一种嗜碱性假单胞杆菌降解蒽、芘的方法与流程

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种嗜碱性假单胞杆菌降解蒽、芘的方法。

背景技术：

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)由两个或两个以上苯环组成，具有结构稳定、难以生物降解的性质，是一类普遍存在于环境中的具有致癌、致畸、致突变的有机污染物，对生态环境和人类健康构成了巨大威胁，因此对PAHs的降解是人们关注的一项重要研究。

对于PAHs，主要是利用微生物如真菌、细菌、放线菌对其进行降解。PAHs是石油中芳香族化合物的主要成分，而石油污染常常伴随着盐碱化环境的存在，目前能降解PAHs的许多细菌真菌，在高盐碱环境中代谢受到抑制，其降解PAHs的效率降低，因此，筛选出能够在盐碱环境中高效降解PAHs的微生物具有重要的现实意义。

蒽(An)、芘(Pyr)是典型的PAHs，在水中的溶解度为极小，其结构单元在致癌性苯并[a]蒽(Ba[a]A)和苯并[a]芘(Ba[a]P)中同样存在，经常被用作微生物降解PAHs的模型化合物。因此，研究能够在盐碱环境中高效降解蒽、芘的微生物对于构建多环芳烃类物质生物降解模型极为重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种嗜碱性假单胞杆菌降解蒽、芘的方法，旨在构建多环芳烃类物质生物降解模型，解决盐碱环境中微生物活性受抑制，对蒽、芘的降解效率降低的问题。

本发明是这样实现的，一种嗜碱性假单胞杆菌降解蒽、芘的方法，包括如下步骤：

1)菌种采集

a.从油田含油土壤中采集土壤样品于无菌袋中，4℃冰箱密封保存；

b.将上述土壤样品于选择性的含蒽、芘的无机盐培养基的锥形瓶中进行摇床培养，经五代(蒽、芘的初始质量浓度从5g·L^-1逐步提升至10g·L^-1)培养后，取适量培养液稀释并涂布于选择性固体平板；待有明显菌落出现时，从中选择形态特征相异的各种菌落作进一步的划线纯化工作，5个周期后得到纯菌株；将所得各菌制备成菌悬液并重新接至选择性的含蒽、芘无机盐培养基进行复筛，选取降解率较高的菌株作为优势菌株，进一步接种营养肉汤培养基进行富集培养24h后，保存于营养琼脂斜面上，4℃冰箱保存备用。

c.将0.5mL菌悬液与0.5mL保护剂等体积加入5mL安培瓶中振荡均匀后，置于-80℃下迅速冷冻6h后，用冻干机进行真空冷冻干燥，冻干后直接在冻干舱中压盖密封。

2)菌种复活

取冻干菌种，用75％的酒精棉消毒菌种接种管外壁后，用砂轮在安瓿瓶上三分之一处划痕，用干燥的无菌纱布包裹安瓿瓶，将安瓿瓶掰开；用吸管将营养肉汤培养基0.3mL注入被开启的菌种安瓿瓶中并振荡，使安瓿瓶中的冻干菌种溶解成菌悬液。

将安瓿瓶中菌悬液吸出，接种到营养琼脂斜面上，接种3管斜面，将接种后的营养琼脂斜面置于培养箱中进行培养，观察菌苔生长情况，后加入甘油保存备用。

3)菌种扩大

称取营养肉汤培养基，加入蒸馏水，121℃下灭菌15min，后接种2接种环，37℃培养24h备用。

4)蒽、芘降解试验

a.分别称取0.5g蒽、芘于两个反应瓶中，然后加入活性炭，加入10.0mL环己烷溶液溶解振荡，并常温挥发，待环己烷溶液挥发完后，加入菌种扩大悬液，塞上瓶塞，分多组试验在一定温度下恒温震荡培养，之后测定其脱氢酶活性。

b.分别称取0.5g蒽、芘于两个反应瓶中，然后加入活性炭，分多组试验加入一定体积的2mol/L的NaCl溶液，并加入10.0mL环己烷溶液溶解振荡，常温挥发，待环己烷溶液挥发完后，加入菌种扩大悬液，塞上瓶塞，35℃温度恒温震荡培养7天，之后测定其脱氢酶活性。

c.分多组称取一定质量的蒽、芘，然后加入活性炭，并加入10.0mL环己烷溶解振荡，并常温挥发，待环己烷溶液挥发完后，加入菌种扩大悬液，塞上瓶塞，35℃温度恒温震荡培养7天，之后测定其脱氢酶活性。

