一种连香树基因组dna的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种连香树基因组DNA的提取方法，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002]顽拗类植物是指由于特殊细胞结构和高含量次生产物而使得基因组DNA的提取非常困难的一类植物，其中的次生产物主要包括多糖、多酚、蛋白质以及其他一些未知的粘性极强的化合物，提取DNA时，它们通常与核基因组DNA共同沉淀或者捆绑在一起，严重地影响了 DNA质量，导致扩增、酶切等分子操作难以进行。有许多林木树种属于这类植物，濒危植物连香树就是其中的一种。
[0003]连香树(Cercidiphyllum japonicum)为连香树科连香树属植物，是第三纪古热带植物的孑遗种单型科植物，也是较古老原始的木本植物，为国家二级濒危保护植物，在系统演化中处于比较原始的地位，分布于山西南部、河南西南部、陕西南部、甘肃南部、安徽西部、浙江北部、江西北部和东部、湖北西部、四川西部和东南部等局部地区，生于海拔400-2500m的常绿和落叶阔叶混交林中，是重要的药用植物和园林绿化植物。连香树组织中含有较多的单宁、酚类、多糖及色素等成分，如果DNA提取方法不当，会使提取出的基因组DNA进入这种粘稠胶状物中而难于溶解，影响PCR扩增反应的稳定性和重现性。用分子标记技术进行连香树种质资源遗传多样性研究，揭示其遗传多样性水平和遗传结构状况，对于高效建立连香树种质资源基因库、连香树遗传育种以及连香树种质资源的进一步保护和开发利用具有重要的指导意义。
[0004]基因组DNA的提取是分子生物学研究的基础，常用的基因组DNA提取方法有:CTAB法、SDS法、高盐低pH法、PVP法、尿素法等。采用上述几种方法提取连香树基因组DNA时都出现研磨样加入提取液后变得粘稠，提取的DNA样品由于含有大量的次生物不易溶于TE缓冲液，其中的粘性物致使DNA检测以及PCR扩增时上样困难、电泳困难，凝胶电泳检测和PCR扩增检测显示DNA得率低，上样孔或样道非常亮或无亮带、扩增样带少或无扩增亮带。
【发明内容】
[0005]针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种连香树基因组DNA的提取方法，该方法提取效果好、纯度高，操作简单。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用的一种连香树基因组DNA的提取方法，包括以下步骤:
[0007]I)取30?50mg的连香树叶片，液氮研磨，研磨过程中加入I?2.5mg的PVP40、I?2.5mg的抗坏血酸钠和I?2mg的石英砂，研磨均匀后得粉末A，将粉末A加入到经65°C预热的700 μ L提取缓冲液中，再加入100 μ L β -巯基乙醇，振荡混匀得混合液B，混合液B于65°C恒温水浴I?1.5h，其间晃动3?4次；
[0008]2)向混合液B中加入其体积1/3倍的浓度为5mol/L、pH为4.8的KAC溶液得混合液C，将混合液C置于-20°C冰浴0.5?lh，离心得上清液Cl ;
[0009]3)向上清液Cl中加入其体积1/5倍的2 X CTAB提取缓冲液，混匀得混合液D，混合液D于65°C恒温水浴10?20min，冷却至室温后，加入与混合液D等体积的24: I的氯仿-异戊醇溶液得混合液E，离心得上清液El ；
[0010]4)向上清液El中加入与上清液El等体积的24: I的氯仿-异戊醇溶液得混合液，离心得上清液E2 ;
[0011]5)向上清液E2中加入与上清液E2等体积的24: I的氯仿-异戊醇溶液得混合液，离心得上清液E3 ;
[0012]6)向上清液E3中加入其体积1/2倍的高盐溶液和上清液E3体积1/2倍的经-20°C预冷的异丙醇，混匀得混合液F，混合液F在_20°C放置0.5?lh，离心得沉淀物Fl ；
[0013]7)将沉淀物Fl用浓度为70%乙醇洗涤，风干沉淀物F1，再向沉淀物Fl中加500 μ L灭菌水溶解，再加入溶解沉淀物Fl体积1/10倍的浓度为3mol/L、pH为5.2的NaAC溶液及溶解沉淀物Fl体积2倍的无水乙醇，混匀得混合液G，离心得沉淀物Gl ;
[0014]8)沉淀物Gl用浓度为70%乙醇洗涤2次，再用浓度为100%乙醇洗涤I次，自然风干，风干后的沉淀物Gl中加入0.1 X TE溶液溶解后即为连香树基因组DNA溶液。
