人参皂苷Rb1和Rd组合及其在制备治疗光感受器细胞死亡相关疾病的药物中的应用
【专利摘要】本发明涉及人参皂苷Rb1和Rd组合在制备治疗视网膜退行性病变药物中的应用。本发明采用视网膜光损伤的小鼠模型，模拟多种视网膜退行性病变发生过程中的共同关键病理环节，研究人参皂苷Rb1和Rd组合对视网膜光损伤小鼠模型的干预效应，结果表明该药物组合能维持视网膜外核层形态、有效防止视网膜外核层退行性损伤、防止视网膜外核层厚度降低，抑制光感受器细胞死亡，拮抗视网膜色素上皮细胞及光感受器细胞氧化应激、有效抑制视网膜损伤相关免疫炎症反应、显著改善视网膜退行性病变。因此人参皂苷Rb1和Rd组合可用于制备治疗包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、Stargardt病、视锥?视杆细胞营养不良、糖尿病视网膜病变等在内的多种视网膜退行性病变药物。
【专利说明】
人参皂苷RbI和Rd组合及其在制备治疗光感受器细胞死亡相 关疾病的药物中的应用
技术领域
[00011本发明涉及医药技术领域，具体地说，涉及人参皂苷Rbl和Rd组合在制备治疗以光 感受器细胞死亡、视网膜色素上皮细胞及光感受器细胞氧化应激为核心病理的包括年龄相 关性黄斑变性、Stargardt病、视锥-视杆细胞营养不良、视网膜色素变性及糖尿病视网膜病 变在内的视网膜退行性病变药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 视网膜退行性疾病是一组以视网膜光感受器细胞氧化应激、死亡及视网膜色素上 皮细胞氧化应激为核心病理改变的，可引起视力障碍甚至失明的眼底病，其包括年龄相关 性黄斑变性、Stargardt病、视锥-视杆细胞营养不良、视网膜色素变性等。此外，光感受器细 胞过度氧化应激是糖尿病视网膜病变发生的重要早期病理环节。针对光感受细胞死亡、视 网膜色素上皮细胞及光感受器细胞氧化应激的治疗对上述相关视网膜退行性病变的发生 发展起到有效的干预作用。
[0003] 年龄相关性黄斑变性是世界范围内最常见的严重危害视力健康甚至致盲的视网 膜退行性病变的主要类型之一。我国流行病学调查显示，50岁以上人群年龄相关性黄斑变 性的患病率近15.5%。人口老龄化直接导致年龄相关性黄斑变性的患病率逐年增加，已构 成严重的社会公共卫生问题。年龄相关性黄斑变性的临床表现一般分为"干性"和"湿性"两 种类型。干性老年黄斑变性，多发生于50岁以上。视力表现为缓慢进行性下降或视物变形， 占年龄相关性黄斑变性的发病的90%以上，目前尚无有效治疗药物。视锥、视杆细胞营养不 良是一组遗传病，由ABCA4等基因突变引起，以视力减退、夜盲、视野缩小、光感受器功能不 良为主要特征，目前尚无有效治疗药物。视网膜色素变性是一种以遗传因素为主导的进行 性、营养不良性的视网膜退行性病变，涉及基因多样，甚至同一基因可在不同患者中表现为 不同的突变。主要表现为慢性进行性视野缺失、视盲、夜盲、视网膜电流图异常、视力障碍甚 至失明，目前尚无有效治疗药物。糖尿病是高血糖引发的重大代谢性疾病之一。截止2012年 9月，全世界范围内约3亿4千7百万的人患有糖尿病。糖尿病已成为仅次于心血管疾病和肿 瘤的第三大非传染性疾病。糖尿病视网膜病变是糖尿病并发症中最为常见的一种，在糖尿 病进程的早期即可出现，在全世界范围内是导致失明的第一位因素。在糖尿病视网膜病变 发病率随糖尿病病程的加长而逐渐升高，10年以上者发病率增至69 %-90 %。病程15年以上 的糖尿病患者约2%因视网膜病变而失明，约10%的患者表现为严重的视力损伤。光感受器 细胞过度氧化应激的现代医学治疗干预尚存在大量空白。
