产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法
【专利摘要】本发明涉及构建产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株及其构建方法。脂肪酶在酶催化反应中,反应如在油水界面促进酯水解,而在有机相中可以酶促合成和酯交换。因此可以以地沟油或工业废油和低碳醇为原料用来合成生物柴油。通过将重组脂肪酶Lip14基因转入毕赤酵母X33中从而大量发酵脂肪酶。通过以对硝基苯基棕榈酸酯为底物测定脂肪酶对长链脂类的水解能力,对硝基苯基月桂酸酯和对硝基苯基辛酸酯测定脂肪酶对中链脂类的水解能力,对硝基苯基丁酸酯测定脂肪酶对短链脂肪酶的水解能力。确定其对中长短链脂类的水解活性。为将其在催化生产生物柴油的实验中奠定了基础。
【专利说明】
产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法
技术领域
[0001] 本发明设及构建一株产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶在酶催化反应中，反应如在油水界面促进醋水解，而在有机相中可W酶促 合成和醋交换。因此可地沟油或工业废油和低碳醇为原料用来合成生物柴油。
[0003] 生物柴油的基本原料是地沟油或工业废弃油，可W周而复始得使用、绵延不绝，彻 底改变了石油资源采一桶少一桶的局面。开发生物柴油对实现经济可持续发展，推进能源 替代，减轻环境压力，增强国家战略安全具有深远意义。且生物柴油不含二氧化硫、铅、面等 有害物，燃烧时排出的有害物比普通柴油大大减少，有利于环境保护环境，作为绿色替代燃 料。目前生物柴油的生产主要是用化学法，即动植物油脂与甲醇在高强度酸或碱催化下制 备，但存在工艺复杂、醇消耗量大、产物不易回收、环境污染大等缺点。
[0004] 酶法生产生物柴油是利用脂肪酶的催化作用，实现油脂与低碳醇的醋交换反应。 酶法生产柴油对原料要求低，且反应条件溫和、工艺环保、产物与原料分离简单，逐渐成为 生物柴油工业化生产的主流发展方向。但是目前脂肪酶大多数为进口，价格昂贵且转化率 并不高，使得生物柴油的升本过高。
【发明内容】
[0005] 本发明是为解决脂肪酶大多数为进口，价格昂贵导致生物柴油成本过高的问题， 提供产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，W及脂肪酶的发酵并测定其对短、中长链脂类的 水解活性。
[0006] 本发明产脂肪酶工程菌株的细胞为毕赤酵母X33,出芽生殖，菌落呈圆形，颜色为 乳白色，表面光滑，基因工程构建产脂肪酶基因的重组子在含有橄揽油的BMMY培养基上有 明显的水圈，在含有罗丹明B的BMMY培养基上在紫外光照射下有明显的巧光。
[0007] 1.产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于按W下步骤进行： 一、脂肪酶基因来源于假丝酵母化ndida SP.99-125基因组;通过提取试剂盒提取假丝酵母 Candida sp.99-125基因组；二、Lipl4基因的PCR扩增：W步骤一提取的假丝酵母Candida sp.99-125基因组为模板进行PCR扩增，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回 收试剂盒进行纯化回收，获得目的基因 Lipl4;PCR扩增的正向引物为5'- GGAATTCGTTCTATCTACAGTCATTGGAGAATGGT-3'，反向引 物为5'- GCTCTAGAAAAAAGATGGTGGAACCGTTGG-3 ' S、重组表达载体 pPICZa-Lipl4 的构建:将步骤二纯 化的Lipl4基因 WEcoR I和Xba I进行双酶切，再通过PCR回收试剂盒进行纯化回收，表达载 体pPICZaAWEcoR巧日Xba I进行双酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒进行纯化 回收;将两者的回收产物用T4连接酶于16°C过夜连接，得到重组质粒pPICZa-Lipl4;并将重 组质粒转入ToplO感受态细胞中进行重组质粒的扩增并挑取测序正确的单菌落进行甘油保 存；四、产脂肪酶基因工程菌株的构建:将保存于ToplO的重组质粒扩增并通过质粒提取试 剂盒提取，并通过限制性内切酶Pme