蕈状芽胞杆菌r2菌株及其在防治植物根结线虫病中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业微生物学技术及生物化学与分子生物学技术领域，具体地指一种 蕈状芽胞杆菌（Bacillus mycoides)R2菌株及其在防治植物根结线虫病中的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着农业产业结构的调整，设施蔬菜种植面积越来越大。由于倒茬困难， 且复种指数逐渐提高，根结线虫的危害日渐严重，发生区域不断扩大，是设施蔬菜持续发展 的主要限制因素之一。根结线虫（Meloidogyne spp.)在全世界广泛分布，寄主范围广。 茄科、豆科、萌芦科蔬菜受根结线虫的危害最重，造成的减产损失一般在10%左右，重达 75% (Dicklow et al，1993)。据调查，在我国发现的蔬菜根结线虫，主要有南方根结线虫 (Meloidogyne incognita)、花生根结线虫（M.arenaria)、北方根结线虫（M.hapla)和爪唾 根结线虫（M.javanica)4个种。在南方4种根结线虫都有发生，在北方温室大棚主要是南 方根结线虫（彭德良，2001)。
[0003] 对根结线虫的防治，目前国内主要采用化学杀线虫剂，如氯化苦、溴甲烷、滴滴混 剂、二溴乙烷、二溴丙烷和吸剂呋喃丹、灭线磷、涕灭威和威百亩等。化学药剂虽然杀虫快， 效果好，但用量大，成本高，且对人畜剧毒，破坏土壤微生态环境（杨文香等，2003)。近年 来，随着科技的进步和人们环保意识的加强，生物防治方法引起了人们的高度重视，将逐渐 成为综合防治的重要手段之一。资料报道，线虫天敌主要有真菌、细菌、病毒、立克氏体、放 线菌、捕食性线虫等，将真菌和细菌作为生防因子的报道较多（汪来发等，2002)。
[0004] 从天然资源中寻找和发现具有杀线虫活性的化合物，是研发环保生物杀线虫剂的 重要途径。目前，从微生物和植物中分离得到的具有杀线虫活性的次生代谢产物已有200 多个，这些活性代谢产物结构类型多种多样，包括萜类、肽类、大环内酯类、生物碱类、杂环 类、甾醇类、醌类、炔类、简单芳香类、脂肪酸类、木脂素类、神经酰胺类、preussomerin类和 哌嗪类等（Niu et al.，2009)。1981 年，Hayashi 等（Hayashi et al.，1981)从乳白耙齿 菌中分离出二氧烷基化氢醌，其对稻杆尖线虫的ED50是25mg/L。Zuckerman等（Zuckerman et al.，1996)报道了一株黑曲霉在实验室、温室和大田试验中对南方根结线虫都具有较 强的毒杀活性，鉴定该菌培养液中含有柠檬酸、草酸等。May er(Mayer et al.，1999)和 Stemer(Stemer et al.，1997)从奥尔类脐燕的发酵液中分离到环十二缩肽omphalotin A， 它是具有很大的商业价值的次级代谢物，对南方根结线虫的杀虫活性高于目前广普遍使用 的阿维菌素，但由于得率太低而不能实现产业化生产。
[0005] 秀刚隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)生存于复杂的土壤环境中，具备了结构 简单但功能完善的神经系统，尤其是其发达的化感体系，使其成为研究神经系统发育和相 关行为的重要模式生物。线虫的化感神经元主要集中在头部，共12对，均具有纤毛结构， 线虫通过这些化感神经元可检测环境中多种化学物质及环境条件。例如线虫可检测挥发 性、水溶性等物质，以及温度、氧浓度和pH等环境条件，而这些信号往往是与食物、危险等 环境因子联系在一起。线虫以这些信号为线索，判断环境利害，产生趋化、逃避等一系列的 应激行为。在线虫的化感应激行为中，由其嗅觉神经元介导的对挥发性物质的检测和应答 反应最为迅速，这也是它寻找、追踪食物，远离病原菌和危险环境的最佳工具。除了食物性 细菌可以产生吸引线虫的物质外，最近的研究表明，许多病原微生物也能对线虫产生强烈 的吸引，包括常见的病原细菌铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa)和粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens)等。线虫对挥发物质的检测主要依赖于嗅觉神经元，其中检测吸引 性的挥发物质主要依赖于神经元AWA和AWC，而感知驱避性挥发物质如驱避剂2-壬酮的主 要为 AWB 神经元（Troemel et al.，1997) 〇