[0004] 人参皂苷Rbl化合物英文简写为Ginsenoside Rbl，中文化学名称简称为人参皂苷 Rbl，其化学结构如式I所示。人参皂苷Rd化合物英文简写为Ginsenoside RcU中文化学名称 简称为人参皂苷Rd，化学结构式如式II所示。
[0005]
[0006] 光感受器细胞是指能够感受光刺激，并产生神经冲动传向中枢神经的感觉细胞， 在外界信息经视觉系统传入大脑过程中扮演着极其重要的角色，光感受器细胞包括视杆细 胞和视锥细胞，其中视杆细胞司暗视觉，视锥细胞司明视觉和精细视觉。光感受器细胞凋亡 的研究证实，光感受器细胞很脆弱，易受环境和光源的损伤，它是中枢神经系统的神经细 胞，一旦受损，不能再生。中国专利201210228744X，公开了柚皮素在制备抗视网膜光感受器 细胞凋亡的药物中的应用，化合物柚皮素对视网膜光感受器细胞的光化学损伤具有保护作 用，且能抗视网膜光感受器细胞的凋亡，可用于制备各种抗视网膜光感受器细胞凋亡药物。 然而，现有文献尚未报道人参皂苷Rbl和Rd组合在治疗以光感受器细胞死亡、视网膜色素上 皮及光感受器细胞氧化应激为核心病理的疾病，包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变 性、Stargardt病、视锥-视杆细胞营养不良、糖尿病视网膜病变等视网膜退行性病变方面的 药理活性。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种预防和/或治疗视网膜退行性 病变的药物组合物。
[0008] 本发明的再一的目的是，提供如上所述药物组合物的用途。
[0009] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0010] -种预防和/或治疗视网膜退行性病变的药物组合物，所述药物由下列原料药制 备而成:人参皂苷Rbl、人参皂苷RcU所述人参皂苷Rbl、人参皂苷Rd的结构式分别如式I及式 II所示。
[0011] 作为一种优选实施方式，所述人参皂苷Rbl与人参皂苷Rd质量比为26:5-10;
[0012]作为一种优选实施方式，所述人参皂苷Rbl与人参皂苷Rd质量比为26:9。
[0013] 作为一种优选实施方式，所述药物组合物包含如上所述治疗有效量的药物组合 物、及其药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
[0014] 作为一种优选实施方式，所述药学上可接受的载体包括眼用溶剂的附加剂、注射 用附加剂、片剂用附加剂、表面活性剂和稳定剂;所述人参皂苷Rbl和Rd组合为所述药物组 合物的主要活性成分。
[0015] 本发明中，所述人参皂苷Rbl和Rd药物组合物可单独使用或者作为活性成分与其 他常规的辅料混合使用。
[0016] 作为一种优选实施方式，所述药物组合物还包括其他治疗眼部疾病的药物。
[0017] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0018] 第一方面，提供如上所述的药物用于治疗和/或预防视网膜退行性病变，所述视网 膜退行性病变是以视网膜光感受器细胞死亡为核心病理，或有视网膜色素上皮细胞或光感 受器细胞的氧化应激参与。
[0019] 作为一种优选实施方式，所述视网膜退行性病变选自：年龄相关性黄斑变性、 Stargardt病、视锥-视杆细胞营养不良、视网膜色素变性和糖尿病视网膜病变。
[0020] 第二方面，提供如上所述的药物组合物在制药或试剂中的用途，所述药物或试剂 用于保护视网膜的形态、结构或功能。
