子聚合物，又例如脱细胞脱蛋白的生物衍生支架材料、生物陶瓷支架材料、多孔羟基磷灰石。
3.根据权利要求1所述的应用于组织工程的细胞三维培养方法，其特征是，所述凝血酶和纤维蛋白原以及XIII因子是以人和其他哺乳动物来源的凝血酶、纤维蛋白原和XIII因子。
4.根据权利要求1所述的应用于组织工程的细胞三维培养方法，其特征是，所述细胞为来源于人和其他哺乳动物的细胞，例如心肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、干细胞。
5.根据权利要求1所述的应用于组织工程的细胞三维培养方法，其特征是，所述步骤(2)中液体培养基为DMEM培养基或RPMI1640培养基。
全文摘要
本发明公开了一种应用于组织工程的细胞三维培养方法。本发明属于组织工程领域，该方法将100－500IU/mL工作浓度的凝血酶和20－60mmol工作浓度的氯化钙等催化剂添加在各种生物支架材料中，以含10－50mg/mL工作浓度的血纤维蛋白原和10－50U/mL工作浓度的XIII因子的培养基悬浮各种细胞，利用血凝固的原理，使细胞均匀接种在各种支架材料中，获得细胞－支架材料－纤维蛋白凝胶三维培养系统。利用这种方法，可获得良好的三维培养细胞，构建出各种工程化组织。
文档编号C12N11/00GK1928077SQ20061001604
公开日2007年3月14日 申请日期2006年9月28日 优先权日2006年9月28日
发明者郭勇, 张西正, 李瑞欣, 魏严, 张永红 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生装备研究所