获得视网膜祖细胞、视网膜色素上皮细胞和神经视网膜细胞的方法
【专利说明】获得视网膜祖细胞、视网膜色素上皮细胞和神经视网膜细胞 的方法
【背景技术】
[0001] 感光细胞或支持视网膜色素上皮细胞(RPE)的功能受损或功能完全丧失，是导致 视网膜疾病(诸如遗传性视网膜变性和年龄相关性黄斑变性(AMD))中的不可逆失明的主要 原因。青光眼中的视网膜神经节细胞(RGC)死亡也导致视力的不可逆丧失。挽救退变性视网 膜是主要挑战，而且细胞替换是最有希望的方式之一(Pearson et al.，2012;Barber et al.，2013)。使用人类多能干细胞、胚胎干(ES)细胞和诱导多能干（iPS)细胞开启了用于人 类视网膜变性疾病的新途径。人类ES(hES)和iPS(hiPS)细胞可用作进行组织移植的视网膜 细胞(光感受器、RPE和RGC)的无限制来源，其中人类ES(hES)和iPS(hiPS)细胞具有在培养 时无限扩增，同时保持它们的多能状态的能力（参见综述:(3〇1117116丨31.，2010 ;〇31111]^1111-Noor et al ·，2010，Boucherie et al ·，2011)。但是，这一新技术仍然面临很多困难。尤其 是，目前分化程序还不够完善，不足以确保效率和安全性。几篇公开文件指出，hES和hiPS细 胞可通过细胞培养物中的集落进行自发分化(Buchholz et al.，2009;Vaajasaari et al· ,2011 ;Zahabi et al .,2012)，或通过不同的漂浮聚集方法（Idelson et al.，2009;Lu et al.，2009;Kokkinaki et al.，2011)，相对容易地分化成RPE细胞。越来越多的汇聚数据 证明，hES或hiPS具有在拟胚体形成之后转化成神经视网膜谱系，并且进一步分化成表达光 感受器标记物的细胞的能力（Lamba et al .,2006,2009 ;0sakada et al .,2008,2009 ; Meyer et al.，2009，Mellough et al.，2012)。之前开发的不同方法尽管有真正的进步，但 是仍然存在通常与多能干细胞分化成高特化的细胞类型相关的缺点。用于hES或hiPS细胞 向光感受器定向分化的这些方案需要几个步骤，添加几种分子，而且效率相当低。目前，其 它组试图进一步从hES或hiPS细胞的拟胚体获得视泡样结构的3D结构（Meyer et al.， 2011 ;Nakano et al. ,2012)。分化方法使用基质胶(matrigel)，来再创建围绕拟胚体的复 杂的细胞外基质(ECM)，从而允许神经上皮的自形成，并且或快或慢地分化成感光细胞谱系 (Meyer et al.,2011；Nakano et al.,2012；Boucherie et al.,2013；Zhu et al.,2013)〇
[0002] 因此，现有技术中需要一种在体外准确模拟分化和发育的简单、有效且可靠的方 法，来获得特定的人类神经上皮谱系细胞的基本纯的培养物，其中特定的人类神经上皮谱 系细胞包括视网膜祖细胞、RPE细胞和神经视网膜细胞。
【发明内容】
[0003] 如在下面的实验部分所公开的，发明人现在使iPS细胞进行一种组合了2D和30培 养系统的新的视网膜分化方案。该方案避免形成拟胚体或细胞团，并且可在没有基质胶或 血清时进行。发明人证明，培养在促神经培养基中的融汇的hiPS细胞可在两周内生成具有 眼域(eye field)特征的神经上皮样结构，当转换成3D培养时，该神经上皮样结构可分化成 主要的视网膜细胞类型。在这些条件下，hiPS细胞自组装成神经视网膜样组织，并且在发育 的适当时间窗中具有视网膜标记物的快速表达;它们产生不同的视网膜细胞类型，诸如RGC 和光感受器。
[0004] 因此，本发明的第一目标是一种用于在体外获得人类视网膜祖细胞的方法，该方 法包括以下步骤：
[0005] (i)将人类多能干细胞的贴壁培养物放置于促神经培养基中；并且
[0006] (ii)使所述培养物保持在所述促神经培养基中，直至出现色素细胞和/或神经上 皮样结构。
[0007] 在本文中，"视网膜祖细胞（progenitor )"，也被称为"视网膜先祖细胞 (progenitor cell)"，涵盖有能力生成神经视网膜的全部细胞类型的细胞，包括光感受器 的前体以及能分化成RPE的细胞。