进一步地，所述步骤1)a中采集土壤样品为距离地面深10cm，选取五个点均匀采样，每个点的样品采集范围为1m²，每个点采集土壤为100g，采集后将五个采集点的土壤混匀，按照四分法将混合土壤逐渐的减少，留取250g的混合土壤样品于无菌袋中。

进一步地，所述步骤1)b中所述无机盐培养基：NH₄NO₃ 2g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2g/L，CuSO₄ 0.1g/L，无水CaC1₂ 0.01g/L，Na₂EDTA·2H₂O 0.01g/L；无机盐固体培养基中加入2％琼脂；

所述含蒽、芘无机盐培养基：分别用正己烷配制5g/L的蒽、芘溶液，滤膜过滤除菌，取一定量该溶液置于灭菌的锥形瓶中，待正己烷溶液挥发完毕后加入灭菌的无机盐培养基；

所述富集培养：营养肉汤培养基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉浸出粉5.0，氯化钠5.0，pH：7.3±0.1；

所述保藏培养：营养琼脂培养基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉浸出粉5.0，氯化钠5.0，琼脂12.0，pH：7.3±0.1。

进一步地，所述步骤1)c中所述菌悬液是将嗜碱性假单胞杆菌接入富集培养基中37℃振荡培养1天后的培养液，所述保护剂为无菌1.5％NaCl溶液、115℃灭菌30min后的明胶和糖溶液、煮沸灭菌的脱脂乳、经0.22μm滤膜过滤后的维生素C溶液。

进一步地，所述步骤1)c中所述冷冻干燥过程分为两步，第一步冷冻干燥程序真空度为0.100mbar，冻干18h；第二步冷冻干燥程序真空度为0.034mbar，冻干2h。

进一步地，所述步骤2)中接种后的营养琼脂斜面于培养箱中的培养温度为37℃，培养时间为72小时。

进一步地，所述步骤4)a、b、c中加入活性炭的质量均为5.0g，加入菌种扩大悬液的体积均为5.0mL。

进一步地，所述步骤4)a中多组试验恒温震荡的温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃，培养时间为7天。

进一步地，所述步骤4)b中多组试验加入NaCl溶液的体积分别为200μL、250μL、300μL、350μL、400μL。

进一步地，所述步骤4)c中称取蒽、芘的质量分别为0.3g、0.5g、0.7g、1.0g。

本发明的有益效果是：本发明提供的嗜碱性假单胞杆菌降解蒽、芘的方法，从油田含油土样中分离出的嗜碱性假单胞杆菌能够在盐度为0.65％-0.75％的环境中有效降解蒽、芘。降解蒽模型中优化试验检测表明，降解温度为35.7℃，PAHs/活性炭百分数为3.89％，培养5天测定得到脱氢酶量值达140.353±6.43μg；降解芘模型中优化试验检测表明，降解温度为34.8℃，PAHs/活性炭百分数为6.39％，培养5天测定得到脱氢酶量值达84.032±0.063μg；本发明在盐碱环境中降解蒽、芘效率高，方法简单。

附图说明

图1是本发明实施例提供的嗜碱性假单胞杆菌降解蒽(An)、芘(Pyr)时温度对降解产生的脱氢酶量的影响。

图2是本发明实施例提供的嗜碱性假单胞杆菌降解蒽(An)、芘(Pyr)时盐度对降解产生的脱氢酶量的影响。

图3是本发明实施例提供的嗜碱性假单胞杆菌降解蒽(An)、芘(Pyr)时PAHs/活性炭百分数对降解产生的脱氢酶量的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

本发明实施例提供的嗜碱性假单胞杆菌降解蒽、芘的方法，包括：

1.实验部分

1.1嗜碱性假单胞杆菌菌种的培养

1)菌种采集

a.以陕西济源油田周边被石油污染的土壤为实验样品。采集方法是：用小铁锹去掉土地层的土壤，选取五个点均匀采样，采样时采集距离地面深10cm处的土壤，每个点的样品采集范围为1m²,每个点采集土壤大约为100g，采集完成后将五个采集点的土壤混合在一起，充分混匀，按照四分法将混合土壤逐渐的减少，留取250g的混合土壤样品装入无菌袋中带回实验室，于4℃冰箱密封保存，用于后期的菌种分离。

b.向上述土壤样品中加入适量蒸馏水，放置1天，静止后，取10mL上清液于盛有100L选择性的含蒽、芘的无机盐培养基的锥形瓶中进行摇床培养，经5代(蒽、芘的初始质量浓度从5g·L^-1逐步提升至10g·L^-1)培养后，取适量培养液稀释并涂布于选择性固体平板；待有明显菌落出现时，从中选择形态特征相异的各种菌落作进一步的划线纯化工作，5个周期后得到纯菌株；将所得各菌制备成菌悬液并重新接至选择性的含蒽、芘无机盐培养基进行复筛，选取降解率较高的菌株作为优势菌株，进一步接种营养肉汤培养基进行富集培养24h后，保存于营养琼脂斜面上，4℃冰箱保存备用。

