与晋南牛生长性状相关的snp标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程及分子生物学领域，具体地说，设及一种与晋南牛生长性状 相关的SNP标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 晋南牛是我国四大地方良种黄牛之一，是我国珍贵的畜种资源，在我国物种基因 库中占有重要位置。晋南牛不仅具有良好的役用性能，还具有良好的肉用性能。其育肥期 日增重居四大黄牛之首，饲料报酬和产肉性能均接近世界优良肉牛品种。在肉质上，晋南牛 强度育肥后肉质鲜嫩，色泽鲜红，禍体脂肪洁白，肌纤维束间脂肪沉积明显呈大理石状，符 合高档牛肉标准。
[0003] 分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选 择，从而综合改良畜禽重要经济性状。单核巧酸多态性（SN巧是一类广泛存在于畜禽基因 组上的分子遗传标记，已广泛应用于畜禽遗传育种。SNP的检测方法有多种，其中Snapshot 测序技术主要针对中等通量的SNP分型项目，其主要原理是将测序酶、四种巧光标记的 ddNTP、紧邻多态位点的延伸引物和PCR产物模板按一定体系混合，引物延伸一个碱基即终 止，经测序仪检测，根据峰的颜色可W得知参与反应的碱基种类，从而判断样本在该位点的 基因型。该方法具有分型准确，通量高，不受SNP位点多态性特性限制和样本个数限制等优 点，非常适用于分子育种中的SNP检测。
[0004] Gli3基因是Gli-Kruppel基因家族的成员之一。与家族中的其他基因一样，Gli3 也有5个保守的串联锋指结构，锋指间结构由组氨酸-半脫氨酸连接，该基因在动物的生长 发育过程中具有重要的调节作用。Gli3基因编码的蛋白是一种DNA结合转录因子，能够调 控关闭Sonichedgehog信号传导通路，研究表明Gli3基因表达产物经过裂解可产生抑制 因子阻止Sonichedgehog祀基因表达，而Sonichedgehog又可W抑制Gli3裂解，两者间 相互制约W保证正常形态的形成。现有研究表明Gli3基因对肢体的发育具有抑制作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种与晋南牛生长性状相关的SNP标记及其应用。
[0006] 本发明的另一目的是提供用于检测所述与晋南牛生长性状相关的SNP标记的引 物对及含有该引物对的检测试剂盒。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明的一种与晋南牛生长性状相关的SNP标记，其位于 晋南牛化13基因如SEQIDNO. 1所示序列的92bp处，此处碱基为C的晋南牛的生长性能 显著优于此处碱基为T的晋南牛。
[0008] 本发明还提供用于检测上述与晋南牛生长性状相关的SNP标记的引物对，包括正
[0009] 本发明还提供含有上述引物对的检测试剂盒。所述试剂盒还包括用于Snapshot 检测的延伸引物 5' -TCATTCCCTCTGCTGCCACCGC-3'。
[0010] 优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDM聚合酶、Mg2\PCR反应缓冲液、测序酶、 核酸外切酶、热敏碱性憐酸酶、四种巧光标记ddNTP、标准阳性模板等中的至少一种。
[0011] 本发明还提供所述与晋南牛生长性状相关的SNP标记在鉴定生长性能优的晋南 牛优势品种中的应用。所述应用包括W下步骤：1)提取待测晋南牛的基因组DNA;2)W待 巧惜南牛的基因组DNA为模板，利用所述引物F和R，通过PCR反应扩增出晋南牛化i3基因 162bp片段；3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中92bp处的碱基为C，则待测晋南牛 属于生长性状优的优势品种。 阳01引其中，PCR反应使用的扩增体系W25yl计为：100ng/yl模板DNAliiiaOpmol/ 引物F和R各lyl，PremixTaqTM12. 5^1，（1地2〇 9. 5yl。 阳01引 PCR反应条件为：95°C10分钟；94°C30秒，60°C30秒，72°C30秒，35个循环； 72°C10 分钟。
[0014] 本发明进一步提供所述与晋南牛生长性状相关的SNP标记在晋南牛分子标记辅 助育种中的应用。所述应用包括W下步骤：
[0015] (1)提取待测晋南牛的基因组DNA;
[0016] (2)通过Snapshot方法检测待测晋南牛的基因型；
[0017] (3)根据基因型进行生长性能优的晋南牛优势品种的选育。 阳0化]其中，Snapshot方法中使用的PCR引物对：包括正向引物F5'-GAGTCAGCCCAGCAGAATACTA-3'和反向引物R5'-GGCTACAGAAGACAGCCCTGC-3'。
