microRNA荧光检查定量的内参化合物和引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于脊髓miRNA检测的内参化合物及其检测引物与应用，属于分 子生物学检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 普通人群中慢性疼痛的发生率约为35%~45%，且近年呈上升趋势，慢性疼痛已 成为最常见临床病症之一，且由于缺乏行之有效的治疗方法和药物而严重影响人们的生活 质量。早期诊断和治疗可提高慢性疼痛病人的治疗效果并改善预后，因此寻找具有较高特 异性和敏感性的实用诊断方法是十分必要的。目前慢性疼痛常用治疗方法主要有全身药物 治疗法、神经阻滞疗法、小刀疗法、物理疗法和枝川疗法等。其中药物疗法是主要疗法，但由 于仍缺乏理想治疗方法和镇痛药物，因此出现药物耐受或疗效不佳等状况。神经阻滞疗法 和物理疗法也是常见临床慢性疼痛治疗方法，但其疗效有效，亦不能根本上治疗慢性疼痛。 由于脊髓作为伤害性信号传递的中枢第一站，是疼痛信号传递和调控的关键部位，因此，研 究脊髓水平基因调控的慢性疼痛机制有可能抓住慢性疼痛发生和维持的关键环节，也将有 助于研究慢性疼痛发病机理及获得有效的防治措施。这也是临床及基础研究科学家们长期 致力于研究脊髓神经元可塑性介导慢性发生机制的主要原因。
[0003] 微小RNA(microRNA，miRNA)是近年来发现的基因表达调控的一种方式，它参与调 节多种生理和病理过程。目前，已在动物的多数组织中发现有调节功能的miRNA。2006年 首次在脑中发现了调节神经元突触功能的miR-13,随后又在脊髓和周围神经系统发现多个 miRNA，它们通过调节突触可塑性，在多种神经退行性疾病形成中发挥着重要作用。提示， miRNA作为基因表达调控的新机制为进一步阐明神经系统相关疾病的发生机理及其寻求临 床治疗学的突破提供可能。Zhao等2010年将miRNA调控引入疼痛研究领域，这对探讨慢性 疼痛发生的新机制具有重大意义。随后，Favereaux等研究了 miR-103介导慢性疼痛的发生 过程，发现CFA疼痛小鼠脊髓背角miR-103表达明显降低，当脊髓背角miR-103过表达时， 钙离子通道Cavl. 2-LTC的表达则明显下降，小鼠痛阈显著升高。miRNA通过调节突触可塑 性参与了慢性疼痛过程。因此，检测脊髓miRNA可为慢性疼痛预测、诊断与监测开辟新的途 径。
[0004] 目前，miRNA检测技术主要包括高通量测序技术、基因芯片技术、原位杂交和实时 荧光定量PCR(qRT-PCR)技术。前两者属于高通量方法，主要用于miRNA筛选，对于获得 miRNA的准确定量需采用qRT-PCR方法；原位杂交检测方法是对组织内单一miRNA的在体 定性检测，因其分析费时成本高常用于miRNA的在体验证。qRT-PCR因其是能够准确、操作 简单、低成本对单一目标miRNA进行定性定量分析及验证，是miRNA分析方法中最为常用 检测技术。在进行脊髓qRT-PCR操作过程中，为获得准确miRNA结果，常采用如下3种操 作方法。一是提取RNA时取等量脊髓，二是在提取RNA之前向等量脊髓加入等量人工合成 miRNA(如线虫miRNA-39)，三是采用内源性分子作为检测脊髓miRNA表达内参化合物。然 而，前两种方法由于操作误差在所难免，决定了它们对于有效获得生物体内miRNA含量的 不确定性。与前两者不同的是，采用内源性miRNA分子作为检测脊髓miRNA表达内参化合 物，不仅可以控制实验操作中的误差，还可以控制样本本身生物学差异，具有独特优势，因 而成为业界所公认的最佳标准化方法。
[0005] 目前，在慢性疼痛脊髓miRNA研究中，尚缺乏公认较为稳定的内参化合物分子，以 往研究者主要根据自身经验或者参考文献来选择内参化合物分子，不同实验中选取内参化 合物有很大差异，因而制约了研究成果转化和不同研究者间所获检测结果的比较。因此，若 能发现用于慢性疼痛脊髓miRNA分析内参化合物并研发出相应试剂盒，使之能应用于科研 领域，将极大地促进慢性疼痛脊髓miRNA研究及科研成果的转化，对于慢性疼痛临床诊疗 和药物开发必将起到巨大推动作用。
【发明内容】
[0006] 发明目的：针对上述现有技术，为解决现有技术中尚无稳定检测慢性疼痛脊髓 miRNA内参化合物分子的技术问题，本发明通过大量实验筛选，提供一种用于慢性疼痛脊髓 miRNA检测的内参化合物，并提供检测该内参化合物的引物、专用试剂盒、检测方法，以及在 诊断、检测慢性疼痛中的应用，为慢性疼痛脊髓miRNA研究的实验数据提供实用可靠的标 准化依据。
[0007] 技术方案，本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] -种用于慢性疼痛脊髓miRNA检测的内参化合物，该内参化合物为单独的 mmu-miR-486-5p;其序列为：uccuguacugagcugccccgag，序列如 SEQ ID NO 1 所不。
[0009] 检测mmu-miR-486-5p的引物包括反转录引物，正向扩增引物和反向扩增引物；反 转录引物的序列如SEQ ID N0 2所示；正向扩增引物的序列如SEQ ID N0 3;反向扩增引物 的序列如SEQ ID N0 4所示；