[0021] 第三方面，提供如上所述的药物组合物在制药或试剂中的用途，所述药物或试剂 用于抑制视网膜光损伤。
[0022] 第四方面，提供如上所述的药物组合物在制药或试剂中的用途，所述药物或试剂 用于：
[0023] (1)用于预防或治疗视网膜光感受器细胞死亡；
[0024] (2)用于预防或治疗视网膜色素上皮细胞或光感受器细胞过度氧化应激；
[0025] (3)用于维持视网膜外核层形态；
[0026] (4)用于防止视网膜外核层厚度降低；
[0027] (5)用于抑制视网膜损伤相关免疫炎症反应。
[0028] 作为一种优选实施方式，所述药物组合物作为单一成分或与其他药学上可接受的 成分构成组合物用以制药或试剂。
[0029]本发明中，所述药物组合物人参皂苷Rbl和Rd是发明人在众多人参皂苷中通过大 量实验筛选而得到的，人参皂苷Rbl和Rd的组合具有药效好、用量小的优点。
[0030] 本发明优点在于：
[0031] 本发明采用视网膜光损伤的小鼠模型，模拟多种视网膜退行性病变发生过程中的 共同病理环节，即光感受器细胞死亡、视网膜色素上皮细胞及光感受器细胞氧化应激，对人 参皂苷Rbl和Rd组合抗光感受器细胞死亡、抗视网膜色素上皮细胞氧化应激、抗视网膜损伤 相关免疫炎症反应、防治视网膜退行性病变发生的作用进行了研究，结果表明人参皂苷Rbl 和Rd组合对光损伤诱导的光感受器细胞大量死亡、视网膜色素上皮细胞及光感受器细胞氧 化应激、视网膜光感受器细胞退行性改变及视网膜损伤相关免疫炎症反应具有显著的抑制 作用，能显著治疗并改善视网膜退行性病变，因此可用于制备治疗包括年龄相关性黄斑变 性、视网膜色素变性、Stargardt病、视锥-视杆细胞营养不良、糖尿病视网膜病变等在内的 多种视网膜退行性病变药物。
【附图说明】
[0032]附图1为人参皂苷Rbl和Rd组合治疗对光感受器细胞保护效应的OCT鉴定结果。其 中正常对照小鼠接受50μ130 % DMSO溶剂对照，光损伤模型小鼠接受50μ130 % DMSO溶剂对 照，人参皂苷Rbl和Rd组合组小鼠接受50μ1人参皂苷Rbl和Rd组合治疗，人参皂苷Rbl和Rd剂 量分别为65mg/kg和22.5mg/kg体重，所有治疗均采用腹腔注射给药，除正常对照小鼠外，治 疗后30分钟各组小鼠接受白光照射，光照条件为10,000Lux，持续30分钟。光照后7天，小鼠 分别1%戊巴比妥钠麻醉后散瞳，采用OCT进行视网膜结构成像分析。No light:正常对照， 未接受光照;Lightjehicle:光损伤模型;Light_Rbl&Rd:人参皂苷Rbl和Rd组合治疗及光 照组。
[0033]附图2为人参皂苷Rbl和Rd组合治疗对视网膜保护效应的定量分析，OCT分析完成 后，对ONL厚度进行了定量分析。
[0034]附图3为人参皂苷Rbl和Rd组合治疗对视网膜保护效应的组织病理学研究。所有小 鼠于7天OCT成像后处死，解剖取眼球，4%多聚甲醛固定，进行石蜡包埋和切片。4μπι厚的石 蜡切片进行Η&Ε染色。Η&Ε染色的结果进行显微镜观察拍照及分析。
[0035]附图4为人参皂苷Rbl和Rd组合治疗对视网膜保护效应的免疫组织化学研究。所有 小鼠于7天OCT成像后处死，解剖取眼球，4%多聚甲醛固定，进行石蜡包埋及切片。取4μπι厚 的石錯切片脱錯处理后进行Rhodopsin、opsin M及DAPI免疫染色，分别对视杆细胞外节、视 锥细胞基质鞘以及细胞核进行免疫标记。免疫组织化学结果进行显微镜观察拍照及分析。 [0036]附图5为人参皂苷Rbl和Rd组合抗视网膜色素上皮细胞及光感受器细胞氧化应激 的研究。各组小鼠在光照后1天分别腹腔注射超氧化物阴离子荧光探针DHE，2小时后处死， 解剖取眼球，分离并剔除角膜及晶状体，其余含视网膜部分进行4%多聚甲醛固定，进行冰 冻包埋及切片，取12μπι厚的冰冻切片对视网膜各层的红色荧光结果进行显微镜观察拍照及 分析。
