用于膀胱癌检测的逻辑与门基因线路的构建方法
【技术领域】
[0001] 本申请涉及一种用于膀胱癌检测的逻辑与门基因线路的构建方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。目前的诊治 手段由于缺乏膀胱癌高特异性靶点等原因，不能有效地通过单靶点区分正常细胞和膀胱癌 细胞，急需研发对膀胱癌更加特异的精准治疗方法。膀胱癌系统生物学和基因组学的研究， 使人们有可能对肿瘤细胞基因突变以及潜在的治疗靶点有比较全面的认识和了解。
【发明内容】
[0003] 本发明提供一种新的用于检测膀胱癌的试剂盒。
[0004] 本发明提供一种用于膀胱癌检测的逻辑与门基因线路的构建方法，包括：
[0005] a)用PCR方法扩增序列：如SEQ ID NO: 1所示的hUPII启动子序列，如SEQ ID NO: 2所示的氨酰tRNA合成酶AcKRS基因序列，SEQ ID NO: 3所示的hTERT启动子序列，如 SEQ ID N0:4所示的tRNA序列，如以SEQ ID N0:5所示的pCMV6-AC-GFP质粒序列为模板 PCR 扩增 SEQ ID N0:6 所示的 pCMV6-AC-GFP37TAG 质粒序列；
[0006] b)将所述hUPII启动子与AcKRS基因，所述hTERT启动子与tRNA分别连接到如 SEQ ID N0:7所示的psiCHECK-2质粒中构建重组载体；
[0007] c)将所述重组载体与所述pCMV6-AC-GFP37TAG质粒，共同转入膀胱癌细胞，构建 出所述基因线路。
[0008] 所述膀胱癌细胞是5637。所述步骤c)中，将含有UAG终止密码子的效应基因一起 转入所述膀胱癌细胞。所述效应基因是绿色荧光蛋白GFP。
[0009] -种尿道上皮细胞特异启动子hUPII与一种能在真核细胞编码乙酰化赖氨酸的 氨酰tRNA合成酶AcKRS组成的DNA序列，hUPII序列如SEQ ID NO: 1所示，AcKRS序列如 SEQ ID NO:2 所示。
[0010] -种癌症细胞特异启动子hTERT与一种能在真核细胞编码乙酰化赖氨酸的tRNA 组成的DNA序列，hTERT序列如SEQ ID NO: 3所示，tRNA序列如SEQ ID NO:4所示。
[0011] 当将上述基因线路转入膀胱癌细胞，并加入N-乙酰-L-赖氨酸时，绿色荧光蛋白 只在膀胱癌细胞中表达，而在正常细胞中不表达。
[0012] 一种膀胱癌检测试剂盒，包括序列如SEQ ID N0:8所示的psiCHECK-2-hUPII/ AcKRS重组载体、序列如SEQ ID NO: 9所示的psiCHECK-2-hTERT/tRNA重组载体、序列如SEQ ID NO: 6所示pCMV6-AC-GFP37TAG质粒。所述的试剂盒，还包括含有UAG终止密码子的效应 基因。所述效应基因是绿色荧光蛋白GFP。
[0013] 本发明的有益效果是：本发明将乙酰化赖氨酸氨酰tRNA合成酶AcKRS基因、乙酰 化赖氨酸tRNA分别构建在膀胱癌特异性启动子下游，并与含有UAG终止密码子的效应基因 绿色荧光蛋白GFP -起转入细胞，构建的逻辑与门乙酰化赖氨酸基因线路只在膀胱癌细胞 中启动乙酰化赖氨酸氨酰tRNA合成酶、乙酰化赖氨酸tRNA转录，在外源加入N-乙酰-L-赖 氨酸的条件下，表达全长的绿色荧光蛋白GFP ;而在其他类型细胞中，膀胱癌特异启动子无 法同时启动乙酰化赖氨酸tRNA和乙酰化赖氨酸氨酰tRNA合成酶的转录，绿色荧光蛋白GFP 基因翻译时会在UAG终止密码子处终止，不能表达全长的绿色荧光蛋白GFP ;从而可以通过 比较细胞绿色荧光强弱或者Western blot检测GFP表达的方法，区分膀胱癌细胞和正常细 胞。
【附图说明】
[0014] 图1是跑胶检测重组载体构建情况，其中，字符1代表Bglll/Xhol双酶切后的 psiCHECK-2-hUPII/AcKRS 重组载体，箭头所指 hUPII/AcKRS 的片段；2 代表 Bglll/Xhol 双 酶切后的psiCHECK-2-hTERT/tRNA重组载体，箭头所指hTERT/tRNA的片段；3代表PCR定 点突变的PCMV6-AC-GFP37TAG重组载体，箭头所指pCMV6-AC-GFP37TAG的片段；
[0015] 图2是基因线路转入细胞后，用荧光显微镜观察含有UAG终止密码子的GFP在正 常膀胱上皮细胞SV-HUC-I和膀胱癌细胞5637中的表达情况，字符1代表正常细胞，2代表 膀胱癌细胞；
[0016] 图3是Western blot检测GFP含有UAG终止密码子的GFP在正常膀胱上皮细胞 SV-HUC-I和膀胱癌细胞5637中的表达情况，字符1代表正常细胞样品，2代表膀胱癌细胞 样品。
【具体实施方式】
[0017] L psiCHECK-2-hUPII/AcKRS 重组载体的构建
[0018] 扩增MJPII启动子序列SEQ ID N0:1，正向插入psiCHECK-2质粒SEQ ID N0:7的 BgIII和Nhe 1酶切位点之间，即替换该载体中原有的启动子SV40。将AcKRS基因序列SEQ ID NO: 2扩增出来，并装载入突变的质粒psiCHECK-2-hUPII的NheI和XhoI之间。将AcKRS和 psiCHECK-2-hUPII酶切产物与T4连接酶混合，16度连接过夜，将酶连产物化转ToplO感受 态细胞，37度培养过夜后，挑单克隆送样测序，选取测序成功的psiCHECK-2-hUPII/AcKRS 重组载体进行后续试验。
[0019] PCR反应体系：
[0020]
[0021] PCR反应程序：
[0024] 限制性内切酶酶切反应体系：
[0026] T4连接酶连接反应体系：
[0028] 2· psiCHECK-2-hTERT/tRNA 重组载体的构建
[0029] 扩增 hTERT 启动子序列 SEQ ID Ν0:3,正向插入 psiCHECK-2 质粒 SEQ ID Ν0:7 的BgIII和Nhel酶切位点之间，即替换该载体中原有的启动子SV40。扩增tRNA序列SEQ ID N0:4,给两端添加 NheI和XhoI位点，连入突变后的psiCHECK-2-hTERT。将tRNA和 psiCHECK-2-hTERT酶切产物与T4连接酶混合，16度连接过夜，将酶连产物化转ToplO感受 态细胞，37度培养过夜后，挑单克隆送样测序，选取测序成功的psiCHECK-2-hTERT/tRNA重 组载体进行后续试验，反应体系如前所述。
[0030] 3. pCMV6-AC-GFP37TAG 重组载体的构建
[0031] 以PCMV6-AC-GFP序列SEQ ID NO: 5为模板，通过PCR定点突变的方法扩增 PCMV6-AC-GFP37TAG序列SEQ ID NO:6,向PCR产物中加入DpnI酶切5小时，并将酶 切产物化转ToplO感