I对重组质粒进行酶切线性化;线性化酶切产物通过乙 醇沉淀回收，再W无菌水溶解，接着与毕赤酵母X33感受态细胞混合进行电击转化，然后将 菌液涂布于含有Zeocin抗性的YPDS培养基上，30°C恒溫培养箱培养至长出菌落，随机挑取 YPDS培养基上的单菌落进行菌落PCR，标记有目的基因 Lipl4条带的单菌落;将单菌落W种 田的方式分别接于含有橄揽油和罗丹明B的BMMY固体培养基中，每天在3(TC培养箱中W甲 醇诱导培养，诱导5天后，在含有橄揽油的BMMY固体培养基发现接种的菌落周围出现肉眼可 见的水圈，在含有罗丹明B的BMMY固体培养基发现菌落在紫外光照射条件下出现肉眼可见 的巧光，即证基因工程菌株构建成功;五、脂肪酶的表达及脂肪酶对短中长链脂类的水解能 力：将有脂肪酶活力的基因工程菌株接于BMMY诱导培养基中，30°C摇床诱导培养5天，离屯、 取上清液，W对硝基苯基栋桐酸醋为底物测定脂肪酶对长链脂类的水解能力，对硝基苯基 月桂酸醋和对硝基苯基辛酸醋测定脂肪酶对中链脂类的水解能力，对硝基苯基下酸醋测定 脂肪酶对短链脂肪酶的水解能力。
[000引 2.PCR扩增体系如下：5XPs Buffer 10iU，dNTP 1化1，上游引物化1，下游引物化 1，假丝酵母Candida sp.99-125基因组化 1，DNA polymerase 0.扣 1，双蒸水30.SiilJCR程 序设置为:94 °C预变性3分钟，98 °C变性10秒，57 °C退火15秒，72 °C延伸2分钟，再重复28次， 共29个循环，延伸10分钟，4 °C保存。
[0009] 3.根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤= 的目的基因和质粒WEcoR I和Xba I分别进行双酶切的体系如下:Lipl4基因、pPICZaA质粒 分别43iil，限制性内切酶Xbal化1，限制性内切酶EcoRI化laOXBuffer M祉1，双蒸水23 yl。酶切反应条件:37°C，2h。
[0010] 4.根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤= 中连接反应体系如下:Lipl4双酶切回收产物化l，pPICZaA双酶切回收产物化l，Ligasel0X Buffer 2iil，T4DNA Ligase连接酶0.化1，双蒸水12.5iil。
[0011] 5.根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四 中的酶切体系如下:pPICZa-Lipl4重组质粒43iil，限制性内切酶化el化1，双蒸水27iil。酶 切之后，于65°C放置15min使内切酶失活。
[0012] 6.根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四 中的乙醇沉淀步骤如下：
[0013] (1)将上一步骤所得DNA溶液取70iil加入化1乙酸钢溶液充分混匀；乙酸钢溶液浓 度为3111〇1/1，抑=5.2
[0014] (2)加入化 1的 Dr .GenTLEPrecipitationhirier,均匀混合；
[0015] (3)加入17化1的无水乙醇，充分混合均匀；
[0016] (4)在12,000巧1114°[条件下离屯、15111；[]1;
[0017] (5)弃上清液，留白色沉淀；
[0018] (6)加入17化1的浓度为70%的乙醇，同样条件下离屯、5min;
[0019] (7)弃上清液并干燥沉淀。
[0020] 7 .所述构建方法所构建的产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株，其特征在于，脂肪 酶Lipl4对短、中和长链脂类的水解能力测定方法如下：
[0021] 将对硝基苯基醋溶于DMS0中，加入1 XPBS配成lOmM的混合物，在96孔板中每个孔 加入190ul lOmM对硝基苯基醋，再加入1ml发酵液，在40°C条件下反应lOmin后，因为对硝基 苯基苯酪显黄色，故测在波长为405nm条件下的光吸收。；分别W对硝基苯基栋桐酸醋为底 物测定脂肪酶对长链脂类的水解能力，W对硝基苯基月桂酸醋和对硝基苯基辛酸醋为底物 测定脂肪酶对中链脂类的水解能力，W对硝基苯基下酸醋为底物测定脂肪酶对短链脂类的 水解能力。W纯品对硝基苯酪做标准曲线，酶活化)定义为:40°C下1ml酶液每分钟水解底物 产生对硝基苯酪的皿〇1数。
