Dna标签序列及测序文库构建方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种DNA标签 序列及测序文库构建方法和试剂盒。 技术背景
[0002] DNA测序（DNA sequencing)作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛 的应用。1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，Sanger法因为既简便 又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序（即一代测序）的主流。一代测 序作为基因组研究的主要研究手段和金标准，在过去的几十年里取得了重大的成就，也使 得临床分子诊断成为了可能，但成本较高，耗时较长，通量低限制了其在临床的广泛应用。 随着人类基因组计划的完成，人们进入了后基因组时代，即功能基因组时代，传统的测序 方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求，对模式生物进行基 因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的 测序技术，这促使了新一代DNA测序技术的诞生，第二代测序技术是相应于以Sanger测序 法为代表的第一代测序技术而得名。
[0003] 第二代测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，用不同 颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放 出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的 序列信息。二代测序是一项新的低成本，高通量，高准确度的快速测序技术，在临床和科学 研究方面都有着广泛的应用。
[0004] 目前常用的测序方法根据影响力、测序原理等不同主要有以下几种：以 HeliScope TIRM和Pacific BiosciencesSMRT为代表的单分子测序，以454焦磷酸测序、 Illumina(Solexa)测序、ABI SOLiD测序为代表的二代高通量测序、DNA纳米球测序以及 2010 年Life Science公司推出的Ion Personal Genome Machine (PGM)测序等。
[0005] 但目前二代测序所需的标签文库制备的方法存在着一些缺陷：现有测序平台的建 库步骤多且复杂，各个步骤都是独立制备的，需要分别进行纯化，以保证各个步骤之间不会 互相干扰和污染，从而造成DNA文库样品在纯化过程中不可避免的损失，操作过程繁琐。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一是提供一种DNA标签，该DNA标签与PCR引物连接构成标签扩 增引物，通过PCR扩增使PCR产物带上相应的DNA标签，并通过将多个不同样品来源的带有 不同DNA标签的PCR产物混合成一个文库，从而实现高通量测序。
[0007] 实现上述目的的技术方案如下。
[0008] -种DNA标签序列，包含至少一条以上序列，每条序列由6-8个碱基组成、且1) 标签序列中不含有3个以上碱基的重复序列；2)标签序列的GC含量在40%~60%之间； 3)标签序列与扩增引物组合成标签引物后，内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构；4) 不同的标签序列之间不存在非特异性结合，5)标签序列中不含有与扩增引物相似度大于 80%的序列；6)标签引物之间不形成二聚体、不存在错配、与PCR产物之间均不存在非特异 性结合。
[0009] 在其中一个实施例中，所述DNA标签序列，其选自SEQ ID N0:41-SEQ ID N0:60中 的至少一条。
[0010] 在其中一个实施例中，所述DNA标签序列，其选自SEQ ID NO: 21-SEQ ID NO: 40中 的至少一条。
[0011] 在其中一个实施例中，所述DNA标签序列，其选自SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 20中 的至少一条。
[0012] 本发明的另一目的是提供一种DNA标签构建测序文库的试剂盒。
[0013] 实现上述目的的技术方案如下。
[0014] 一种DNA标签构建测序文库的试剂盒，包括有：针对不同样品的不同引物组，每组 引物组包含有至少一对PCR引物对，且每对PCR引物对中至少一条的5'端连接有DNA标签 序列，所述同一引物组的DNA标签序列相同，不同引物组的DNA标签序列不同，所述DNA标 签序列如上所述。
[0015] 在其中一个实施例中，PCR引物对选自SEQ ID N0:61和62, SEQ ID N0:63和64、 5￡〇10勵：65和66、5￡〇10勵：67和68。
[0016] 本发明的另一目的是提供一种DNA标签构建测序文库的方法。
[0017] 实现上述目的的技术方案如下。
[0018] -种DNA标签构建测序文库的方法，主要包括以下步骤：
[0019] A、提取样本中的DNA ;
[0020] B、采用上述DNA标签构建测序文库的试剂盒，用针对目标基因突变位点的标签 PCR引物，PCR扩增不同的待测样品，针对每种不同的待测样品的标签PCR引物中的DNA标 签序列不同；
[0021] C、纯化回收PCR扩增产物，并将不同待测样品的扩增产物混合，构成核酸测序文 库。
[0022] 在其中一个实施例中，所检测的样品的数量为1-20个，所述DNA标签序列选自SEQ 10勵:41-3￡〇10勵:60，或所述0嫩标签序列选自3￡〇10勵:21-3￡〇10勵:40，或所述 DNA 标签序列选自 SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:20。
[0023] 本发明的另一目的是提供一种高通量测序的方法。
[0024] 实现上述目的的技术方案如下。
[0025] 一种高通量测序的方法，主要包括以下步骤：
[0026] A、采用上述的DNA标签构建测序文库的方法，建立核酸测序文库；
[0027] B、将核酸测序文库依次进行末端修复、连接接头以及纯化回收连接产物；
[0028] C、对上述连接产物进行测序，以确定所述核酸测序文库的序列信息。
[0029] 在其中一个实施例中，所述步骤B中的所述接头的碱基序列如SEQ ID N0:69和 SEQ ID NO:70 所示。
[0030] 本发明的主要优点在于：
[0031] 1.本发明所设计的DNA标签序列具有非常好的特异性，DNA标签序列与扩增引物 组合成标签引物后，内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构；不同的DNA标签序列之间 不存在非特异性结合，标签引物之间不形成二聚体、不存在错配、与PCR产物之间均不存在 非特异性结合。
[0032] 2、本发明所提供的DNA标签与扩增引物形成一个特异性、灵敏度和重复性之间达 到优化、平衡的检测产品，一次可以检测1-20个不同来源的样品，能够准确区分各种样本 来源的碱基序列，与测序法的吻合率高达100%。
[0033] 3.本发明的检测方法步骤简单，可通过一步PCR扩增即可完成一个样品中多种目 标检测序列的扩增，并使其扩增产物均带上一个特定的DNA标签，通过将带有不同标签的 不同样品PCR产物混合，实现一次检测多个样品多种PCR产物的并行检测，避免了反复多次 PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的 同时定性、定量分析特征。
[0034] 4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合临 床需要。
[0035] 5.本发明对第一代测序技术进行改进，使得所设计的DNA标签能适用于不同的检 测项目，具有很强的拓展性，同时，二代测序技术使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪 比增强，检测结果更加准确可靠。
【具体实施方式】
[0036] 为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0037] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域 的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实 施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语"和/或"包括一个或多个相关的所 列项目的任意的和所有的组合。
[0038] 本发明在其中一个方面，涉及到一种DNA标签序列，其包含有至少一条以上的序 列，每条序列由6-8个碱基组成、且i)标签序列中不含有3个以上碱基的重复序列；ii)标 签序列的GC含量在40%~60%之间；iii)标签序列与扩增引物组合成标签引物后，内部 不存在发卡结构或二聚体等二级结构；iv)不同的标签序列之间不存在非特异性结合，V) 标签序列中不含有与扩增引物相似度大于80%的序列；vi)标签引物之间