一种食用菌菌丝快速pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于快速PCR领域，特别设及一种食用菌菌丝快速PCR方法。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应简称PCR反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，在分子 生物学中有广泛的应用。
[0003] 通常PCR反应之前首先需要提取基因组DNA作为扩增模板，食用菌菌丝基因组DNA 提取方法常用CTAB法，需要的菌丝量大，耗时。尽管近年来不断有公司开发出快速PCR试 剂盒，但主要针对植物和动物样品，用于食用菌菌丝直接扩增时，经常出现扩增不出特异性 条带或对照也扩出条带等问题，无法应用于食用菌菌丝快速PCR扩增。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种食用菌菌丝快速PCR方法，该方法所需菌 丝量少，无需耗时进行基因组DNA提取，具有操作简便，检测时间短，准确性高，稳定性和重 复性好的优点；可W利用少量菌丝进行PCR扩增，获得所需的目的DNA片段，缩短试验进程， 适用于大批量样品的PCR扩增。
[0005] 本发明的一种食用菌菌丝快速PCR方法，包括：
[0006] (1)用移液器吸取裂解液置于PCR管中，用灭菌牙签挑取预先培养的食用菌菌丝 置于裂解液中离屯、，振荡，再离屯、；
[0007] (2)W上述得到的菌丝裂解液为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：12. 5yL扩增 混合液，待扩增基因特异性引物对各0. 5yL菌丝裂解液0. 5yL(1地2〇 11yL;PCR反应条 件：95°C5min;95°C30s，（引物Tm值-5)°C30s，72°Clmin，35 个循环；72°ClOmin;
[0008] (3)取上述PCR扩增产物与加样缓冲液混匀，点样于琼脂糖凝胶上，于缓冲液中电 泳，电泳结束后，用邸染色，然后拍照，即可。
[0009] 所述步骤（1)中的裂解液占PCR管体积的1/10。
[0010] 所述步骤（3)中的PCR扩增产物与加样缓冲液的体积比为5:1。
[0011] 所述步骤（3)中的琼脂糖凝胶浓度为1. 5%。
[0012] 所述步骤（3)中的电泳电压为5V/cm。
[0013] 本发明不需要提取食用菌基因组DM,筛选获得裂解液简单快速处理少量菌丝样 品作为模板，利用筛选获得的PCR扩增试剂盒即可进行PCR扩增反应，获得所需的目的DNA 片段。
[0014] 有益效果
[0015] 本发明所需菌丝量少，无需耗时进行基因组DNA提取，具有操作简便，检测时间 短，准确性高，稳定性和重复性好的优点；可W利用少量菌丝进行PCR扩增，获得所需的目 的DNA片段，缩短试验进程，适用于大批量样品的PCR扩增。
【附图说明】
[0016] 图1为草茹菌株交配型基因特异条带扩增图；其中，M为Marker;1为草茹菌株 V23 ;2为对照。
[0017] 图2为香茹菌株微管蛋白基因特异条带扩增图；其中，M为Marker;1为香茹菌株 135 ; 2为对照。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可W对本发明作各种改动或修改，运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0019] 实施例1
[0020] (1)菌丝培养：
[0021] 草茹菌株V23接种PDA试管，适宜溫度培养。
[0022] (2)PCR反应模板制备：
[0023] 移液器吸取50yL裂解液置于0. 5血PCR管中，用灭菌竹制牙签挑取少量菌丝置 于裂解液中，短暂离屯、，混匀器上振荡1分钟，短暂离屯、，W该裂解液为模板。
[0024] (3)PCR反应体系及条件
[0025] 扩增反应体系（25化）：12.5扩增混合液，待扩增基因特异性引物对各0.5化，菌 丝裂解液 0. 5yLd地2〇 11yL。PCR反应条件：95°C5min;95°C30second，55°C30second， 72°Clmin，35 个循环；72°ClOmin。