[0022] 脂肪酶的表达及脂肪酶对短中长链脂类的水解能力:将有脂肪酶活力的基因工程 菌株接于BMMY诱导培养基中，30°C摇床诱导培养5天，离屯、取上清液，W对硝基苯基栋桐酸 醋为底物测定脂肪酶对长链脂类的水解能力，对硝基苯基月桂酸醋和对硝基苯基辛酸醋测 定脂肪酶对中链脂类的水解能力，对硝基苯基下酸醋测定脂肪酶对短链脂肪酶的水解能 力。
[0023] 本发明的有益效果；
[0024] 本发明构建的产脂肪酶毕赤酵母基因工程菌株生物发酵产生的脂肪酶Lipl4对长 链脂类的水解酶活为559.26U/(ml*min)，中链脂类水解酶活分别为310.14U/(ml*min)和 364.89U/(ml*min)，短链脂类水解酶活为274.59U/(ml*min)，比未导入重组质粒的X33酵母 的酶活有着显著的提高。
【具体实施方式】
[0025] 1.产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于按W下步骤进行： 一、脂肪酶基因来源于假丝酵母化ndida SP.99-125基因组;通过提取试剂盒提取假丝酵母 Candida sp.99-125基因组；二、Lipl4基因的PCR扩增：W步骤一提取的假丝酵母Candida sp.99-125基因组为模板进行PCR扩增，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回 收试剂盒进行纯化回收，获得目的基因 Lipl4;PCR扩增的正向引物为5'- GGAATTCGTTCTATCTACAGTCATTGGAGAATGGT-3'，反向引 物为5'- GCTCTAGAAAAAAGATGGTGGAACCGTTGG-3 ' S、重组表达载体 pPICZa-Lipl4 的构建:将步骤二纯 化的Lipl4基因 WEcoR I和Xba I进行双酶切，再通过PCR回收试剂盒进行纯化回收，表达载 体pPICZaAWEcoR巧日Xba I进行双酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒进行纯化 回收;将两者的回收产物用T4连接酶于16°C过夜连接，得到重组质粒pPICZa-Lipl4;并将重 组质粒转入ToplO感受态细胞中进行重组质粒的扩增并挑取测序正确的单菌落进行甘油保 存；四、产脂肪酶基因工程菌株的构建:将保存于ToplO的重组质粒扩增并通过质粒提取试 剂盒提取，并通过限制性内切酶Pme I对重组质粒进行酶切线性化;线性化酶切产物通过乙 醇沉淀回收，再W无菌水溶解，接着与毕赤酵母X33感受态细胞混合进行电击转化，然后将 菌液涂布于含有Zeocin抗性的YPDS培养基上，30°C恒溫培养箱培养至长出菌落，随机挑取 YPDS培养基上的单菌落进行菌落PCR，标记有目的基因 Lipl4条带的单菌落;将单菌落W种 田的方式分别接于含有橄揽油和罗丹明B的BMMY固体培养基中，每天在3(TC培养箱中W甲 醇诱导培养，诱导5天后，在含有橄揽油的BMMY固体培养基发现接种的菌落周围出现肉眼可 见的水圈，在含有罗丹明B的BMMY固体培养基发现菌落在紫外光照射条件下出现肉眼可见 的巧光，即证基因工程菌株构建成功;五、脂肪酶的表达及脂肪酶对短中长链脂类的水解能 力：将有脂肪酶活力的基因工程菌株接于BMMY诱导培养基中，30°C摇床诱导培养5天，离屯、 取上清液，w对硝基苯基栋桐酸醋为底物测定脂肪酶对长链脂类的水解能力，对硝基苯基 月桂酸醋和对硝基苯基辛酸醋测定脂肪酶对中链脂类的水解能力，对硝基苯基下酸醋测定 脂肪酶对短链脂肪酶的水解能力。
[0026] Prime STAR PCR扩增体系 [00271
[
[0029] 脂肪酶基因 PCR程序设置
[0mol
[0034] 酶切反应条件:37°C，2h。
[0035] T4连接酶体系
[0mAl
[0
[0
[0039] 酶切之后，于65°C放置15min使内切酶失活。
[0040] 脂肪酶Lipl4对短、中和长链脂类的水解能力测定方法如下：
[0041] 将对硝基苯基醋溶于DMS0中，加入1 XPBS配成lOmM的混合物，在96孔板中每个孔 加入190ul lOmM对硝基苯基醋，再加入1ml发酵液，在40°C条件下反应lOmin后，因为对硝基 苯基苯酪显黄色，故测在波长为405nm条件下的光吸收。分别W对硝基苯基栋桐酸醋为底物 测定脂肪酶对长链脂类的水解能力，W对硝基苯基月桂酸醋和对硝基苯基辛酸醋为底物测 定脂肪酶对中链脂类的水解能力，W对硝基苯基下酸醋为底物测定脂肪酶对短链脂类的水 解能力。W纯品对硝基苯酪做标准曲线，酶活化)定义为:40°C下1ml酶液每分钟水解底物产 生对硝基苯酪的umol数。
