一种微量dna样本片段化的方法及利用微量dna样本构建dna文库的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种微量DNA样本片段化的方法及利 用微量DNA样本构建DNA文库的方法。
【背景技术】
[0002] 福尔马林固定石赌包埋（Formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)是保存组 织样品的一种重要方法，该方法在临床和科研领域的应用十分广泛，包括形态学及病理学 研宄和分子水平的研宄。但是，分子水平研宄FFPE样品十分具有挑战性，主要有三方面原 因，一是FFPE的医疗样品十分宝贵，每个样品的含量有限，很多样品无法后续再次获得；二 是该种类样品在进入福尔马林浸泡之前就开始发生降解，福尔马林渗透时候产生的交联令 提取工作都变得更加困难，另外，大多数的FFPE样品保存时间都很长，保存的环境及时间 对样品中的DNA也有巨大的影响；三是微量的FFPE样品DNA(20-50ng)直接经过打断后的 有效含量极少，增加了后续建库测序的难度。
[0003] 对于现有技术来说，微量的FFPE样品片段化主要有两种思路：一是直接采用超 声波的方法打断，例如采用Covaris超声打断仪，参数设置参照Covaris S220说明书， 即：Peak Incident Power (功率峰值）：175W;Duty factor(负载比）：10% ;Cycles per Burst (爆发周期数）：200 treatment Times (处理时间）：180s。二是采用转座酶构建微 量DNA二代测序文库的方法，利用转座子打断DNA的同时将接头加在DNA片段之上。
[0004] 但是，现有技术存在以下缺点：
[0005] 一、采用Covaris S220超声打断仪进行FFPE样品的DNA片段化，目前对于FFPE 样品的超声波打断仅仅局限于提取量在200ng以上的样品。
[0006] 二、转座酶构建文库的方法经过实验证明有三个方面的缺点：1，打断的片段长度 不好控制；2,经过打断和加完接头的DNA片段在进行PCR富集的过程中扩增效率不高，导致 杂交前文库的库容不够，不能进行下一步的探针杂交和捕获；3,转座酶进行DNA片段化是 基于完整的基因组，对于FFPE这种降解程度不确定的DNA，打断效果较差。
[0007] 现有的方法对于解决未降解的基因组DNA或者是提取量较高的FFPE样本有着较 高的成功率，目前也有报道FFPE样本可用于目标区域捕获测序的论证，但是对于微量的 FFPE样品，由于提取量少，加之FFPE样品的复杂性，目前没有好的针对微量FFPE样本的建 库方法。
【发明内容】
[0008] 本发明旨在提供一种微量DNA样本片段化的方法及利用微量DNA样本构建DNA文 库的方法，以解决现有技术中微量FFPE样本的建库困难的技术问题。
[0009] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种微量DNA样本片段化的 方法。该方法包括以下步骤：S1，在微量DNA样本中加入Carrier RNA，得到待片段化的样 本；S2,对待片段化的样本进行片段化处理。
[0010] 进一步地，微量DNA样本为来自FFPE样品的DNA。
[0011] 进一步地，微量DNA样本中DNA的量为20~50ng。
[0012] 进一步地，Carrier RNA 的加入量为 500 ~lOOOng。
[0013] 进一步地，对待片段化的样本进行片段化处理是采用超声波打断仪对待片段化的 样本进行超声波打断。
[0014] 根据本发明的另一方面，提供了一种利用微量DNA样本构建DNA文库的方法。该 方法包括以下步骤：S1，采用上述微量DNA样本片段化的方法对微量DNA样本进行片段化， 得到DNA片段；S2,对DNA片段的末端进行修复及3'端添加 A碱基，得到末端连接A碱基的 DNA片段；S3,将末端连接A碱基的DNA片段的末端连接接头；S4,根据接头的序列设计引物 进行PCR扩增，得到样本DNA文库；S5,基于目标区域捕获平台的探针杂交捕获目标DNA片 段；S6,洗脱及PCR扩增目标DNA片段，利用根据接头的序列设计的引物，对目标DNA片段进 行PCR扩增，得到DNA文库。
[0015] 进一步地，目标区域捕获平台为安捷伦SureSelect液相杂交捕获平台。
[0016] 进一步地，该方法包括：S8,对DNA文库进行检测。
[0017] 进一步地，对DNA文库进行检测包括：使用安捷伦2100Bioanalyzer检测DNA文库 的插入片段大小；使用qPCR定量检测DNA文库的产量。
