一种复合种子细胞的组织工程神经的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，在Sondell制备法的基础上，采用改良的酶-低渗-化学除垢剂三联萃取神经，在体外构建具有生物活性的组织工程周围神经，然后复合在体外培养、扩增和神经分化诱导骨髓间充质干细胞。本发明克服了目前较为认可的化学制备方法Sondell法在一定程度上对神经基膜管和细胞外基质结构的破坏作用，减少其了对轴突再生的影响。本发明所制备的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经可应用于制备神经移植物，对周围神经缺损修复效果良好。
【专利说明】ー种复合种子細胞的组织工程神经的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医用材料的组织工程【技术领域】，涉及ー种复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方法。
【背景技术】
[0002]临床上经常遇到因肿瘤切除，创伤等原因造成的周围神经缺损问题，使患者肢体肌肉萎縮，运动感觉功能受到损害。治疗的方法是如果缺损距离较短时，可以通过解剖游离，做到无张カ縫合，当缺损距离过大时，通常需要进行自体神经移植。自体神经移植虽然有肯定的疗效并且作为其他治疗方法比较的金标准，但存在很多难以克服的缺点，最致命的缺点是可供选择的神经供体实在有限[1]。至今尚没有ー种合适的替代物能有效的取代自体神经移植。
[0003]材料科学、工程学和生命科学等相关学科的发展和交叉融合产生了再生医学领域内一门新兴学科——组织工程，即应用生命科学和工程学的原理和方法，在正确认识机体生理和病理两种状态下的组织结构及功能的关系的基础上研究开发用于修复，维护，促进人体各组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物，它是人类治疗组织，器官功能衰退，缺失的一项新技木，与传统的治疗技术相比有无与伦比的优点。这项技术的基础是要有合适的细胞支架，ー种材料作为支架必须具有一下要求:生物相容性，表面相容性，结构相容性，生物降解性，可灭菌性。过去所用的支架一般为合成支架，虽具有支架形态，结构，強度，降解的可控性，也可批量生产，但也带来了生物相容性差、感染等问题。
[0004]细胞外基质(extracellularmatrixc, ECM)是组织中除细胞外的所有成分,包括均质状态的基质(蛋白多糖和糖蛋白)和细丝状的胶原纤維。近年来随着组织工程学的发展，经大量研究表明，ECM是细胞附着的基本框架和代谢场所，其形态和功能直接影响所构成的组织形态和功能。完整的ECM内可能存在着某些复合生长因子，可诱导调节细胞的生长、繁殖和分化等。细胞外基质在哺乳动物的发育和生理活动中起重要的作用，基质中的很多成分，如胶原的氨基酸序列在种属间高度保守，这种同源性也为异种细胞外基质作为生物活性支架奠定了基础。研究表明[2]，神经ECM成分有重要的生物学功能，不仅对神经再生有明显的引导和促进作用，并且为神经再生构成了良好的微环境条件。
[0005]天然神经细胞外基质成分如层粘连蛋白(LN)、纤维粘连蛋白(FN)、硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)、I型胶原、IV型胶原(Type IV collagen)等大分子物质具有促进轴突再生的作用。其中对层粘连蛋白的研究认为LN是有A链和B1链与B2链共同构成十字架型结构的多机能蛋白，是轴突生长方向的信息产物和刺激轴突生长作用最強的物质，并且对干细胞的分化迁移起重要作用。LN的作用机制可能与其激活转录因子从而引起基因表达有夫，存在构象改变，突触识别及转录功能。LN促进轴突再生的机制，除加速神经突起的生长外，非常重要的是加速了干细胞的迁移和Buugner带的形成。人硫酸肝素糖蛋白促成轴突生长的作用与层粘连蛋白和IV胶原形成一种复合物结构，改变空间构想从而产生相应的功能有夫。目前认为LN和IV型胶原之所以能够促进突起的生长是因为神经细胞表面存在着能与它们功能基团相结合的受体，当受体与这些功能基团结合后受体调节神经细胞内的肌动蛋白丝，使其在细胞的边缘聚合，受体与收缩的肌动蛋白丝相互作用产生张力，调节生长锥的型态和细胞骨架的动カ使得突起得以生长.Carbonetto等M认为I型胶原对神经突起的生长存在着一定的促进作用ECM中还含有多种神经营养因子如:神经生长因子(NGF)、睫状源性神经营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶原细胞源性神经营养因子(⑶NF)等都对运动神经元表达有不同程度的营养活性，其中⑶NF的营养活性最強。
[0006]由此可以看出:生物体细胞外基质是由不同含量的胶原，纤维粘连蛋白，层粘连蛋白，糖蛋白及糖胺聚糖按一定比例和结构建成的复杂的有机的统一整体，含有调节细胞分化迁移的各种生长因子和信号分子。就目前的技术水平看，人们还没有能力制造出完全模拟细胞外基质结构和功能的支架，所以脱细胞的细胞外基质就成为组织工程支架最佳选择。Kim BSM等用异体的脱细胞神经复合NGF (神经生长因子)和VEGF (血管内皮生长因子)后修复大鼠坐骨神经，发现其运动，伤害感受及本体感受均有显著改善，进ー步证实脱细胞异体神经移植可以功能性的促进周围神经再生。国内卢世壁等[5]用三硝基甲苯和脱氧胆酸纳萃取异体神经，可将细胞及抗原脱去，并且很好的保留了基底膜和层粘连蛋白等促进轴突再生的成分和结构，成功得到了粗的长段的脱细胞异体神经。尽管脱细胞异体神经移植在国内外已取得了一些进展，但异体神经来源仍然有限，供给问题还是没有完全解決。研究表明同种异体的同一组织之间细胞外基质的成分和结构是相同的，在某些不同种群之间，如猪和人的一些细胞外基质也是相似的。