无机盐培养基：NH₄NO₃ 2g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2g/L，CuSO₄ 0.1g/L，无水CaC1₂ 0.01g/L，Na₂EDTA·2H₂O 0.01g/L；无机盐固体培养基中加入2％琼脂；

含蒽、芘无机盐培养基：分别用正己烷配制5g/L的蒽、芘溶液，滤膜过滤除菌，取一定量该溶液置于灭菌的锥形瓶中，待正己烷挥发完毕后加入灭菌的无机盐培养基；

富集培养：营养肉汤培养基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉浸出粉5.0，氯化钠5.0，pH：7.3±0.1；

保藏培养：营养琼脂培养基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉浸出粉5.0，氯化钠5.0，琼脂12.0，pH：7.3±0.1。

c.将0.5mL菌悬液(将嗜碱性假单胞杆菌接入富集培养基中37℃振荡培养1天后的吸取量)与0.5mL保护剂(溶剂为无菌1.5％NaCl溶液，115℃灭菌30min后的明胶和糖溶液，煮沸灭菌的脱脂乳，经0.22μm滤膜过滤后的维生素C溶液)等体积加入5mL安培瓶中振荡均匀后，置于-80℃下迅速冷冻6h后，用冻干机进行真空冷冻干燥，冷冻干燥过程分为两步，第一步冷冻干燥程序真空度为0.100mbar，冻干18h；第二步冷冻干燥程序真空度为0.034mbar，冻干2h，冻干后直接在冻干舱中压盖密封。

2)菌种复活

取冻干菌种，用75％的酒精棉消毒菌种接种管外壁后，用砂轮在安瓿瓶上三分之一处划痕，用干燥的无菌纱布包裹安瓿瓶，将安瓿瓶掰开。用吸管将营养肉汤培养基0.3mL注入被开启的菌种安瓿瓶中并振荡，使安瓿瓶中的冻干菌种溶解成菌悬液。

将安瓿瓶中菌悬液吸出，接种到营养琼脂斜面上，接种3管斜面，将接种后的营养琼脂斜面置于培养箱中，37℃培养72小时，观察菌苔生长情况，后加入甘油保存备用。

3)菌种扩大

称取营养肉汤培养基，加入蒸馏水，121℃下灭菌15min，后接种2接种环，37℃培养24h备用。

1.2蒽单因子试验

1)温度单因子试验

称取0.5g蒽于反应瓶中，加入5.0g活性炭和10.0mL环己烷溶液溶解振荡，并常温挥发，待环己烷溶液挥发完后，加入5.0mL菌种扩大悬液，塞上瓶塞，并根据试验设计温度25℃、30℃、35℃、40℃恒温震荡培养7天，后测定其脱氢酶活性。

2)盐度单因子试验

称取0.5g蒽于反应瓶中，加入5.0g活性炭，按照试验设计加入200μL、250μL、300μL、350μL、400μL浓度为2mol/L的NaCl溶液，并加入10.0mL环己烷溶解振荡，并常温挥发，待环己烷溶液挥发完后，加入5.0mL菌种扩大悬液，塞上瓶塞。35℃温度下恒温震荡培养7天，后测定其脱氢酶活性。

3)PAHs/活性炭百分数单因子试验

分别称取0.3g、0.5g、0.7g、1.0g蒽于反应瓶中，加入5.0g活性炭和10.0mL环己烷溶解振荡，并常温挥发，待环己烷溶液挥发完后，加入5.0mL菌种扩大悬液，塞上瓶塞。35℃温度下恒温震荡培养7天，后测定其脱氢酶活性。

4)脱氢酶活性测定

称取1.0g上述降解后的培养物离心洗涤后置于反应瓶中，加入3mL蒸馏水，2.0mL分析纯HCl溶液，振荡均匀后再加入0.5mL红四氮唑溶液，37℃培养24h后立即取出，滴加2滴浓硫酸终止反应，振荡再加入5.0mL甲苯振荡分层，4000rpm/min离心，以甲苯为空白对照，取有机层于紫外分光光度计λ＝486nm处测定吸光度值，并与标准曲线对比计算其脱氢酶活性。