[0008] "人类多能干细胞"包括人类胚胎干(hES)细胞和人类诱导多能干(hiPS)细胞。上 述方法有利地使用人类诱导多能干细胞进行。
[0009] "促神经培养基"在本文中指有利于神经元细胞的维持和/或生长的任意培养基。 这样的培养基的非限制性实例是由营养培养基构成的任意培养基，诸如杜氏改良伊格尔培 养基（Dulbeco's Modified Eagle Medium):营养混合物F_12(DMEM/F12)或Neurobasal?.培 养基(Gibco?)，上述营养培养基补充有培养基补充物，该培养基补充物包括以下成分的至 少一部分:碳源、维生素、无机盐、氨基酸和蛋白消化物。适于获得促神经培养基的补充物的 非限制性实例是N2、B27、G5和BIT9500补充物，以及衍生自这些补充物的任意补充物。存在 于这些补充物中的组分总结于下面的表1中。
[0010]
[0012] 表1:促神经培养基的四种培养基补充物的组成，参见Brewer et al.，1993;b由制 造商提供(Gibco BRL，德国）；c由制造商提供(StemCell Technologies Inc.，加拿大）一由 制造商提供(Life Technologies，USA) 〇
[0013] 在下文中，"神经上皮样结构"，在下面的实验部分中也被命名为"神经视网膜样结 构"，指在促神经培养基中培养几天之后开始出现的相光(phase-bright)结构。这些结构基 本上由不显著表达多能相关基因（诸如0CT4)，但表达与眼区特化（eye-field specification)相关的转录因子(诸如LHX2、RAX、PAX6和SIX3)的细胞构成。如在实验部分 中所公开的，当进行上述方法时，首先出现色素细胞，而神经上皮样结构最常出现在色素细 胞斑块的附近。
[0014] 当然，在进行根据本发明的方法时，技术人员可检测多种标记物的表达（以检验它 们的表达或检验它们不再被表达的事实，和/或定量测量它们的表达水平）。为了实现这一 目的，可使用本领域已知的任意技术，例如定量RT-PCR和免疫测定。多能性标记物的实例是 0CT4、S0X2和NAN0G;眼区标记物的实例是1^乂、?六乂6、(1^2、1^^2和3^3，前两个是优选的。
[0015] 有利地，可在不使用复杂且昂贵的培养基的情况下进行上述方法。实际上，可使用 非常简单的培养基，从多能干细胞的贴壁培养物中获得人视网膜祖细胞。尤其不需要分化 因子。根据上述方法的优选实施方式，在培养步骤中使用的促神经培养基缺乏以下分化因 子中的至少一种：头蛋白（noggin)、Dkk-l和IGF-1。尤其是，促神经培养基可缺乏这三种因 子。
[0016] 在步骤（i)中使用的人类多能干细胞可在任意类型的贴壁培养系统中培养。可用 于这种培养的表面的非限制性实例是:玻璃、塑料(可能是经过处理的）、胶原、层粘连蛋白、 纤连蛋白、Matrigel?、聚-L-赖氨酸、滋养细胞，或市场上可购买的任意合成表面，诸如 Corning Synthemax?。在优选实施方式中，在上述方法的步骤(i)中使用的贴壁培养物是达 到至少80%细胞覆盖的集落型单层的形式。技术人员熟知贴壁细胞的细胞覆盖的概念，并 且能评价该细胞覆盖，其中对细胞覆盖可进行局部理解，即特别是如果细胞覆盖在整个培 养表面是不均匀的，则细胞覆盖可仅是在容器的一个区域中的细胞覆盖。在集落型单层的 情况中，如果需要，可将"80%细胞覆盖"定义为以下状态：当一些集落与其它集落点状接 触，而同时在这些集落之间还保持有一些空闲空间（占表面的10%至30% )。
[0017] 如在实验部分中所描述的，但这不是强制性的，可进行根据本发明的方法，以便在 步骤(i)之前，进行以下步骤:在培养基中对所述多能干细胞进行贴壁培养，以维持多能干 细胞1至4天，优选2天，其中该培养基经改良以缺乏基本的成纤维细胞生长因子（bFGF/ FGF2)。用于该额外的步骤的适当培养基的非限制性实例是，来自ReproCELL的灵长类动物 ES细胞培养基（Primate ES Cell Medium)和ReproStem培养基。