[0037]附图6为人参皂苷Rbl和Rd组合抗视网膜免疫炎症细胞的激活增生的研究。各组小 鼠在光照后3天处死，分别解剖取眼球，分离并剔除角膜及晶状体，其余含视网膜部分进行 4%多聚甲醛固定，进行冰冻包埋及切片，取12μπι厚的冰冻切片进行GFAP、Ibal及DAPI免疫 染色，分别对Muller胶质细胞、小胶质细胞以及细胞核进行免疫标记。免疫组织化学结果进 行显微镜观察拍照及分析。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合【具体实施方式】，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。
[0039] 本发明所用术语"可接受的"，指一个处方组分或活性成分对一般治疗目标的健康 没有过分的有害影响。
[0040] 本发明所用术语"治疗"，包括缓和、抑制或改善疾病的症状或状况;抑制并发症的 产生;改善或预防潜在代谢综合症;抑制疾病或症状的产生，如控制疾病或情况的发展;减 轻疾病或症状;使疾病或症状减退;减轻由疾病或症状引起的并发症，或预防或治疗由疾病 或症状引起的征兆。如本文所用，某一化合物或药物组合物，给药后，可以使某一疾病、症状 或情况得到改善，尤指其严重度得到改善，延迟发病，减缓病情进展，或减少病情持续时间。 无论固定给药或临时给药、持续给药或断续给药，可以归因于或与给药有关的情况。
[0041 ]本发明所用术语"药学上可接受"这里指一种物质，如载体或稀释液，不会使化合 物的生物活性或性质消失，且相对无毒，如，给予个体某物质，不会引起不想要的生物影响 或以有害的方式与任何其含有的组分相互作用。
[0042] 实施例
[0043]本实施例中，通过非侵入性的视网膜眼底断层扫描OCT技术、病理学及免疫组织化 学的研究手段，明确了人参皂苷Rbl和Rd组合对视网膜光损伤小鼠模型的干预效应。研究结 果表明人参皂苷Rbl和Rd组合可有效干预光感受器细胞死亡及视网膜退行性病变的发生， 对视网膜的结构起到显著的保护效应。
[0044] -、方法
[0045] 1.药物
[0046] 人参皂苷Rbl和人参皂苷RcL人参皂苷Rbl购自上海源叶生物科技有限公司， 41753-43-9，Lot#H02J6X4,纯度彡98%。人参皂苷Rd购自上海源叶生物科技有限公司， 52705-93-8，Lot#H02J6X2，纯度彡 98 %。
[0047] 2.动物模型
[0048]采用4-6周龄雌性Balb/c小鼠（斯莱克，上海）进行试验。小鼠随机分为正常对照 组、光损伤模型对照组、人参皂苷Rbl和Rd组合处理，人参皂苷Rb和Rd剂量分别为65mg/kg和 22.5mg/kg体重，光照前30分钟腹腔注射。光照刺激将采用弥散白色冷荧光灯，光照条件设 置为10,000Lux，持续30分钟。光照7天后，分别进行视网膜形态分析。
[0049] 3.视网膜结构分析
[0050] 药物治疗及光照后第7天，1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，托吡卡胺散瞳后，采用小动物 0CT(Phoenix Research Labs)分别对各组小鼠视网膜形态进行观察和比较。
[00511 4 .ONL厚度测定分析
[0052] OCT成像后，从ONH(视神经乳头）出发，对内侧及外侧视网膜ONL厚度以500μπι为间 距进行测量，对各组视网膜结构保护的效应进行定量分析。
