Egfl8基因过表达慢病毒及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，尤其设及一种Egfl8基因过表达慢病毒及其构建 方法和在制备治疗肝癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] E奸 18(邱idermal growth factor-Uke domain 8,表皮生长因子样结构域8)是 由Fitdi等于2004年首先在小鼠中发现，其位于小鼠的17号染色体上，编码一个由293个氨 基酸组成的蛋白。人Egfl8基因则位于第6号染色体上(6P21.32)，与MHC区域相邻，编码一个 分子量为32KD的分泌型蛋白。蛇fl8蛋白包含有一个EGF样结构域、一个巧离子结合型EGF样 结构域和N末端的信号肤。
[0003] 近年来，已研究证实Egfl8在结直肠癌组织中的表达明显下调，且其低表达与结直 肠癌的远处转移、?M分期及不良预后密切相关。此外，Egfl8在胃癌组织中亦呈低表达，且 其表达水平的下调与胃癌的腹膜播散及?M分期密切相关。运些结果提示Egfl8在人类恶性 肿瘤的侵袭转移中发挥了重要作用。而国际上最新的研究显示，下调小鼠胸腺上皮细胞中 E奸18的表达可使细胞粘附分子I CAM-1的表达明显上调，上调蛇f 18的表达则可使I CAM-1的 表达明显下调，即E奸18对胸腺上皮细胞中ICAM-1的表达具有反向调控的作用。此外，体内 注射重组的蛇fl8蛋白可抑制小鼠胸腺组织中Notch信号传导通路的表达。
[0004] 综上所述，目前国内外对于Egfl8的研究，大多是集中于Egfl8在肿瘤组织中的表 达情况及其与肿瘤恶性程度及临床表现的相关性等方面，而对于Egf 18在人类恶性肿瘤尤 其是肝癌组织中的作用及机制等方面研究较少。Egfl8在细胞系中的研究也仅见于胸腺上 皮细胞，并且目前又缺少高效稳定上调肿瘤细胞中Egf 18表达的手段和方式。因此，构建 Egfl8过表达慢病毒载体及相应慢病毒，观察其感染肿瘤细胞后所产生的作用，对于研究 Egfl8在肿瘤发生、发展中的作用及机制都十分重要。目前，尚未见到关于构建蛇fl8过表达 慢病毒的研究和报道，也尚无任何研究报道蛇fl8在肝癌侵袭转移中的作用及机制。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种Egfl8基因过表达慢病毒及其 构建方法和应用，W高效便捷地实现Egf 18基因在肝癌细胞中的稳定过表达，通过感染 HCCLM3肝癌细胞系，从而抑制该肝癌细胞系的迁移运动能力。
[0006] 本发明的目的通过W下技术方案予W实现：
[0007] 本发明提供的一种Egf 18基因过表达慢病毒，包括含目的基因的GV208-蛇f 18慢病 毒载体、W及慢病毒包装辅助载体抑elper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒;所述GV208-Egfl8 慢病毒载体包括GV208慢病毒表达载体、WEgfl8cDNA克隆为模板的Egfl8cDNAPCR产物； 其中PCR扩增引物为：
[000引 E奸18上游引物：
[0009] GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGGTCCAGGGCTGAGCTGTGCACTC(序列 1)
[0010] E奸18下游引物：
[0011] TCACCATGGTGGCGACCGGTCGATGATTGACGCCGAGGC(序列2)。
[0012] 本发明提供的上述蛇fl8基因过表达慢病毒的构建方法，包括W下步骤：
[001引（1化奸18过表达慢病毒载体的构建
[0014] (l-l)WEgfl8 cDNA克隆为模板，采用上述PCR扩增引物，通过PCR反应，扩增获得 E奸 18 cDNA PCR产物；
[001引（1-2)GV208慢病毒表达载体进行Age I酶切，得到线性化的GV208慢病毒表达载 体；
[0016] (1-3)将蛇fl8 cDNA PCR产物交换入线性化的GV208慢病毒表达载体，将得到的连 接液转化新鲜的感受态大肠杆菌细胞;并进行PCR鉴定；
[0017] (1-4)PCR鉴定采用的引物为：
[001 引 上游:CGGTGAATGCTGGTGGCATC(序列3);
[0019] 下游：TCACCATGGTGGCGACCGGGCTCACACTCAACTGGGC(序列4);
[0020] 对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的含目的 基因的GV208-E奸18慢病毒载体；
[0021] (2化奸18过表达慢病毒的构建
[0022] 将所述GV208-Egfl8慢病毒载体、W及慢病毒包装辅助载体pHelper 1.0质粒和 P化Iper 2.0质粒，同时共转染人胚肾细胞293T细胞，在该细胞中进行病毒的包装并分泌到 细胞外的培养基中，收集培养基离屯、后取得的上清液，经离屯、浓缩即为包含GV208-E奸18质 粒的蛇f 18过表达慢病毒。