[0018] 由于微量FFPE样品的含量极低，直接进行片段化会导致剩余的目的DNA含量过 低，并且片段大小也很难符合预期，无法进行后续的建库实验。发明人发现，通过对目的DNA 中添加外源的Carrier RNA，即将目标DNA与Carrier RNA进行混合，再进行片段化能够对 目标DNA起到保护作用，最大限度的降低打断仪对微量DNA的破坏作用，使得微量的FFPE 样品DNA进行全基因组建库测序乃至目标区域捕获测序成为现实。
【附图说明】
[0019] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0020] 图1示出了实例1中使用安捷伦2100生物分析仪检测所构建文库包含接头的插 入片段大小；
[0021] 图2A和图2B示出了实例1中所构建的文库GC或AT分离度与GC含量；
[0022] 图3A和3B示出了实例1中所构建文库的测序深度分布图。
【具体实施方式】
[0023] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0024] 由于FFPE样品的复杂性，使得检测其包含的遗传信息比较困难，现有技术对于提 取量高于200ng的样品有一定的把握，但是对于提取量较低的样品不能很好的进行建库测 序以及后续的分析。
[0025] 本发明主要针对微量FFPE样品（20-50ng)的文库制备，并能够与目标区域捕获技 术和测序技术相结合，得到的测序数据质量能够满足后续生物信息学分析。该技术突破可 以解决分子生物学实验中缺少实验样本的难题，增加实验的可靠性及准确性，有助于研宄 人员更加全面地了解经多年保存后的FFPE标本中所包含的遗传机制。
[0026] 根据本发明一种典型的实施方式，提供一种微量DNA样本片段化的方法。该方法 包括以下步骤：S1，在微量DNA样本中加入Carrier RNA，得到待片段化的样本；S2,对待片 段化的样本进行片段化处理。
[0027] 由于微量FFPE样品的含量极低，直接进行片段化会导致剩余的目的DNA含量过 低，并且片段大小也不符合预期，无法进行后续的建库实验。发明人发现，通过对目的DNA 中添加外源的Carrier RNA，即将目标DNA与Carrier RNA进行混合，再进行片段化能够对 目标DNA起到保护作用，最大限度的降低打断仪对微量DNA的破坏作用，使得微量的FFPE 样品DNA进行全基因组建库测序乃至杂交捕获测序成为现实。
[0028] 本发明微量DNA样本片段化的方法可以用于任何微量DNA样本的片段化，根据本 发明一种典型的实施方式，微量DNA样本为来自FFPE样品的DNA。
[0029] 根据本发明一种典型的实施方式，微量DNA样本中DNA的量为20~50ng。
[0030] Carrier RNA的添加量不受特别限制，根据本发明一种典型的实施方式，优选的， Carrier RNA 的加入量为 500 ~1000 ng。
[0031] 根据本发明一种典型的实施方式，对待片段化的样本进行片段化处理是采用超声 波打断仪对待片段化的样本进行超声波打断。优选的，采用Covaris LE220R高通量超声打 断仪进行样品DNA的片段化。
[0032] 根据本发明一种典型的实施方式，提供一种利用微量DNA样本构建DNA文库的方 法。该方法包括以下步骤：S1，采用上述微量DNA样本片段化的方法对微量DNA样本进行片 段化，得到DNA片段；S2,对DNA片段的末端进行修复及3'端添加 A碱基，得到末端连接A 碱基的DNA片段；S3,将末端连接A碱基的DNA片段的末端连接接头；S4,根据接头的序列设 计引物进行PCR扩增，得到样本DNA文库；S5,利用目标区域捕获平台的探针杂交捕获包含 在样本DNA文库中的目标DNA片段；S6,洗脱及PCR扩增目标DNA片段，利用根据接头的序 列设计的引物，对目标DNA片段进行PCR扩增，得到DNA文库。
[0033] 由于微量FFPE样品的含量极低，直接进行片段化会导致剩余的目的DNA含量过 低，并且片段大小也很难符合预期，无法进行后续的建库实验。发明人发现，通过对目的DNA 中添加外源的Carrier RNA，即将目标DNA与Carrier RNA进行混合，再进行片段化能够对 目标DNA起到保护作用，最大限度的降低打断仪对微量DNA的破坏作用，使得微量的FFPE 样品DNA进行全基因组建库测序乃至目标区域捕获测序成为现实。
[0034] 优选的，目标区域捕获平台为安捷伦（Agilent)SureSelect液相杂交捕获平台。 由于安捷伦SureSelect液相杂交捕获平台要求的杂交起始量较高（750ng-1000ng)，在尽 可能的减少PCR循环数的条件下，需要文库进行混合杂交捕获，从而提高杂交起始量。
[0035] 根据本发明一种典型的实施方式，该方法进一