[0010] mmu-miR-486_5p 反转录引物为：
[0011] 5' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCGGGGC-3'；
[0012] mmu-miR-486-5p 的正向扩增引物：5' -GCCCTGTCCTGTACTGAGCTGCC-3'
[0013] mmu-miR-486-5p 的反向扩增引物：5' -GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。
[0014] 本发明所述的用于慢性疼痛下脊髓miRNA检测的内参化合物mmu-miR-486-5p在 制备慢性疼痛脊髓miRNA检测试剂盒中的应用。
[0015] 本发明所述的用于慢性疼痛下脊髓miRNA检测的内参化合物mmu-miR-486-5p的 引物在制备慢性疼痛脊髓miRNA检测试剂盒中的应用。
[0016] 作为优选方案，以上所述的慢性疼痛脊髓miRNA检测试剂盒，包含用于miRNA提取 及qRT-PCR反应所需的RNA分离液、试剂和酶，以及标准品或/和对照品。
[0017] 作为优选方案，以上所述RNA分离液由吐温20、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙 酸、牛血清白蛋白和水组成，各组分的浓度如下：吐温20的体积百分数为2.0%，三羟甲基 氨基甲烧：45mmol/L，乙二胺四乙酸：1. 2mmol/L，牛血清白蛋白的体积百分数为1. 5%，余 量为水。
[0018] 所述PCR反应液由lXSyberGreen I荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨 基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成，其中，各物质的浓度如下：DNA聚合酶：100U/mL ; dNTPs :0. 2mM ;氯化镁：6mM ;三羟甲基氨基甲烷盐酸盐：16. 5mM ;氯化钾：89. 3mM。
[0019] 利用上述慢性疼痛脊髓miRNA内参化合物检测试剂盒进行检测方法，包括以下步 骤：
[0020] (1)冰上分离得到脊髓样本，提取RNA (包括miRNA);
[0021] (2) qRT-PCR反应：将上述分离脊髓miRNA进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，加 入引物和PCR反应液，进行qRT-PCR反应，检测样本阈值Ct ;
[0022] (3)结果分析：根据脊髓miRNA内参化合物mmu-miR-486-5p样本阈值Ct内参化 合物校正脊髓目的miRNA样本阈值Ct，以判断目的miRNA表达水平是否有统计学意义。
[0023] 本发明可用于检测慢性疼痛下脊髓miRNA内参化合物mmu-miR-486-5p，并可检测 脊髓目的miRNA分子，其检测效能稳定可靠，具有广泛应用前景。
[0024] 本发明的用于慢性疼痛脊髓miRNA检测的内参化合物，优点如下：
[0025] (1)慢性疼痛脊髓内参mmu-miR-486-5p化合物miRNA检测试剂盒可用于检测小鼠 脊髓miRNA，进而确定不同动物脊髓内参化合物miRNA线水平，以消除由于个体生物学差异 及实验操作所导致的miRNA表达水平差异，使得真正与慢性疼痛相关miRNA表达水平差异 得到准确差异性表达分析。
[0026] (2)本发明采用严密的设计和评价体系，首先通过Solexa测序得到慢性疼痛下脊 髓miRNA表达谱，经比较分析筛选出表达稳定的miRNA，再经qRT-PCR检测和软件计算得到 较稳定候选内参化合物。通过应用上述研究方法，可保证慢性疼痛脊髓miRNA内参化合物 检测试剂盒研发的严谨性和可靠性。
[0027] 本发明通过筛选脊髓中稳定表达的miRNA，寻找并验证了可用作慢性疼痛脊 髓miRNA研究的内参mmu-miR-486-5p化合物。通过慢性疼痛脊髓miRNA内参化合物 mmu-miR-486-5p检测试剂盒的应用，可促进慢性疼痛脊髓miRNA研究成果转化及不同科研 者间学术交流，也可为获得靶向miRNA的镇痛药物研发提供新思路和新途径。
【附图说明】
[0028] 图1为不同miRNA分子在正常组和疼痛组脊髓内表达。
[0029] 图2为miR-486_5p在不同批次的对照组和疼痛组样本中的表达情况。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例对本发明作进一步的阐述。
[0031] 本发明的试验研究包括以下步骤：
[0032] (1)小鼠慢性疼痛模型的制备；
[0033] (2)以标准操作程序采集脊髓样本，提取RNA ;
[0034] (3)脊髓miRNA表达谱分析：选取慢性疼痛小鼠与生理盐水注射作为对照的小鼠， 高通量测序后分析两者表达谱，筛选出稳定表达的候选内参化合物miRNA用以进一步验 证，排除部分不符合要求的分子，对剩余分子采用软件分析；
[0035] (4)对候选内参化合物miRNA用定量PCR进行定性分析验证，以确定各候选miRNA 的稳定性；
[0036] (5)慢性疼痛脊髓miRNA内参化合物检测试剂盒的研发：根据所选定的miRNA，研 发内参化合物检测试