[0042] 步骤四中所述
[00创 l、YPD-Zeocin:2%(w/v)酵母浸粉，l%(w/v)牛肉蛋白腺，2%(w/v)D-葡萄糖，灭 菌后等溫度降到60°CW下时加入一定量的Zeocin抗生素；
[0044] 2、YPDS固体培养基：2 % (w/v)酵母浸粉，1 % (w/v)牛肉蛋白腺，2 % (w/v)D-葡萄 糖，IM山梨醇，1.5%(w/v)琼脂；
[0045] 4、BMGY培养基：1 % (w/v)酵母浸粉，2% (w/v)蛋白腺，1 % (w/v)甘油，lOOmM憐酸缓 冲液抑 6.0，1.34% (w/v)YNB，4 X 10-5% (w/v)生物素
[0046] 5、BMMY培养基：1 % (w/v)酵母浸粉，2% (w/v)蛋白腺，1 % (v/v)甲醇，lOOmM憐酸缓 冲液抑 6.0，1.34%(w/v)YNB，4X10-5%(w/v)生物素。
[0047] 6、BMMY-橄揽油平板：l%(w/v)酵母浸粉，2%(w/v)蛋白腺，l%(v/v)甲醇，lOOmM 憐酸缓冲液抑 6.0，1.34%(w/v)YNB;4x 10-5%(w/v)生物素；1.5%(w/v)琼脂，0.5%(v/ V)橄揽油。
[004引 7、BMMY-罗丹明平板:在BMMY平板中加入Img/L的罗丹明B(罗丹明B可事先配成100 X的母液）。
[0049] 对硝基苯酪法测定脂肪酶酶活：
[0050] 酶活定义为:40°C下1ml酶液每分钟水解底物产生对硝基苯酪的mol数。底物根据 对不同链长分别选择长链脂类为对硝基苯基栋桐酸醋，中链脂类为对硝基苯基月桂酸醋和 对硝基苯基辛酸醋，短链脂类为对硝基苯基下酸醋。根据吸光值增长速率的初速度和对硝 基苯酪(p-nitro地enol)的毫摩尔吸光系数（e = 9.6mM"^cnf 1)计算酶活。
[0化1 ]
[0052] 1:光路长度(cm) ;t:反应时间(min) ;Vt:反应的总体积(mL) ;Vs:样品的体积(mL)。
【主权项】
1. 产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于按以下步骤进行:一、月旨 肪酶基因来源于假丝酵母Candida sp. 99-125基因组；通过提取试剂盒提取假丝酵母 Candida sp.99-125基因组；二、Lipl4基因的PCR扩增：以步骤一提取的假丝酵母Candida sp.99-125基因组为模板进行PCR扩增，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回 收试剂盒进行纯化回收，获得目的基因 Lipl4 ;PCR扩增的正向引物为5 ' -GGAATTCGTTCTATCTACAGTCATTGGAGAATGGT-3,，反向引物为 5'-GCTCTAGAAAAAAGATGGTGGAACCGTTGG-3 ' 三、重组表达载体 pPICZa-Lipl4 的构建:将步骤二纯 化的Lipl4基因以EcoR I和Xba I进行双酶切，再通过PCR回收试剂盒进行纯化回收，表达载 体pPICZaA以EcoR I和Xba I进行双酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒进行纯化 回收;将两者的回收产物用T4连接酶于16°C过夜连接，得到重组质粒pPICZa-Lipl4;并将重 组质粒转入ToplO感受态细胞中进行重组质粒的扩增并挑取测序正确的单菌落进行甘油保 存；四、产脂肪酶基因工程菌株的构建:将保存于ToplO的重组质粒扩增并通过质粒提取试 剂盒提取，并通过限制性内切酶Pme I对重组质粒进行酶切线性化;线性化酶切产物通过乙 醇沉淀回收，再以无菌水溶解，接着与毕赤酵母X33感受态细胞混合进行电击转化，然后将 菌液涂布于含有Zeocin抗性的YPDS培养基上，30°C恒温培养箱培养至长出菌落，随机挑取 YPDS培养基上的单菌落进行菌落PCR，标记有目的基因 Lipl4条带的单菌落;将单菌落以种 田的方式分别接于含有橄榄油和罗丹明B的BMMY固体培养基中，每天在30°C培养箱中以甲 醇诱导培养，诱导5天后，在含有橄榄油的BMMY固体培养基发现接种的菌落周围出现肉眼可 见的水圈，在含有罗丹明B的BMMY固体培养基发现菌落在紫外光照射条件下出现肉眼可见 的荧光，即证基因工程菌株构建成功;五、脂肪酶的表达及脂肪酶对短中长链脂类的水解能 力：将有脂肪酶活力的基因工程菌株接于BMMY诱导培养基中，30°C摇床诱导培养5天，离心 取上清液，以对硝基苯基棕榈酸酯为底物测定脂肪酶对长链脂类的水解能力，对硝基苯基 月桂酸酯和对硝基苯基辛酸酯测定脂肪酶对中链脂类的水解能力，对硝基苯基丁酸酯测定 脂肪酶对短链脂肪酶的水解能力。