[0007]同时随着干细胞生物学的发展，干细胞可塑性开始受到关注。最近关于骨髓基质细胞的非传统可塑性在周围神经损伤中的应用引起了人们的极大关注te_8]。Dezawa等[9]报导了在体外通过一系列细胞因子的作用后，骨髄基质细胞可表达P75，S100,等胶质细胞标志，当其移植到大鼠坐骨神经损伤远端的盲端管道后可整合入再生生长锥。Cuevas-也描述了将未诱导分化的骨髄基质细胞注射入神经损伤部位后的迁移分化和修复作用。Mel等[n]将骨髓基质细胞诱导成雪旺氏细胞样细胞移植入大鼠坐骨神经损伤处，发现对损伤处的雪旺氏细胞的増殖起刺激和支持作用。故骨髓间充质干细胞作为雪旺细胞的替代品，弥补了雪旺细胞的取材来源、增殖纯化、抗原特性等问题。
[0008]上述的參考文献具体如下:
[0009][1]Vanderhooft E.Functional outcomes of nerve grafts for the upper andlower extremities.J Hand Clin.2000;16 (1):93-104
[0010][2] Zhang LX，Tong XJ，Sun XH，Tong L，Gao J，Jia H，Li ZH.Experimentalstudy of low dose ultrashortwave promoting nerve regeneration afteracellular nerve allografts repairing the sciatic nerve gap of rats.Cell MolNeurobiol.2008Jun;28 (4):501-9.Epub2007Dec6.[0011][3] Carbonetto S, Gruver MM, Turner DC.Nerve fiber growth inculture on f ibronectin collagen and glycosaminoglycan substrates [J].Jneurosci,1983;3:2324-2335.[0012][4]Kim BS，Yoo JJ,Atala A Peripheral nerve regeneration using acellularnerve grafts.J Biomed Mater Res A.2004Febl;68 (2):201-9.[0013][5]Zhong HB,Lu SB,Hou SX Acellular nerve allograft by chemicalextraction in humans Zhonghua Wai Ke Za Zh1.2003Jan;41 (1):60-3.[0014][6] Amoh Y，Hamada Y，Aki R, Kawahara K，Hoffman RM, Kat suokaK.Direct transplantation of uncultured hair-f ollicle pluripotentstem(hfPS)cells promotes the recovery of peripheral nerve injury.J CellBiochem.2010May; 110 (1): 272-7.[0015][7]Walsh S, Biernaskie J，Kemp SW, Midha R.Supplementation of acellularnerve grafts with skin derived precursor cells promotes peripheral nerveregeneration.Neuroscience.2009Decl5;164(3):1097-107.[0016][8] Santiago LY, Clavi jo-Alvarez J, Brayf ield C，Rubin JP, MarraKG.Delivery of adipose-derived precursor cells for peripheral nerve repair.CellTransplant.2009;18 (2):145-58.[0017][9]Dezawa M，Takahashi I，Esaki M，et al.Sciatic nerve regeneration inrats induced by transplantation of in vitro differentiated bone—marrow stromalcells.Eur J Neurosc1.2001Dec;14(11):1771-6.[0018][10]Cuevas P,Carceller F.Dujovny M Peripheral nerve regeneration bybone marrow stromal cells.J Neurol Res.20020ct;24(7):634-8.[0019][ll]Mel Tohill，Cristina Mantovani,Mikael Wiberg.Rat bone marrowmesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration.J Neuroscience Letters362 (2004)200-203.