[0018] 在上述方法的特定实施方式中，步骤（ii)进行至少7天，优选进行10至14天，以便 出现足够量的神经上皮样结构。当然，培养方法可进行演化，以便可缩短步骤（ii)。如上面 已经提到的，神经上皮样结构基本由不显著表达多能性相关基因（诸如0CT4)，但表达与眼 区特化相关的转录因子的细胞构成。因此，取决于培养系统，技术人员可选择将步骤(ii)的 结束定义为，至少一些细胞停止表达0CT4和/或开始表达RAX和PAX6的时间。如已经提到的， 该特征描述可通过任意已知的技术，诸如qRT-PCR或免疫染色进行。
[0019] 根据另一方面，本发明涉及一种用于获得RPE细胞的方法，其中，所述方法包括以 下步骤：
[0020] (i)将人类多能干细胞的贴壁培养物放置于促神经培养基中；
[0021 ] (i i)使所述培养物保持在所述促神经培养基中，直至出现色素细胞；
[0022] (iiiRPE)从在步骤(ii)中获得的培养物收集至少一种色素细胞；以及
[0023] ( i VRPE)培养在步骤(i i iRPE)中获得的色素细胞。
[0024] 当进行该方法时，技术人员可检验在步骤（iiiRPE)中收集的细胞表达小眼畸形相 关的转录因子(MITF)和/或Z0-1。如已经提到的，为了实现该目的可使用本领域已知的任意 技术(诸如qRT-PCR和免疫染色）。
[0025] 根据上述用于获得RPE细胞的优选实施方式，在贴壁培养系统中进行步骤（ivRPE) 中的培养。如上面已经提到的，可使用任意的贴壁培养系统。
[0026] 当进行本发明的用于获得RPE细胞的方法时，在至少5天中，在步骤（ivRPE)中扩增 细胞。有利地，步骤（ivRPE)的培养物可维持和扩增数周，以获得大量的RPE细胞:例如，当在 步骤(iiiRPE)中收集约10个斑块的色素细胞，并且将这10个斑块的色素细胞一起铺在新的 3cm 2平皿中时，在3周至4周之后，或如果在培养基中添加 FGF2(每隔2至3天，10ng/ml)，则在 10天至14天之后，获得RPE细胞的基本纯(99 % )的融汇的贴壁培养物。
[0027] 本发明的另一方面是一种用于获得神经视网膜细胞的方法，其中，所述方法包括 以下步骤：
[0028] (i)将人类多能干细胞的贴壁培养物放置于促神经培养基中；
[0029 ] (i i)使所述培养物保持在所述促神经培养基中，直至出现神经上皮样结构；
[0030] ( ii iNR)从在步骤（i i )中获得的培养物，收集来自至少一种神经上皮样结构的细 胞；以及
[0031 ] (i)培养在步骤（i i iNR)中获得的细胞。
[0032]在此，"视网膜神经细胞"包括RGC、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、感光细胞(视 杆细胞和视锥细胞）、穆勒(Milller)胶质细胞，以及这些细胞类型中的任意类型的前体。
[0033] 重要的是，在步骤(ivNR)的过程中，多种视网膜神经细胞不同时出现，其中培养的 细胞在步骤（iv NR)过程中发生分化。因此，取决于步骤（ivNR)的持续时间，将形成不同的细 胞类型。出现顺序如下：首先出现神经节细胞，接着是无长突细胞和水平细胞，光感受器出 现较晚。取决于所需要的细胞类型，技术人员应将培养步骤(iv NR)进行21天至42天。
[0034] 如在下面的实验部分所例示的，根据本发明的这一方面的方法可通过在步骤 (iiiNR)中收集至少一种神经上皮样结构来进行。这可以例如通过从贴壁细胞层机械分离该 结构来进行。然后，将该结构单独或与其它神经上皮样结构一起放置于另一培养容器，诸如 多孔板的孔、皮氏培养皿、培养瓶(flask)等中。
[0035]当进行本方法时，技术人员可有利地检验，在步骤（iiiNR)中收集的细胞共表达眼 区细胞特有的PAX6和RAX。或者，可测量在步骤(iiiNR)中收集的细胞对细胞增殖标记物Ki67 的表达。
[0036]根据特别有利的方面，本发明涉及一种用于获得光感受器前体的方法，该方法包 括上述步骤（i)至（ivNR)，其中步骤（ivNR)进行至少21天，优选进行至少28天。当然，取决于 培养条件的未来发展，可进一步缩短该步骤。
[0037] 在步骤（i VNR)中的任意时间，技术人员可例如通过qRT-PCR，测量培养出的细胞中 的NRL和/或CRX的表达，以检验向光感受器谱系的分化。或者，如下面的实验部分所公开的， 可使用恢复蛋白（REC0VERIN)免疫染色来鉴定光感受器前体。发明人已经证明，CD73与 RE