[0019] Snapshot方法中使用的延伸引物为：5' -TCATTCCCTCTGCTGCCACCGC-3'。
[0020] 本发明对晋南牛的Gli3基因的SNP位点进行基因分型，并对该基因的C92T与晋 南牛的生长性状进行关联分析，通过SAS9. 2软件GLM程序将基因分型结果与晋南牛的生长 性状进行关联分析，结果发现CC型个体的体重和体斜长极显著高于TT型个体（P<0. 01)， CC型个体的胸围显著高于TT型个体（P<0. 05)，CT型个体的体重显著高于TT型个体 (P<0. 05)。该位点的发现为晋南牛生长性状的标记辅助选择提供了科学依据。
[0021] 通过对晋南牛Gli3基因进行单核巧酸多态性分析，将与生长性状相关的SNP作为 分子标记，为晋南牛生长性状的标记辅助选择提供了科学依据。
[0022] 本发明具有如下优点：
[0023] (一）本发明提供的分子遗传标记不受晋南牛的年龄、性别等限制，可用于晋南牛 的早期选育，甚至在刚出生时就可准确地进行筛选，可显著促进晋南牛的育种进程。
[0024] (二）检测晋南牛Gli3基因单核巧酸多态性的方法准确可靠，操作简便。
[00对 （S)晋南牛的Gli3基因的SNP位点的检出，为晋南牛生长性状的分子标记辅助 选择提供了科学依据。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明实施例1中晋南牛S种基因型测序图。
[0027] 图2为本发明实施例1中晋南牛S种基因型Snapshot测序分型图。
【具体实施方式】
[0028]W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0029] 实施例1与晋南牛生长性状相关的SNP标记的获得
[0030] 1. 1待测晋南牛血液基因组DNA的提取
[0031] 尾静脉采集待测晋南牛血液，采血管中含有抗凝剂，抗凝血样冷冻保存运送至实 验室。
[0032] 利用BioTeke全血基因组DNA提取试剂盒从抗凝血样品中提取基因组DNA，具体步 骤如下：
[0033] (1)在1. 5ml离屯、管中，加900y1红细胞裂解液，将抗凝全血恢复到室溫并颠倒混 匀，吸取300y1全血到离屯、管中，室溫放置lOmin，期间多次颠倒混匀；
[0034] (2) 1200化pm离屯、Imin，倒弃红色上清（上清主要是血清，红细胞碎片等杂质，管 底残留的为白色细胞团为白细胞）；
[0035] (3)再加300y1红细胞裂解液重悬细胞团，重新裂解残留的红细胞碎片后，重复 W上步骤（1)和（2)，彻底清除红细胞碎片，否则会影响后续DNA质量；
[0036] (4)縱满振荡直到管底白细胞团重悬，分散；
[0037] 妨加300y1细胞核裂解液重悬白细胞团，在55°C溫育30-60min，直到白细胞裂 解完全，此步骤至关重要，将影响后续DNA产量；
[00測 （6)加100y1蛋白沉淀液，縱满振荡混匀；
[0039] (7) 1300化pm离屯、5min，管底出现暗褐色蛋白沉淀；小屯、取上清约350y1到新的 1. 5ml离屯、管；
[0040] (8)加300y1异丙醇轻柔颠倒混匀，会出现大团絮状或丝状DNA;12000巧m离屯、 Imin，管底可见白色DNA沉淀，倒弃上清；
[0041] (9)加500y1 70%乙醇，颠倒多次漂洗DNA，12000巧m离屯、Imin，小屯、倒掉上清， 然后倒置在吸水纸上轻叩几下W控干残留乙醇，枪头吸尽管底和管壁残留乙醇，空气中惊 干静置lOmin;
[0042] (10)加50-100y1DM溶解液灯6缓冲液），轻弹管壁均匀，室溫或4°C放置一周 重新水化DNA，期间轻弹管壁，帮助充分水化DNA;DNA可存放在2-8°C，如需要长期保存，需 放在-20°C冰箱。
[0043]1. 2扩增含SNP位点的核巧酸片段
[0044] 根据NCBI数据库公布的Gli3基因序列（Gene10:785371)设计引物，包括正向引 物F5，-GAGTCAGCCCAGCAGAATACTA-3,和反向引物贴' -GGCTACAGAAGACAGCCCTGC-3'。W1. 1 中的基因组DNA为模板，扩增出待测SNP所在的核巧酸片段，如SEQIDNO. 1所示。该SNP 位点位于PCR扩增片段的92bp处，此处碱基可W为C或T。 W45]PCR反应使用的扩增体系W25y1计为：lOOng/y1模板DNA1y1，lOpmol/y1引 物F和R各 1y1，PremixTaq? 12. 5y1，dd&O9. 5y1。
[0046]PCR反应条件为：95°C10 分钟；94°C30 秒，60°C30 秒，72°C30 秒，35 个循环； 72°C10 分钟。
[0047] 1.3检测PCR扩增片段，获得SNP标记
[0048] 对1. 2中的P