【发明内容】
[0020]本发明解决的问题在于提供一种复合神经诱导的骨髓间充质干細胞的组织工程神经的制备方法，釆用组织工程的技术方法构建异种脱細胞神经基质，再用经过神经的诱导骨髓间充质干細胞与之复合，用于周围神经缺损修复，以解决周围神经损伤治疗的难点。
[0021]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0022]一种复合神经诱导的骨髓间充质干細胞的组织工程神经的制备方法，包括以下操作:
[0023]1)取离体的异种动物的外周神经组织，剔除其中的神经外血管、脂肪及结缔组织之后，用胰蛋白酶处理；胰蛋白酶处理完成后終止消化，使用低渗处理液对神经组织进行低渗处理；
[0024]2)将低渗处理后的神经组织在SB-10溶液中震荡浸泡12h以上，清洗后转入含有Triton X200和SB-16的混合液中震荡浸泡12h以上，清洗后得到脱细胞神经基质；
[0025]3)用含体积分数10-20%的胎牛血清和1-5 μ mol / L β -巯基こ醇的DMEM-F12培养基预诱导传代后的骨髄间充质干细胞12-24h，无菌冲洗，然后培养基更换为含质量分数1-2% ニ甲基亚砜和体 积分数10-20%的胎牛血清的DMEM-F12培养基，诱导培养12 -24h ；
[0026]4)将脱细胞神经基质用DMEM-F12培养基充分浸润，吸干培养基后37°C孵育，然后接种诱导培养后的神经诱导骨髄间充质干细胞，添加DMEM-F12培养，并补充胎牛血清至体积分数为10-20%，于37°C、5%C02、95%湿度的条件下培养48小时得到复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经。
[0027]所述的外周神经组织是在显微镜下仔细剔除神经外血管、脂肪及结缔组织；然后加入质量分数0.25%的胰蛋白酶，37°C下、以80-100次/分钟的频率震荡水浴20-30分钟；
[0028]倾去胰蛋白酶，PBS清洗终止胰蛋白酶消化，然后去离子水，25°C下、以80-100次/分钟的频率震荡水浴3-4小时；再将低渗处理后的神经组织转入灭菌的PBS溶液中润洗。
[0029]所述的低渗处理后的神经组织是在SB-10溶液、含有Triton X200和SB-16的混合液交替多次循环处理之后，获得脱细胞神经基质。
[0030]所述的低渗处理后的神经组织是在浓度为100-150mmol/L SB-10溶液中，在25°C下、以80-100次/分钟的频率震荡水浴12-15小吋，然后转入灭菌PBS溶液中清洗；
[0031]清洗后次转入含有质量浓度0.14-0.20%的Triton X200和0.6-0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25°C下、以80-100次/分钟的频率震荡水浴12-24小时，然后转入灭菌PBS溶液中清洗；
[0032]清洗后第二次转入浓度为100-150mmol/L SB-10溶液中，在25°C下、以80-100次/分钟的频率震荡水浴5-10小吋，然后转入灭菌PBS溶液中清洗；
[0033]清洗后第二次转入含有质量浓度0.1`4-0.20%的Triton X200和0.6-0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25°C下、以80-100次/分钟的频率震荡水浴10-15小时，然后转入灭菌PBS溶液中清洗，获得脱细胞神经基质，4°C保存。
[0034]所述的骨髄间充质干细胞的制备及传代培养为:
[0035]取骨髓组织，使用含青霉素、链霉素各100U/ml的DMEM-F12培养基，冲洗吹打制成单细胞悬液，将细胞悬液和Percoll分离液混合后离心，收集离心液界面上乳白色云雾状的细胞层，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12培养基重悬细胞，计数5X 105个/ml后即接种于培养瓶中，置于37°C、5%C02、95%湿度的培养箱中进行原代培养，分别于1、3天半量换液，以后每3天全量换液1次；
[0036]待细胞长满瓶底80%时进行传代培养，以1 X 104个/ml传代。