[0006] DEET也是人工合成的应用最广泛的昆虫驱避剂（Katz et al.，2008)，报道其对 蚊、蠓、白蛉及蚋有良好的驱避效果，对虻、蜱、螨、旱蚂蝗驱避效果一般。DEET是很多驱避 花露水中的有效成分，驱避效果迅速，有效驱避时间4~8h不等，且毒性低，几乎不污染环 境。研究发现果蝇和蚊通过嗅觉神经元感知DEET的驱避作用，识别DEET的嗅觉受体蛋白 为 0R83b (Mathias et al.，2008 ;Syed and Leal, 2008)。苯乙烯用于有机合成，具有挥发 性。然而，对于这两种物质对线虫的驱避机制未见报道。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题就是提供一种蕈状芽胞杆菌（Bacillus mycoides)R2 菌株及其在防治植物根结线虫病中的应用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明提供的一种蕈状芽胞杆菌（Bacillus mycoides) R2菌株，其保藏编号为CCTCC NO :M 2015251。本发明所提供的蕈状芽胞杆菌（Bacillus mycoides)R2菌株经16S rRNA分析和其他形态学等分析，确定该菌株为蕈状芽胞杆菌 (Bacillus mycoides)，其命名为章状芽胞杆菌（Bacillus mycoides) R2,该菌种已于2015 年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC);保藏登记号为CCTCC NO :M 2015251 ;保藏地点为：中国、武汉、武汉大学。
[0009] 进一步，所述蕈状芽胞杆菌（Bacillus mycoides)R2菌株发酵的发酵液中含有具 有抗虫活性物质的N，N-二乙基-间-甲苯甲酰胺和苯乙烯。
[0010] 1、蕈状芽胞杆菌（Bacillus, mycoides) R2的菌学特征：
[0011] 蕈状芽胞杆菌（Bacillus mycoides) R2菌体革兰氏阳性，长杆状，菌体大小1~ 1.2以111\2.7~3.6以111，具圆端，链状排列。中生芽孢，且芽孢椭圆形，孢囊不膨大。在1^平 板上形成米白色的菌落，菌落直径3~5mm，菌落表面粗糙、卷曲、边缘有毛状突起，不隆起， 不透明，37°C生长明显快于28°C。
[0012] 2、N，N-二乙基-间-甲苯甲酰胺（DEET)和苯乙稀，通过以下步骤制备得到：
[0013] 蕈状芽胞杆菌（Bacillus mycoides)R2菌株的发酵液，离心后收集上清液。上清液 按极性从小到大、以1 : 1的比例，分别与石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行逐步萃取，取 各萃取相浓缩后进行抗虫活性测定，将有活性的萃取相通过HPLC进一步分离纯化，LC-MS 分析确定活性物质的结构，在活性分析后，对有活性的物质进行真空冷冻干燥进行浓缩，即 得抗虫活性物质N，N-二乙基-间-甲苯酰胺和苯乙烯；具体步骤如下：
[0014] 首先要先测试蕈状芽胞杆菌R2菌株发酵的最佳装样量，将保存的蕈状芽胞杆菌 R2菌株在LB平板培养基上进行活化后，用接种环挑取单菌落分别接入装有25ml、50ml、 75ml、100ml、125ml LB液体培养基的三角瓶中，在28 °C，200rpm/min摇床中培养三天。 8000rpm/min，离心5min，弃沉淀，取上清。
[0015] 测定其对秀丽隐杆线虫的校正致死率，比较不同装样量的抗虫活性。秀丽隐杆 线虫致死率的测定：在96孔细胞培养板中每个孔里依次加入5 y 15-氟尿嘧啶（12. 5mg/ L)，3 y 1氯霉素，1 y 1链霉素，200 y 1 R2上清液，最后加入30条生长状态相当且处于L4 期的秀丽隐杆线虫，每个处理设三个重复。24h后观察并计算秀丽隐杆线虫致死率，致死 率最高的装样量即为最佳装样量；采用最佳装样量进行发酵，3d后得到发酵液，发酵液于 8000rpm/min，离心5min，弃沉淀，取上清。上清液按极性从小到大、以1:1的比例，分别与石 油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行逐步萃取，取各萃取相旋转蒸发，用lml无菌水溶解旋转 蒸发的物质，浓缩后进行抗虫活性测定；将有活性的萃取相浓缩液做HPLC，每次上样量为 25 y 1，流速0. 5mL/min，10 % -80 %乙腈为流动相，将HPLC洗脱曲线各峰值的组分分别收集 并进行活性检测；将HPLC洗脱曲线峰值中检测有活性的相对应的组分进行LC-MS分析，上 样量为25 y 1，流速0. 5mL/min，10% -80%乙腈为流动相，对活性峰经质谱解析，经meplin 数据库检索，和相关标准图谱的对比分析，可以确定活性物质的组成结构，确定抗虫活性物 质为N，N-二乙基-间-甲苯酰胺和苯乙烯。
[0016] 本发明提供了一种蕈状芽胞杆菌（Bacillus myC〇ideS)R2菌株在防治和杀灭植物 根结线虫中的应用。
[0017] 包括以下步骤：
[0018] 1)将所述的蕈状芽胞杆菌（Bacillus myC〇ideS)R2菌株进行发酵培养，得到发酵 液；其中，25ml的LB液体培养基（250ml三角瓶）中接种单菌落（单菌落是为了保