2. 根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，PCR扩增体系如下：5XPs Buffer 10yl，dNTP 10μ1，上游引物2μ1，下游引物2μ1，假丝酵母Candida sp.99-125基因组 ΙμL，DNA polymerase 0 · 5μ1，双蒸水30 · 5μ11CR程序设置为：94°C预变性3分钟，98°C变性 10秒，57°C退火15秒，72°C延伸2分钟，再重复28次，共29个循环，延伸10分钟，4°C保存。3. 根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤三的目 的基因和质粒以EcoR I和Xba I分别进行双酶切的体系如下:Lipl4基因 、pPICZa A质粒分 另Ι」43μ1，限制性内切酶Xbal 3μ1，限制性内切酶EcoRI 3yl，10XBuffer Μ 8μ1，双蒸水23μ 1。酶切反应条件:37°(：，211。4. 根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤三中连 接反应体系如下：Lipl4双酶切回收产物4yl，pPICZaA双酶切回收产物lyl，Ligase 10Χ Buffer 2yl，T4DNA Ligase连接酶0·5μ1，双蒸水12.5μ1。5. 根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中的 酶切体系如下:pPICZa-Lipl4重组质粒43μ1，限制性内切酶Pmel 2μ1，双蒸水27μ1。酶切之 后，于65°C放置15min使内切酶失活。6. 根据权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中的 乙醇沉淀步骤如下： (1) 将上一步骤所得DNA溶液取70μ1加入7μ1乙酸钠溶液充分混匀；乙酸钠溶液浓度为 3mol/L,pH=5.2 ； (2) 加入 4μ1 的 Dr .GenTLEPrecipitationCarrier,均勾混合； (3) 加入175μ1的无水乙醇，充分混合均匀； (4) 在 12，000rpm4°C 条件下离心 15min; (5) 弃上清液，留白色沉淀； (6) 加入175μ1的浓度为70%的乙醇，同样条件下离心5111；[11; (7) 弃上清液并干燥沉淀。7.测定如权利要求1所述构建方法所构建的产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌株，其特 征在于脂肪酶Lipl4对短、中和长链脂类的水解能力测定方法如下：将对硝基苯基酯溶于 DMS0中，加入1XPBS配成10mM的混合物，在96孔板中每个孔加入190ull0mM对硝基苯基酯， 再加入lml发酵液，在40°C条件下反应lOmin后，在波长为405nm条件下的光吸收;分别以对 硝基苯基棕榈酸酯为底物测定脂肪酶对长链脂类的水解能力，以对硝基苯基月桂酸酯和对 硝基苯基辛酸酯为底物测定脂肪酶对中链脂类的水解能力，以对硝基苯基丁酸酯为底物测 定脂肪酶对短链脂类的水解能力；以纯品对硝基苯酚做标准曲线，酶活定义为:40°C下lml 酶液每分钟水解底物产生对硝基苯酚的umol数。
【文档编号】C12N15/81GK106047917SQ201610589755
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月25日 公开号201610589755.9, CN 106047917 A, CN 106047917A, CN 201610589755, CN-A-106047917, CN106047917 A, CN106047917A, CN201610589755, CN201610589755.9
【发明人】范立海, 王在宇, 张子剑, 谭天伟
【申请人】北京化工大学