[0037]所述的步骤3)对骨髓间充质干细胞的诱导培养为:
[0038]用含体积分数20%的胎牛血清和3 μ mol / L β -巯基こ醇的DMEM-F12培养基预诱导传代后的骨髄间充质干细胞24h，以无菌PBS冲洗，然后培养基更换为含质量分数2%ニ甲基亚砜和体积分数20%的胎牛血清的DMEM-F12培养基，诱导培养24h。
[0039]所述的步骤4)对骨髓间充质干细胞的培养为:
[0040]将脱细胞神经基质用DMEM-F12培养基浸润12小吋，然后将培养基吸干，37°C下孵育5小吋；再将生长良好的神经诱导骨髄间充质干细胞，使用胰蛋白酶消化成细胞悬液，离心后用DMEM-F12培养液重悬，以104/cm2的密度接种在孵育后脱细胞神经基质上，以DMEM-F12为培养基，并补充胎牛血清的体积浓度至20%，置于37°C、5%C02、95%湿度的培养箱中培养48小吋，并在倒置显微镜下连续观察细胞生长及污染情況。
[0041]所制备的复合神经诱导的骨髄间充质干细胞的组织工程神经在制备神经移植物中的应用。[0042]所制备的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经在制备周围神经缺损修复的药物中的应用。
[0043]所制备的神经诱导的骨髄间充质干细胞在制备雪旺细胞替代品中的应用。
[0044]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0045]本发明提供的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，在Sondell制备法的基础上，采用改良的酶_低渗_化学除垢剂三联萃取神经，在体外构建具有生物活性的组织工程周围神经，然后复合在体外培养、扩增和神经分化诱导骨髄间充质干细胞，用于周围神经缺损修复。
[0046]由于本发明采用了酶(胰蛋白酶)_低渗(去离子水)-化学除垢剂三联萃取法，其中Triton X200、SB-10和SB-16三种相对柔和的化学萃取剂的联合使用，克服了目前较为认可的化学制备方法Sondell法在一定程度上对神经基膜管和细胞外基质结构的破坏作用，減少其了对轴突再生的影响，从而使得本发明制备的脱细胞神经基质具有能够更加有效地保留神经组织天然的细胞外基质结构优势。
[0047]本发明采用神经基质复合分化诱导的骨髄间充质干细胞的组织工程神经，具有良好的神经修复效果:经神经诱导干细胞组縫合神经处与周围组织无明显粘连，与正常神经连接处光滑无断裂，表面可见微小血管网形成，似正常神经；以所制备的骨髄干细胞为雪旺细胞的替代品，弥补了雪旺细胞的取材来源、增殖纯化、抗原特性等缺陷，构建的脱细胞组织工程神经更加符合神经组织的生理构成，移植物的修复效果较单纯脱细胞神经基质更加明显。【专利附图】
【附图说明】
[0048]图1是本发明制备的脱细胞神经基质横切片的HE染色图片；
[0049]图2是本发明制备的脱细胞神经基质的Masson三色染色图片；
[0050]图3是本发明制备的脱细胞神经基质的扫描电镜图片；
[0051]图4是本发明制备的脱细胞神经基质的透射电镜图片；
[0052]图5是实例中神经诱导的骨髄间充质干细胞和脱细胞神经基质共培养后第10天相差显微镜下观察的图片，可见大量类雪旺细胞；
[0053]图6实例中未诱导的骨髄间充质干细胞和脱细胞神经基质共培养后第10天相差显微镜下观察的图片，可见大量梭形细胞。
【具体实施方式】
[0054]下面结合具体的实施例对本发明做进ー步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0055]本发明提供的复合神经诱导的骨髄间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，包括以下操作:
[0056]1)取离体的异种动物的外周神经组织，剔除其中的神经外血管、脂肪及结缔组织之后，用胰蛋白酶处理；胰蛋白酶处理完成后終止消化，使用低渗处理液对神经组织进行低渗处理；
[0057]2)将低渗处理后的神经组织在SB-10溶液中震荡浸泡12h以上，清洗后转入含有Triton X200和SB-16的混合液中震荡浸泡12h以上，清洗后得到脱细胞神经基质；
