本发明涉及人参皂苷rd的制备方法，尤其是酶催化转化人参皂苷rb1制备人参皂苷rd的方法。
背景技术：
：人参皂苷rd是一种特异性受体操纵钙离子通道抑制剂，具有局灶性脑缺血治疗作用、再灌注损伤治疗作用、对shrsp脑卒中的防治作用、对脑神经细胞死亡与凋亡的保护和治疗作用、对脑血管及脑血流量的作用、对急性脑缺血能量代谢的作用、对低压耐缺氧的作用及对5-ht引起的椎基底动脉的收缩反应的降低作用，临床用药需求量大。目前人参皂苷rd主要从中药三七等药材提取分离制得，其产量受到药材资源的极大制约。由于人参皂苷类成分难于采用化学方法全合成，利用来源易得的人参皂苷成分制备稀有人参皂苷的生物转化法受到人们的关注。文献研究表明，生物转化法具有反应条件温和、酶系广泛等优点，然而生物转化法也存在需要事先分离所需的菌株或者相应的酶、底物对酶有抑制作用、转化周期长、转化率不理想等不足。现有生物转化法技术还难以实现人参皂苷rd的规模化制备，并且人参皂苷rb1和人参皂苷rd的溶解和萃取大多采用醇类有机溶剂，有机溶剂能够导致酶的变性失活，从而使得酶溶液无法多次反复使用，本发明通过将人参皂苷rb1固定于大孔树脂上，再加入含酶的水溶液，使酶催化转化发生在大孔树脂表面，酶催化转化过程不接触有机溶剂，不仅提高了反应效率，而且酶溶液可反复利用，为人参皂苷rd的规模化制备提供了新的方法。技术实现要素：本发明针对现有人参皂苷rd天然来源以及难于规化模制备不足的问题，使人参皂苷rb1的酶催化转化过程发生在大孔树脂表面，产生了非常显著的有益效果。为解决上述问题，本发明采用如下技术方案。一种人参皂苷rd的酶催化转化制备方法，包括如下步骤：取富含人参皂苷rb1的溶液，加入大孔树脂进行静态吸附，使人参皂苷rb1充分吸附于大孔树脂上，再加入含酶的水溶液，在一定温度和ph下水解一定时间，滤过，分别以一定量的清洗剂、洗脱剂清洗和洗脱大孔树脂,制得人参皂苷rd溶液，经hplc法检测，人参皂苷rb1转化率84.04-97.38%。所述的富含人参皂苷rb1的溶液为西洋参、人参、三七的提取液，优选人参皂苷rb1的溶液。所述的大孔树脂为d101和da-201组成的大孔树脂组合物，其质量比为1:1。所述的酶液为纤维素酶和果胶酶的混合物，纤维素酶与果胶酶的质量比为1:1～1:2。所述加入含酶的水溶液，使溶液中酶的浓度达到100u/ml以上。所述提取溶液的ph为3～12，提取温度为80℃～85℃，水解时间90分钟～100分钟。所述的清洗剂、洗脱剂为含水乙醇，其中清洗剂为0～30%含水乙醇，洗脱剂为30～80%含水乙醇；优选的清洗剂为30%含水乙醇，洗脱剂为70%含水乙醇。所述的hplc法检测条件为:键合硅胶c18柱,流动相为乙腈水溶液（30：70）,等度洗脱。本发明通过将人参皂苷rb1固定于大孔树脂上，再加入含酶的水溶液，使酶催化转化发生在大孔树脂表面，酶催化转化过程不接触有机溶剂，不仅提高了反应效率，而且酶溶液可反复利用，克服了现有人参皂苷rd天然来源以及难于规化模制备的不足，为人参皂苷rd的规模化制备提供了新的方法。具体实施方式实施例1取人参皂苷rb120mg的溶液50ml，加入5ml预处理好的大孔树脂进行静态吸附，使人参皂苷rb1充分吸附于大孔树脂上，再加入含酶的水溶液，使酶活力大于100u/ml，用盐酸调ph为2，温度控制在40℃下进行酶解，水解60分钟后，滤过，分别以一定量的20%的乙醇清洗，用50%的乙醇洗脱，清洗剂洗脱剂清洗和洗脱大孔树脂,洗脱液浓缩至干，用95%的乙醇超声溶解并定容至10ml。0.45µm的滤头过滤，进样10µl，hplc测定，分别计算人参皂苷rb1和人参皂苷rd含量、转化率和反应收率。实施例2与实施例1的区别在于：取西洋参药材粉末500mg加入到25ml的具塞试管中，用盐酸调ph为4，温度控制在40℃下进行酶解，水解120分钟。实施例3与实施例2的区别在于：用盐酸调ph为6，温度控制在40℃下进行酶解，水解180分钟。实施例4与实施例3的区别在于：用盐酸调ph为4，温度控制在50℃下进行酶解，水解60分钟。实施例5与实施例4的区别在于：用盐酸调ph为6，温度控制在50℃下进行酶解，水解120分钟实施例6。与实施例2的区别在于：用盐酸调ph为2，温度控制在50℃下进行酶解，水解180分钟。实施例7与实施例1的区别在于：用盐酸调ph为2，温度控制在60℃下进行酶解，水解60分钟。实施例8用盐酸调ph为6，温度控制在60℃下进行酶解，水解60分钟。实施例9用盐酸调ph为4，温度控制在60℃下进行酶解，水解180分钟。实施例10人参皂苷的hplc检测色谱条件:c18柱（型号venusilxbpc18柱，长25cm，内径4.6mm，填料粒径5µm），流动相为乙腈-水溶液（30：70）,检测波长203nm。取人参皂苷rb1、人参皂苷rd适量，精密称定，分别置2ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含人参皂苷rb11.0mg、人参皂苷rd1.0mg的对照品溶液。另取制得的人参皂苷rd1.0mg，精密称定，置2ml量瓶中，加甲醇溶解定容作为供试品溶液。微孔滤膜过滤，进样测定，外标一点法计算含量。实施例1-9所制得的人参皂苷rd按照实施例10测定，结果见表1。表1实施例中人参皂苷含量测定结果样品人参皂苷rb1投料量（mg）人参皂苷rb1测得量（mg）转化率（%）人参皂苷rd测得量（mg）反应收率（%）实施例1201.20637293.9714.4962888.83实施例2203.09188484.548.35261756.89实施例3202.01780389.918.45273754.13实施例4202.37903788.108.32871954.43实施例5200.5232697.388.76558851.83实施例6201.04048994.8013.9383184.66实施例7200.55734197.2119.355104.65实施例8203.1924884.0415.06559103.22实施例9200.84848495.7617.9069107.67当前第1页12