[0023] 本发明还提供了上述Egfl8过表达慢病毒在制备治疗肝癌药物中的应用，W及包 括上述蛇fl8过表达慢病毒的药物组合物。
[0024] 本发明具有W下有益效果：
[0025] 本发明首次构建了 Egfl8过表达慢病毒，能够高效便捷地感染肝癌细胞并明显上 调后者中Egfl8基因的表达，能够有效降低肝癌细胞的侵袭运动能力，从而为肝癌的治疗提 供了Egfl8基因运样一个非常有效的抑制基因，为开发相应的基因治疗措施提供了一种行 之有效的方法，对于肝癌的蛇fl8基因治疗药物的制备具有重大意义。
【附图说明】
[0026] 下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细描述：
[0027] 图1是GV208质粒DNA图谱；
[0028] 图 2 是pHelper 1.0质粒 DNA图谱；
[00巧]图3是pHelper 2.0质粒DNA图谱；
[0030] 图4是Egfl8过表达慢病毒及阴性对照慢病毒感染HCCLM3肝癌细胞后的结果示意 图（NC:阴性对照组;0E:E奸18过表达组）；
[0031] 图5是蛇fl8过表达慢病毒及阴性对照慢病毒感染HCCLM3肝癌细胞后Egfl8蛋白表 达水平示意图（A:Weste;rn blot检测Egfl8表达的结果；B:Weste;rn blot结果统计直方图； NC:阴性对照组;0E: E奸18过表达组;CON:空白组）；
[0032] 图6是Egfl8过表达慢病毒及阴性对照慢病毒感染HCCLM3肝癌细胞后侵袭实验的 结果示意图（A:Transwell小室聚碳脂膜拍照照片;B:侵袭实验结果统计直方图;NC:阴性对 照组;0E: E奸18过表达组;CON:空白组）；
[0033] 图7是Egf 18过表达慢病毒及阴性对照慢病毒感染HCCLM3肝癌细胞后划痕实验的 结果统计直方图（NC:阴性对照组;0E:蛇f 18过表达组;CON:空白组）。
【具体实施方式】
[0034] 图1~图7所示为本发明Egfl8基因过表达慢病毒及其构建方法和应用的实施例， 通过设计和构建人Egfl8基因过表达慢病毒，W高效感染肝癌细胞并明显上调后者中蛇fl8 基因的表达，从而有效降低肝癌细胞的侵袭运动能力。
[0035] 1、构建蛇f 18过表达慢病毒载体
[0036] WEgf 18 cDNA克隆(BC052591)为模板，设计PCR扩增引物如表1所述（同序列表中 序列1和序列2)，通过PCR反应（反应体系及条件分别见表2和表3)，扩增获得大小925bp的 PCR产物。GV208慢病毒表达载体DNA图谱见图1，对其进行Age I酶切，酶切体系见表4，酶切 条件为37°C解育化。将Egfl8 cDNA PCR产物交换入线性化慢病毒表达载体，连接反应体系 见表5,反应条件为25°C解育30分钟，再42°C解育15min。将连接液转化新鲜的感受态大肠杆 菌细胞(转化操作参考:分子克隆实验指南第二版55-56页）。
[0037] 表1.蛇fl8 cDNA PCR扩增引物
[00；3 引
[0039] 引物说明：含交换配对碱基、酶切位点（下划线标记的）、表达增强序列（双下划线 标记的似及目的基因5'端部分序列用于PCR钓取目的基因
[0040] 表2.蛇fl8 cDNA PCR扩增反应体系
[0041]
[0042] ~表3.PCR扩增反应体系
' '
[0043]
[0044] 表4.GV208慢病毒载体酶切反应体系
[0045]__
[0049] 说明：a)加入的线性化载体DM和纯化的PCR产物的摩尔数比例为1:3~1:9之间
[0050] b)阳性对照加入的纯化PCR产物为GAPDH基因（同样带有交换臂）
[0051] 针对GV208慢病毒表达载体中目的基因序列的上下游设计PCR鉴定引物(见表6,同 序列表中序列3和序列4)，进行PCR鉴定实验(PCR反应体系见表7，PCR反应条件见表8)，对 PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的含有Egfl8基因序列 的慢病毒表达载体，命名为GV208-E奸18慢病毒载体。
[0化2] 表6.PCR鉴定引物序列
[0化3]_
[0化6]表8.PCR鉴定反应条件
[0化7]
[005引2、E奸18过表达慢病毒及阴性对照慢病毒的构建
[0059] WQiagen公司的质粒抽提试剂盒提取GV208-Egfl8慢病毒载体质粒及慢病毒包装 辅助载体抑elper 1.0质粒(DNA图谱见图2)和抑elper 2.0质粒(DNA图谱见图3)，质粒DNA 溶于除菌的TE中，W紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所有质粒DNA的A260/A280在1.8 ~2.0之间。转染前24h，用膜蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，W含10 %胎牛 血清的DMEM培养基调整细胞密度为1.2 X107细胞/20mL，重新接种于15cm细胞培养皿，37 °C、5 % C〇2培养箱内培养，24h后待细胞密度达70 %~80 %时即可用于转染。转染前化将细 胞培养基更换为无血清培养基。向一灭菌离屯、管中加入所制备的GV208-Egf 1