[0058]3)用含体积分数10-20%的胎牛血清和1-5 μ mol / L β -巯基こ醇的DMEM-F12培养基预诱导传代后的骨髄间充质干细胞12-24h，无菌冲洗，然后培养基更换为含质量分数1-2% ニ甲基亚砜和体积分数10-20%的胎牛血清的DMEM-F12培养基，诱导培养12 -24h ；
[0059]4)将脱细胞神经基质用DMEM-F12培养基充分浸润，吸干培养基后37°C孵育，然后接种诱导培养后的神经诱导骨髄间充质干细胞，添加DMEM-F12培养，并补充胎牛血清至体积分数为10-20%，于37°C、5%C02、95%湿度的条件下培养48小时，得到复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经。
[0060]本发明首先对异种生物神经组织进行处理，在显微镜下仔细剔除神经外血管、月旨肪及结缔组织，使用胰蛋白酶处理神经，以协助破坏在细胞膜和细胞外基质之间的结合，然后在使用低渗处理液(去离子水)对神经进行低渗处理，然后使用中性去细胞化学试剂SB-10溶液萃取，将萃取好的神经组织用PBS缓冲液清洗后接着使用阴离子处理剂TritonX200和中性去细胞化学试剂SB-16溶液萃取，之后再循环上述化学除垢剂的处理步骤，但作用时间減少，最后达到彻底清除神经细胞的目的以完成脱细胞神经基质的制备。取一定量的骨髄组织，吹打制成单细胞悬液，注入含Percoll分离液于离心管中离心，收集离心液上层云雾状细胞，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含有胎牛血清的DMEM-F12培养基重悬细胞后接种于培养瓶中，置于37°C、5%C02、95%湿度的培养箱中进行原代培养，之后定期更换细胞液。待细胞长满瓶底8 0%时进行传代培养。将传代后的骨髄间充质干细胞用含胎牛血清和巯基こ醇(ΒΜΕ)的DMEM-F12培养基预诱导骨髓间充质干细胞，PBS冲洗后换成含ニ甲基亚砜(DMS0)和胎牛血清的DMEM-F12诱导。将诱导的骨髓间充质干细胞制成细胞悬液后分散、点状注入事先制备好的脱细胞神经基质中，置入培养皿中培养。
[0061]所述的PBS溶液的pH为7.2-7.4 ;所述的SB-10溶液即ニ甲基硫代こ酸-10，为中性的去细胞化学剂；所述的SB-16溶液即ニ甲基硫代こ酸-16，亦为中性去细胞化学剂；所述的Triton X200溶液即三硝基甲苯X-100，为阴离子处理剂；所述的DMEM-F12培养基为ー种常用细胞培养基；所述的Percoll分离液是经过聚こ烯卩比咯烧酮(polyvinylpyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒混悬液；所述的胎牛血清为常见的细胞外培养液，其浓度可根据不同需要调整；所述的巯基こ醇和ニ甲基亚砜均为常见的化学试剂，以上试剂和培养基均可从生物公司购得，0.25%胰蛋白酶消化液可自行配制或者由生物公司购得。
[0062]下面结合具体的实施例来进行说明，其中脱细胞神经基质来源于York猪肋间神经；骨髄间充质干细胞来源于SD大鼠骨髄。
[0063]一种复合神经诱导的骨髄间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，包括以下操作:
[0064]1)取健康York猪的外周神经组织(肋间神经60mm)，在显微镜下仔细剔除神经外血管、脂肪及结缔组织；
[0065]2)取上述处理后的神经，加入0.25%胰蛋白酶，37°C中以100次/分钟的频率震荡水浴30分钟；
[0066]3)倾去上述容器中的胰蛋白酶，PBS清洗3遍，毎次5分钟以终止胰酶消化，加入低渗溶液(去离子水)，25°C中以100次/分钟的频率震荡水浴4小时；
[0067]4)将处理后的神经组织转入含有灭菌PBS溶液中润洗；
[0068]5)转入含有浓度为125mmol/L的SB-10处理液中，在25°C中以100次/分钟的频率震荡水浴15小吋；
[0069]6)转入灭菌PBS溶液中清洗15分钟，期间PBS溶液至少更换3次；
[0070]7)转入 0.14%Triton X200 和 0.6mmol/L SB-16 混合处理液中，在 25°C 中以 100次/分钟的频率震荡水浴24小时；