[0053] 5.视网膜组织病理
[0054] 在OCT成像后7天，处死小鼠，取眼球，以4%多聚甲醛固定。固定的眼球组织进行石 蜡包埋和切片处理。石蜡切片厚度为4μπι，用于进一步的Η&Ε染色和免疫组织化学染色，包括 Rhodopsin标记视锥细胞、opsin M标记视杆细胞，DAPI进行细胞核标记。在光照后3天，处死 小鼠，取眼球，显微镜下剔除角膜及晶状体，将含视网膜的眼球组织以4%多聚甲醛固定。固 定的眼球组织进行冰冻切片处理。冰冻组织切片厚度为12μπι，用于进一步的免疫组织化学 染色，包括GFAP标记Mill Ier胶质细胞、Ibal标记小胶质细胞，DAPI进行细胞核标记。
[0055] 6.原位氧化应激水平分析
[0056]药物治疗及光照后1天，各组小鼠分别腹腔注射超氧化物阴离子荧光探针DHE，2小 时候处死小鼠，取眼球，分离并剔除角膜及晶状体，将含视网膜部分进行4%多聚甲醛固定。 固定的眼球组织进行冰冻切片处理，冰冻组织切片厚度为12μπι，用于进一步分析视网膜各 层的红色荧光。
[0057] 7.统计分析
[0058] 数据表达为means土S.E，数据分析采用indepedent sample t test方法。ρ〈0·05 定义为统计学显著差异。
[0059] 二、结果
[0060] 1.白光照射诱发小鼠视网膜严重损害
[0061]白光照射后7天，采用OCT对视网膜结构进行成像。如图1所示，白光照射诱发严重 的以光感受器细胞损伤为主要病理表现的视网膜退行性改变，主要表现为白光照射后7天 ONL严重损伤。
[0062] 2.人参皂苷Rbl和Rd组合对视网膜保护效应
[0063]白光照射前30分钟，小鼠接受溶剂或人参皂苷Rbl和Rd组合治疗，人参皂苷Rbl和 Rd剂量分别为65mg/kg和22.5mg/kg体重，体积为50μ1，腹腔注射。光照后7天，采用OCT进行 视网膜结构分析。如图1所示，人参皂苷Rbl和Rd组合治疗均显著抑制了视网膜光损伤的发 生，主要表现为ONL形态维持完好，对ONL厚度的定量分析数据（图2)表明，与未接受光照的 正常小鼠视网膜相比较，光照导致视网膜ONL厚度严重降低(*ρ〈0.05)，而人参皂苷Rbl和Rd 组合治疗对视网膜ONL起到了显著的保护，其各自ONL厚度接近未接受光照的正常小鼠视网 膜ONL厚度(*光损伤模型组与正常对照组比较，ρ〈0.05;#人参皂苷Rbl和Rd组合与光损伤模 型组比较，Ρ〈〇.05)。组织病理学研究结果（图3)表明，未接受光照的正常小鼠视网膜各层结 构完整，而光损伤小鼠表现为ONL严重减少，人参皂苷Rbl和Rd组合治疗组小鼠的视网膜各 层结构与未接受光照组相似。进一步的免疫组织化学研究结果（图4)表明，DAPI标记的ONL 在光损伤小鼠视网膜严重缺失，与正常对照相比，Rhodops in、ops in M仅见残余表达(*ρ〈 0.05)。人参皂苷Rbl和Rd组合治疗组Rhodopsin、opsin M表达模式与正常对照组相似，ONL 未见明显损伤(Rhodopsin:红色，opsin M:红色，DAPI:蓝色）。采用超氧化物阴离子银光探 针DHE进行原位氧化应激水平分析，如图5所示，未接受光照的正常对照小鼠视网膜各层未 见红色荧光信号，光损伤小鼠视网膜的视网膜色素上皮细胞(RPE)和ONL可见显著增强的红 色荧光信号，人参皂苷Rbl和Rd组合治疗组小鼠仅在RPE可见微弱的红色荧光信号。GFAP标 记Muller胶质细胞在未光照的正常对照小鼠中主要表达在神经纤维层（图6)，光损伤模型 小鼠视网膜则表现为ONL、IPL和INL均有明显GFAP表达，人参皂苷Rb 1和Rd组合治疗组的 GFAP表达模式与正常对照组相似；Ibal标记的小胶质细胞在正常小鼠视网膜主要表达于 IPL(图6)光损伤模型的视网膜在0NL、0PL均见大量的阳性Ibal表达，而人参皂苷Rbl和Rd组 合治疗组的Ibal表达模式与正常对照组相似。