[0026] (4)电泳检测
[0027] 取上述PCR扩增产物5iiL，与1yL加样缓冲液混匀，点样于1. 5%的琼脂糖凝胶 上，于0. 5XTBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用邸染色，然后在凝胶成像仪上 拍照。
[002引利用该方法，采用草茹V23菌株交配型基因的特异性引物对 (F:GTGGTTGGGATGGAAGGTTGTGA，R:CTGTGAGGGTTTGTGGTGGGATA)，裂解液快速处理少量草茹 V23菌株菌丝后进行PCR扩增反应，草茹V23菌株能扩增出一条特异性条带，对照不能扩增 出条带，如图1所示。
[0029] 实施例2
[0030] (1)菌丝培养： 阳03U 香茹菌株135接种PDA试管，适宜溫度培养。
[0032] (2)PCR反应模板制备：
[0033] 移液器吸取50yL裂解液置于0. 5血PCR管中，用灭菌竹制牙签挑取少量菌丝置 于裂解液中，短暂离屯、，混匀器上振荡1分钟，短暂离屯、，W该裂解液为模板。
[0034] (3)PCR反应体系及条件
[0035] 扩增反应体系（25化）：12.5化扩增混合液，待扩增基因特异性引物对各 0. 5yL，菌丝裂解液 0. 5yL，d地2〇llyL。PCR反应条件：95°C5min;95°C30second， 50°C30second，72°Clmin，35 个循环；72°ClOmin。
[0036] (4)电泳检测
[0037] 取上述PCR扩增产物5iiL，与1yL加样缓冲液混匀，点样于1. 5 %的琼脂糖凝胶 上，于0. 5XTBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用邸染色，然后在凝胶成像仪上 拍照。 阳03引利用该方法，采用香茹微管蛋白基因特异性引物对灯UB1F:GAAGGTTAGCCGCAGCAT，TUB1R:CTCAAGGGCAGCCAAGTC)，裂解液快速处理少量香茹菌株135菌丝后进行PCR扩增反 应，香茹菌丝能扩增出特异性条带，对照不能扩增出条带，如图2所示。
【主权项】
1. 一种食用菌菌丝快速PCR方法，包括： (1) 用移液器吸取裂解液置于PCR管中，用灭菌牙签挑取预先培养的食用菌菌丝置于 裂解液中离心，振荡，再离心； (2) 以上述得到的菌丝裂解液为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：12.5yL扩增混合 液，待扩增基因特异性引物对各〇. 5yL，菌丝裂解液0. 5yL，CldH2O11yL;PCR反应条件： 95°C5min;95°C30s，（引物Tm值-5)°C30s，72°Clmin，35 个循环；72°CIOmin; (3) 取上述PCR扩增产物与加样缓冲液混匀，点样于琼脂糖凝胶上，于缓冲液中电泳， 电泳结束后，用EB染色，然后拍照，即可。2. 根据权利要求1所述的一种食用菌菌丝快速PCR方法，其特征在于：所述步骤（1)中 的裂解液占PCR管体积的1/10。3. 根据权利要求1所述的一种食用菌菌丝快速PCR方法，其特征在于：所述步骤（3)中 的PCR扩增产物与加样缓冲液的体积比为5:1。4. 根据权利要求1所述的一种食用菌菌丝快速PCR方法，其特征在于：所述步骤（3)中 的琼脂糖凝胶浓度为1. 5%。5. 根据权利要求1所述的一种食用菌菌丝快速PCR方法，其特征在于：所述步骤（3)中 的电泳电压为5V/cm。
【专利摘要】本发明涉及一种食用菌菌丝快速PCR方法，包括：(1)制备PCR反应模板；(2)PCR反应；(3)电泳检测。本发明所需菌丝量少，无需耗时进行基因组DNA提取，具有操作简便，检测时间短，准确性高，稳定性和重复性好的优点；可以利用少量菌丝进行PCR扩增，获得所需的目的DNA片段，缩短试验进程，适用于大批量样品的PCR扩增。
【IPC分类】C12Q1/68, C12R1/645, C12Q1/04
【公开号】CN105200139
【申请号】CN201510641076
【发明人】汪虹, 陈明杰, 赵妍, 冯爱萍, 辛苗苗
【申请人】上海市农业科学院
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月30日