[0071]8)转入灭菌PBS清洗液中清洗3次，每次5分钟；
[0072]9)再次转入含有浓度为125mmol/L的SB-10处理液继续以先前条件震荡萃取7小时；
[0073]10)灭菌PBS溶液清洗15分钟，每5分钟更换1次PBS溶液；
[0074]11)再次转入的0.14%Triton X200和0.6mmol/L SB-16混合处理液中，同先前的条件震荡萃取15小吋；
[0075]12)转入含有灭菌PBS溶液中，4°C保存。
[0076]13)取一定量的骨髓组织，使用无血清DMEM-F12培养基(含青霉素、链霉素各100U/ml)冲洗吹打制成单细胞悬液，按细胞悬液和Percoll分离液以1:1的比例移至离心管中，将离心半径调至8cm，以2000r/min的速率离心20分钟，收集离心液界面上乳白色云雾状的细胞层，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含有10%胎牛血清的DMEM-F12培养基重悬细胞，计数5X 105个/ml后即接种于培养瓶中，置于37°C、5%C02、95%湿度的培养箱中进行原代培养，分别于1、3天半量换液，以后每3天全量换液1次。倒置相差显微镜观察细胞培养全过程。待细胞长满瓶底80%时进行传代培养，以1 X 104个/ml传代；
[0077]具体的，将SD大鼠断颈处死，70%こ醇消毒，无菌条件下取股骨、胫骨，剔出周围肌肉组织，剪去两端骨骺，抽取5ml无血清DMEM-F12培养基(含青霉素、链霉素各100U/ml)冲洗骨髄腔，吹打制成单细胞悬液，注入含有5ml的Percoll分离液的离心管中，将离心半径调至8cm，以2000r/min的速率离心20分钟，收集离心液界面上乳白色云雾状的细胞层，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含有10%胎牛血清的DMEM-F12培养基重悬细胞，计数5 X 105个/ml后即接种于培养瓶中，置于37°C、5%C02、95%湿度的培养箱中进行原代培养，分别于1、3天半量换液，以后每3天全量换液1次。
[0078]14)用含20%胎牛血清和3 μ mol / Lβ-巯基こ醇(ΒΜΕ)的DMEM-F12培养基预诱导上述传代后的骨髄间充质干细胞24小吋，以无菌PBS冲洗3次，然后换成含2%ニ甲基亚砜(DMS0)和20%胎牛血清的DMEM-F12，诱导24小时。
[0079]15)取制备好的脱细胞神经基质，用DMEM-F12培养基浸润12小时，然后将培养基吸干，置于37°C的孵箱中5小吋。取生长良好的神经诱导骨髄间充质干细胞，使用0.25%胰酶消化成细胞悬液，800r/min离心5分钟，DMEM-F12重悬，以104/cm2的密度接种在自制的脱细胞神经基质上，继续选用为DMEM-F12培养基，补充20%胎牛血清，置于37°C、5%C02、95%湿度的培养箱中培养48小时，倒置显微镜下连续观察细胞生长及污染情況。
[0080]參见图1所示的脱细胞神经基质横切片的HE染色图片，可以看到图片中的轴突及神经细胞均消失，代之以红染的神经内膜形成的圆形空腔，周边可见红染的神经束膜及外膜；
[0081]參见图2所示的脱细胞神经基质的Masson三色染色图片，可以看到脱细胞神经基质只保存大量胶原成分(蓝色);
[0082]參图3所示的脱细胞神经基质的扫描电镜图片，可以看到神经基底膜保留，而管腔扩大；
[0083]參见图4所示的脱细胞神经基质的透射电镜图片，可以看到神经髓鞘完全被清除。
[0084]由图1-图4可知，本发明所制备的脱细胞神经基质脱细胞相对完全，能够更加有效地保留神经组织天然的细胞外基质结构。
[0085]參见图5、图6，神经诱导的骨髄间充质干细胞和脱细胞神经基质共培养后第10天相差显微镜下观察的图片，可见大量类雪旺细胞，能够作为雪旺细胞的替代品；而未诱导的骨髄间充质干细胞和脱细胞神经基质共培养后，可见大量梭形细胞。
[0086]下面给出所制备的复合神经诱导的骨髄间充质干细胞的组织工程神经的移植实验:
[0087]1)健康SD大鼠30只，雌雄各半，体重约180-220g/只，分成三组:复合神经诱导的骨髄间充质干细胞组、未诱导的骨髄间充质干细胞组和单纯脱细胞神经基质组，每组10只。动物用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(用药量0.4ml/100g)后，无菌条件下暴露右侧坐骨神经，在梨状肌下缘2_ 处造成长15_的坐骨神经缺损，三组将各自脱细胞神经支架与两断端用10-0无创线端端吻合，之后依次縫合臀大肌及皮肤。术后肌注庆大霉素4万単位3次(1次/4h)，分笼饲养。
[0088]2)术后各组大鼠精神状态可，活动良好，伤ロ无感染，复合神经诱导骨髄间充质干细胞组大鼠术后平均6天伤ロ愈合，足底皮肤红肿，但无溃疡；平均18天后术侧足趾可着地行走，后蹬カ较好；未经诱导的骨髄间充质干细胞组大鼠术后平均7天伤ロ愈合，足底皮肤红肿无溃疡；平均21天后术侧足趾可着地行走，后蹬カ亦较好；单纯支架组大鼠5d后足底皮肤红肿溃疡，4周后皮肤溃疡及伤ロ基本愈合，术后6周方可着地行走，有跛行。
[0089]3)术后3个月，针刺患肢足底，两组复合骨髄干细胞组均有痛感，尤以符合神经分化诱导组为甚，支架组痛觉不明显；经神经诱导干细胞组縫合神经处与周围组织无明显粘连，与正常神经连接处光滑无断裂，表面可见微小血管网形成，似正常神经，直径较正常的神经干稍细，其余两组较神经分化诱导组稍细，神经分化诱导组术区未见粘连，手术侧腓肠肌萎縮不明显。单纯神经支架组和未诱导干细胞组术区仍有少量粘连，手术侧腓肠肌少许萎縮。
[0090]结果表明本发明具有良好的神经修复作用，可应用于:制备神经移植物、制备周围神经缺损修复的药物，将具有良好的神经修复作用:经神经诱导干细胞组缝合神经处与周围组织无明显粘连，与正常神经连接处光滑无断裂，表面可见微小血管网形成，似正常神经。
[0091]而且本发明制备的神经诱导的骨髄间充质干细胞，能够作为雪旺细胞的替代品，弥补了雪旺细胞的取材来源、增殖纯化、抗原特性等缺陷，构建的脱细胞组织工程神经更加符合神经组织的生理构成，移植物的修复效果较单纯脱细胞神经基质更加明显。
【权利要求】
1.一种复合神经诱导的骨髄间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，其特征在干，包括以下操作: 1)取离体的异种动物的外周神经组织，剔除其中的神经外血管、脂肪及结缔组织之后，用胰蛋白酶处理；胰蛋白酶处理完成后終止消化，使用低渗处理液对神经组织进行低渗处理； 2)将低渗处理后的神经组织在SB-10溶液中震荡浸泡12h以上，清洗后转入含有Triton X200和SB-16的混合液中震荡浸泡12h以上，清洗后得到脱细胞神经基质； 3)用含体积分数10-20%的胎牛血清和1-5μ mol / L β -巯基こ醇的DMEM-F12培养基预诱导传代后的骨髄间充质干细胞12-24h，无菌冲洗，然后培养基更换为含质量分数1-2% ニ甲基亚砜和体积分数10-20%的胎牛血清的DMEM-F12培养基，诱导培养12-24h ； 4)将脱细胞神经基质用DMEM-F12培养基充分浸润，吸干培养基后37°C孵育，然后接种诱导培养后的神经诱导骨髄间充质干细胞，添加DMEM-F12培养，并补充胎牛血清至体积分数为10-20%，于37°C、5%C02、95%湿度的条件下培养48小时，得到复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织 工程神经。
2.如权利要求1所述的复合神经诱导的骨髄间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，其特征在于，所述的外周神经组织是在显微镜下仔细剔除神经外血管、脂肪及结缔组织；然后加入质量分数0.25%的胰蛋白酶，37°C下、以80-100次/分钟的频率震荡水浴20-30分钟； 倾去胰蛋白酶，PBS清洗终止胰蛋白酶消化，然后去离子水，25°C下、以80-100次/分钟的频率震荡水浴3-4小时；再将低渗处理后的神经组织转入灭菌的PBS溶液中润洗。
3.如权利要求1所述的复合神经诱导的骨髄间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，其特征在于，所述的低渗处理后的神经组织是在SB-10溶液、含有Triton X200和SB-16的混合液交替多次循环处理之后，获得脱细胞神经基质。