[0064]综上所述，通过采用OCT影像学及视网膜组织病理学手段对视网膜光损伤模型的 研究提示人参皂苷Rbl和Rd组合对视网膜光感受器细胞的死亡、视网膜色素上皮细胞及光 感受细胞氧化应激、视网膜损伤相关免疫炎症反应极其导致的视网膜退行性病变的发生具 有显著的防治作用。
[0065]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种预防和/或治疗视网膜退行性病变的药物组合物，其特征在于，所述药物由下列 原料药制备而成:人参皂巧肺1、人参皂巧Rd;所述人参皂巧Rbl、人参皂巧Rd的结构式分别 如式I及式II所示；2. 根据权利要求1所述预防和/或治疗视网膜退行性病变的药物组合物，其特征在于， 所述药物由下列原料药制备而成:人参皂巧肺1、人参皂巧Rd，所述人参皂巧Rbl与人参皂巧 Rd质量比为26:5-10;或所述人参皂巧肺1与人参皂巧Rd质量比为26: 9。3. 根据权利要求1所述预防和/或治疗视网膜退行性病变的药物组合物，其特征在于， 所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求1-2所述的药物组合物、及其药学上可接受的 赋形剂、载体或稀释剂;所述药学上可接受的载体包括眼用溶剂的附加剂、注射用附加剂、 片剂用附加剂、表面活性剂和稳定剂;所述人参皂巧Rbl和Rd组合为所述药物组合物的主要 活性成分。4. 根据权利要求1所述预防和/或治疗视网膜退行性病变的药物组合物，其特征在于， 所述药物组合物还包括其他治疗眼部疾病的药物。5. 权利要求1-4任一所述的药物组合物在制药中的用途，其特征在于，所述药物用于治 疗和/或预防视网膜退行性病变，所述视网膜退行性病变是W视网膜光感受器细胞死亡为 核屯、病理，或有视网膜色素上皮细胞或光感受器细胞的氧化应激参与。6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述视网膜退行性病变选自：年龄相关性 黄斑变性、Stargar化病、视锥-视杆细胞营养不良、视网膜色素变性和糖尿病视网膜病变。7. 权利要求1-4任一所述的药物组合物在制药或试剂中的用途，其特征在于，所述药物 或试剂用于保护视网膜的形态、结构或功能。8. 权利要求1-4任一所述的药物组合物在制药或试剂中的用途，其特征在于，所述药物 或试剂用于抑制视网膜光损伤。9. 权利要求1-4任一所述的药物组合物在制药或试剂中的用途，其特征在于，所述药物 或试剂用于： (1) 用于预防或治疗视网膜光感受器细胞死亡； (2) 用于预防或治疗视网膜色素上皮细胞或光感受器细胞过度氧化应激； (3) 用于维持视网膜外核层形态； (4) 用于防止视网膜外核层厚度降低； (5) 用于抑制视网膜损伤相关免疫炎症反应。10.根据权利要求5-9所述的用途，其特征在于，所述药物组合物作为单一成分或与其 他药学上可接受的成分构成组合物用W制药或试剂。
【文档编号】A61P37/02GK106074585SQ201610494685
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】陈瑜, 张腾, 卞敏娟, 崔金刚, 王培伟, 于心同, 李黎, 杜宵烨, 丁李立强
【申请人】上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院