[0015]作为改进，所述步骤I)中提取缓冲液包括浓度为100mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl，浓度为 50mmol/L、pH 为 8.0 的 EDTA，浓度为 1.0mol/L 的 NaCl，2 % SDS 及 2 %PVP40。
[0016]作为改进，所述步骤2)、3)、4)、5)、6)、7)中的离心条件为4°C，转速为12000r/min离心1min。
[0017]作为改进，所述步骤3)中2 X CTAB提取缓冲液包括浓度为100mmol/L、pH为8.0的 Tris-HCl，浓度为 20mmol/L、pH 为 8.0 的 EDTA，浓度为 1.4mol/L 的 NaCl，及 2% CTAB0
[0018]作为改进，所述步骤6)中高盐溶液包括0.8mol/L的柠檬酸钠和1.2mol/L的NaCl0
[0019]作为改进，所述步骤8)中0.1XTE溶液包括浓度为1.0mmOl/L、pH为8.0的Tris-HCl，浓度为 0.lmmol/L、pH 为 8.0 的 EDTA。
[0020]作为改进，该方法具体包括以下步骤:
[0021]I)取40mg的干样连香树叶片，液氮研磨，研磨过程中加入2mg的PVP40、2mg的抗坏血酸钠和1.5mg的石英砂，研磨均匀后得粉末A，将粉末A加入到经65°C预热的700 μ L提取缓冲液中，再加入100 μ L β -巯基乙醇，振荡混匀得混合液B，混合液B于65°C恒温水浴I?1.5h，其间晃动3?4次；
[0022]2)向混合液B中加入其体积1/3倍的浓度为5mol/L、pH为4.8的KAC溶液得混合液C，将混合液C置于-20°C冰浴0.5?lh，离心得上清液Cl ;
[0023]3)向上清液Cl中加入其体积1/5倍的2 X CTAB提取缓冲液，混匀得混合液D，混合液D于65°C恒温水浴10?20min，冷却至室温后，加入与混合液D等体积的24: I的氯仿-异戊醇溶液得混合液E，离心得上清液El ；
[0024]4)向上清液El中加入与上清液El等体积的24: I的氯仿-异戊醇溶液得混合液，离心得上清液E2 ;
[0025]5)向上清液E2中加入与上清液E2等体积的24: I的氯仿-异戊醇溶液得混合液，离心得上清液E3 ;
[0026]6)向上清液E3中加入其体积1/2倍的高盐溶液和上清液E3体积1/2倍的经-20°C预冷的异丙醇，混匀得混合液F，混合液F在_20°C放置0.5?lh，离心得沉淀物Fl ；
[0027]7)将沉淀物Fl用浓度为70%乙醇洗涤2次，风干沉淀物Fl，再向沉淀物Fl中加500 μ L灭菌水溶解，再加入溶解沉淀物Fl体积1/10倍的浓度为3mol/L、pH为5.2的NaAC溶液及溶解沉淀物Fl体积2倍的无水乙醇，混匀得混合液G，离心得沉淀物Gl ;
[0028]8)沉淀物Gl用浓度为70 %乙醇洗涤2次，再用浓度为100 %乙醇洗涤I次，自然风干，风干后的沉淀物Gl中加入50 μ L 0.1 X TE溶液溶解后即为连香树基因组DNA溶液。
[0029]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0030](I)与传统的CTAB法、SDS法和PVP法相比，本发明的提取方法在研磨时不需加DICA (二乙二硫氨甲酸)，而是加入PVP40和少量的抗坏血酸钠，可以通过PVP40与酚类物质结合形成鳌合物，通过离心除去后可提高DNA的得率和纯度。用PVP40和抗坏血酸钠，是利用其“C0-N = ”基随多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强的结合多酚化合物能力，其结合成复合物后，可通过离心操作除去。
[0031](2)本发明的提取方法采用β-Mercaptoethanol ( β-巯基乙醇)的用量增加了一倍，加入β -Mercaptoethanol主要是利用其“_SH”基打断多酸氧化物酶的二硫键而使之失活，防止酚类化合物被氧化而不被形成复合物，有利于离心除去酚类物质。因此适当地提高β -巯基乙醇的含量能有效除去酚类、多糖等次生物质。
[0032](3)本发明方法采用2 X CTAB (十六烷基-三甲基溴化铵)，而不使用传统方法中的 10% 的 CTAB Buffer (10mmoI/L Tris-HCl，pH 8.0 ；50mmol/L EDTA, pH 8.0 ；1.0mol/LNaCl ；10% CTAB);通过加入异丙醇后于_20°C冰浴0.5_lh，再经低温离心，可有效提高DNA的提取效率和纯度。
[0033](4)在沉淀DNA时采用加入高盐溶液和NaAC溶液，可以有效去除糖类，防止其在RAPD反应中抑制Taq酶活性。
[0034](5)本发明综合了 CTAB法、