4.如权利要求1所述的复合神经诱导的骨髄间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，其特征在于，所述的低渗处理后的神经组织是在浓度为100-150mmol/L SB-10溶液中，在25°C下、以80-100次/分钟的频率震荡水浴12-15小吋，然后转入灭菌PBS溶液中清洗； 清洗后次转入含有质量浓度0.14-0.20%的Triton X200和0.6-0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25°C下、以80-100次/分钟的频率震荡水浴12-24小吋，然后转入灭菌PBS溶液中清洗； 清洗后第二次转入浓度为100-150mmol/L SB-10溶液中，在25°C下、以80-100次/分钟的频率震荡水浴5-10小吋，然后转入灭菌PBS溶液中清洗； 清洗后第二次转入含有质量浓度0.14-0.20%的Triton X200和0.6-0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25°C下、以80-100次/分钟的频率震荡水浴10-15小时，然后转入灭菌PBS溶液中清洗，获得脱细胞神经基质，4°C保存。
5.如权利要求1所述的复合神经诱导的骨髄间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，其特征在于，所述的骨髄间充质干细胞的制备及传代培养为: 取骨髓组织，使用含青霉素、链霉素各100U/ml的DMEM-F12培养基，冲洗吹打制成单细胞悬液，将细胞悬液和Percoll分离液混合后离心，收集离心液界面上乳白色云雾状的细胞层，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12培养基重悬细胞，计数5X 105个/ml后即接种于培养瓶中，置于37°C、5%C02、95%湿度的培养箱中进行原代培养，分别于1、3天半量换液，以后每3天全量换液1次； 待细胞长满瓶底80%时进行传代培养，以1 X 104个/ml传代。
6.如权利要求1所述的复合神经诱导的骨髄间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，其特征在于，所述的步骤3)对骨髓间充质干细胞的诱导培养为: 用含体积分数20%的胎牛血清和3 μ mol / L β -巯基こ醇的DMEM-F12培养基预诱导传代后的骨髄间充质干细胞24h，以无菌PBS冲洗，然后培养基更换为含质量分数2%ニ甲基亚砜和体积分数20%的胎牛血清的DMEM-F12培养基，诱导培养24h。
7.如权利要求1所述的复合神经诱导的骨髄间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，其特征在于，所 述的步骤4)对骨髓间充质干细胞的培养为: 将脱细胞神经基质用DMEM-F12培养基浸润12小时，然后将培养基吸干，37°C下孵育5小时；再将生长良好的神经诱导骨髄间充质干细胞，使用胰蛋白酶消化成细胞悬液，离心后用DMEM-F12培养液重悬，以104/cm2的密度接种在孵育后脱细胞神经基质上，以DMEM-F12为培养基，并补充胎牛血清的体积浓度至20%，置于37°C、5%C02、95%湿度的培养箱中培养48小吋，并在倒置显微镜下连续观察细胞生长及污染情況。
8.权利要求1所制备的复合神经诱导的骨髄间充质干细胞的组织工程神经在制备神经移植物中的应用。
9.权利要求1所制备的复合神经诱导的骨髄间充质干细胞的组织工程神经在制备周围神经缺损修复的药物中的应用。
10.权利要求1所制备的神经诱导的骨髄间充质干细胞在制备雪旺细胞替代品中的应用。
【文档编号】A61L27/38GK103446628SQ201310364793
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月20日 优先权日:2013年8月20日
【发明者】樊立宏, 王坤正, 党晓谦, 余泽锋 申请人:西安交通大学