一种鉴别生长性能优异的晋南牛的igf2基因分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种鉴别生长性能优异的晋南牛的IGF2 基因分子标记SNP、SNP的引物、SNP的试剂盒及鉴别方法。
【背景技术】
[0002] 生长性状是肉牛主要的经济性状，其主要包括体高、体重、体斜长、胸围、腹围、腰 脚宽、坐骨端宽及十字部高等指标。同时生长性状是受多基因座位控制的数量性状，表型选 择遗传进展缓慢，影响生长性状的主基因的确定对我国地方黄牛品种向肉用方向培育有重 要意义。
[0003] 单核苷酸多态性（SNP)是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学 者Lander提出的一类遗传标记，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现形式有转换、颠换、插 入和缺失等。测序、单链构象多态性聚合酶链式反应、限制性片段长度多态性聚合酶链式反 应及飞行时间质谱等技术可以实现SNP的检测。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因 定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。
[0004] 胰岛素样生长因子2 (insulin-like growth factor 2)又称为生长调节素A，是 由67个氨基酸残基组成的蛋白质，具有诱导细胞分化、促进有丝分裂、胚胎形成、调控机体 生长发育的作用。前人研究证明IGF2在牛的骨骼肌再生过程中发挥着重要的作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种用于鉴别生长性能优异的晋南牛的IGF2基因分子标 记SNP及其应用。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] 本发明提供了一种用于鉴别生长性能优异的晋南牛的IGF2基因分子标记SNP，所 述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，第71位点处的碱基为C或T，此处碱基为C 的晋南牛的生长性能显著高于此处碱基为T的晋南牛。
[0008] 本发明还提供了检测所述分子标记SNP的引物对，核苷酸序列如下：
[0009] 正向引物 F : 5 ' -TGGCAGCGACTGCTACTATTG-3 '，
[0010] 反向引物R :5 ' -GAGCACTCCAAAGGCAGCTTT-3 '，
[0011] SNP 分型延伸引物：5 ' -AGTCGAGAGCCTGGGGCACCAG-3 '。
[0012] 所述引物对特异性扩增出SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0013] 本发明还提供了一种用于鉴别生长性能优异的晋南牛的试剂盒，所述试剂盒包括 引物F、引物R、SNP分型引物、Premix TaqTM、ExoI、FastAP、ExoI bufTer、Snapshot Mix中 的一种或多种，其中Premix TaqTM由dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+、PCR缓冲液组成。
[0014] 本发明还提供了一种利用SNP标记鉴定生长性能高的晋南牛的方法，包括如下步 骤：
[0015] (1)提取待检测晋南牛的基因组DNA ;
[0016] (2)以第一步获得的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物F和R进行 PCR扩增，获得晋南牛IGF2基因上203bp的目的片段；PCR反应体系为25 y L，其中100ng/ yL 基因组 DNA 模板 1 yL，10pmol/yL 引物 F 和R 各 1 yL，12. 5yL Premix TaqTM，9. 5yL ddH20, PCR 反应条件为：95 °C lOmin ;94 °C 30sec，60 °C 30sec，72 °C 30sec，35 个循环； 72〇C lOmin ；4°C forever ；
[0017] (3)利用SnaPshot技术检测PCR产物，首先对PCR产物纯化：取PCR产物用Exol 和FastAP纯化，主要是用Exol去除反应产物中的剩余引物，用FastAP去除反应中剩余的 DNTP，反应体系为 PCR 产物 3ul，Exol 0.2ul，FastAP 0.8ul，Exol buffer 0.7ul，补水至 7ul，反应条件为37°C 15min，80°C 15min ;然后进行延伸反应：体系为已纯化PCR产物2ul， Snapshot Mix试剂lul，延伸引物混合2ul，补水至6ul，条件为96°C lmin ;96°C 10sec， 52°C 5sec，60°C 30sec，30 个循环；取 lul 延伸产物，加 lOul 上样 loading，95°C变性 3min， 立即冰水浴，上测序仪，如果扩增产物序列中71bp处为C，则待测晋南牛属于生长性能高的 优势个体。
[0018] 本发明还提供了下述任一应用：
[0019] (1)上述分子标记SNP在鉴定生长性能高的晋南牛优势品种中的应用；
[0020] (2)上述引物对在鉴定生长性能高的晋南牛优势品种中的应用；
[0021] (3)上述试剂盒在鉴定生长性能高的晋南牛优势品种中的应用；
[0022] (4)上述方法在鉴定生长性能高的晋南牛优势品种中的应用。
[0023] 本发明原理及有益效果：
[0024] 本发明通过对晋南牛IGF2基因的SNP位点进行基因分型，利用SAS9. 2软件的 GLM过程把基因分型结果与晋南牛的生长性状进行关联分析发现CC型个体的体重、体斜 长和胸围极显著高于TT型个体（P〈0. 01)，CC型个体的体重和胸围显著高于CT型个体 (P〈0. 05)。该位点的发现为进行分子育种提供了新的标记。
[0025] 本发明提供的鉴定生长性能高的晋南牛优势品种的方法准确可靠，方便易行，而 且本发明提供的SNP标记不受年龄、性别等限制，可用于早期选育，加快育种进程。
【附图说明】
[0026] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0027] 图1为本发明中晋南牛三种基因型SnaPshot测序分型图，其中（a)为CT型，（b) 为CC型，（c)为TT型；
[0028] 图2为本发明中晋南牛三种基因型测序图。
【具体实施方式】
[0029] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0030] 实施例1与晋南牛生长性状相关的IGF2基因分子标记的获得及鉴定
[0031] L 1待测晋南牛血液基因组DNA的提取
[0032] 尾静脉采集待测晋南牛血液，常温放置3-4小时待血液凝固，此时血液分为血清 和凝血块两部分，血清呈清亮黄色，凝血块为暗红色，牛血液中只有白细胞内含有DNA，存在 于凝血块中。
[0033] 利用天根血液/细胞/组织基因组DNA样品提取试剂盒从凝血块中提取基因组 DNA，具体步骤如下：
[0034] 用眼科剪剪取0. 2-0. 3mL的凝血块放入已灭菌的2mL圆底离心管中，加入500 y L 的细胞裂解液CL ;
[0035] 利用手持匀浆仪将血块充分匀浆，振荡15s，12000rpm离心lmin，弃去上层暗红色 上清液；
[0036] 再次加入700 y L细胞裂解液CL，充分振荡使下层沉淀散开悬浮，12000rpm离心 lmin，弃去上清液；
[0037] 加入200 y L缓冲液GS，充分涡旋至沉淀充分悬浮；
[0038] 加入20 y L蛋白酶K和250 y L缓冲液GB，充分混匀；
[0039] 将离心管用封口膜封好放入到56°C杂交炉中消化3-4小时，为确保充分消化，消 化过程中需要颠倒混匀数次，最终溶液变成清亮透明，简短离心；
[0040] 加入200 ii L冰镇无水乙醇，上下颠倒混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀；
[0041] 将上一步所得溶液转入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12000rpm离心30s， 弃去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
[0042] 向吸附柱CB3中加入500 y L去蛋白缓冲液⑶，静置2min，12000rpm离心30s，弃 去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
[0043] 向吸附柱CB3中加入700 y L漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液， 将吸附柱放入收集管中；
[0044] 向吸附柱CB3中加入500 y L漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液；
[0045]