1.3芘单因子试验

假单胞杆菌对芘的降解单因子试验其操作与蒽单因子试验类似，降解条件及各试验参数相同。

1.4蒽、芘响应面试验设计

以温度、盐度、PAHs/活性炭百分数百分数为自变量，分别以A、B、C(X1、X2、X3)表示，并以-1、0、+1分别表示自变量低、中、高水平，以脱氢酶活性为响应值，分别以Y1、f1表示。进行响应面试验设计，试验因素及因素水平见表1、表2。

表1蒽降解响应面试验因素及水平

表2芘降解响应面试验因素及水平

2.结果与讨论

2.1蒽、芘单因子试验

1)温度单因子试验结果

如图1所示，蒽、芘温度单因子试验中，对于嗜碱性假单胞杆菌降解蒽、芘温度的影响具有同步性，温度为30℃时，菌体的生长状况最好，其次是温度为35℃、37℃时，当温度为25℃和40℃时，菌体的生长状况较差；温度为35℃时，试验菌降解蒽、芘的脱氢酶量最大。

2)盐度单因子试验结果

如图2所示，蒽、芘盐度单因子试验中，对于嗜碱性假单胞杆菌降解蒽、芘盐度的影响具有同步性，盐度为0.7％时，试验菌降解蒽、芘的脱氢酶量最大。

3)PAHs/活性炭百分数单因子试验结果

如图3所示，蒽、芘PAHs/活性炭百分数单因子试验中，对于嗜碱性假单胞杆菌降解蒽、芘物质质量百分数的影响存在差异性，降解蒽的最适的物质质量百分数因素条件是5％，降解芘的最适的质量百分数因素条件是7％，由蒽、芘化学结构以及溶解性比较可知，蒽为多环芳烃组成的三苯戒指表面张力(dyne/cm)为47.9、介电常数(F/m)为3.08、极化率(10-24cm³)为24.55；而芘为有并四苯结构极化率(10-24cm³)为28.72，非极性吸附剂中蒽被吸附效果较芘好，在较低百分含量的活性炭即可达到较好的吸附效果，而芘在同等条件下被活性炭吸附的效果好。

2.2响应面试验

1)模型建立与分析

试验采用三因素三水平响应面法优化嗜碱性假单胞杆菌降解蒽、芘的因素条件，试验按照Design-Expert软件中Box-Behnken Design，试验设计与结果如表3、表4所示。

表3蒽响应面实验方案及结果

表4芘响应面实验方案及结果

按照Design-Expert软件中Box-Behnken Design模型对试验中脱氢酶量的进行回归分析，得两条回归方程，其中蒽、芘物质的降解脱氢酶量回归方程分别为：

Y＝140.35+10.43*A-1.58*B-5.37*C-12.77*A*B+15.19*A*C+9.67*B*C-34.19*A²-25.24*B²-18.97*C²

F＝84.03+5.13X₁+5.15X₂-8.12X₃-5.43X₁X₂-0.049X₁X₃-1.15X₂X₃-25.02X₁²-4.17X₂²-11.40X₃²

式中Y表示嗜碱性假单孢杆菌降解蒽物质过程中产生的脱氢酶量，F表示嗜碱性假单孢杆菌降解芘物质过程中产生的脱氢酶量，A、B、C、X₁、X₂、X₃分别为表1、表2所示的自变量编码值，蒽降解回归方程的R₁²＝0.8792，芘降解回归方程的R₂²＝0.9675，通过模型的回归系数显著性检验分析可得，嗜碱性假单孢杆菌降解蒽过程产生脱氢酶量模型的F值为5.66(F-valμe pro＝0.0016<0.05)，意味着该模型拟合程度是显著的，仅有1.62％可能模型是由于噪声，且模型失拟系数1.584是不显著的，由模型信噪比检验可知道，该模型精密度为6.821(精密度大于4是可取的)，即该模型可以用来设计空间试验。同时在三个自变量以及两两之间的交互作用对于蒽的物质降解产生的脱氢酶量的影响效果不显著，但在该模型中A²，B²，C²对于蒽的物质降解产生的脱氢酶量的影响效果是显著的。此外该模型的主效应影响为：A>C>B。嗜碱性假单孢杆菌降解芘过程产生脱氢酶量模型的F值为23.15(F-Valμe pro＝0.0002<0.01)是极显著的，该模型仅有0.02％的可能模型F-Valμe是由于噪声。在该模型中X₁，X₂，X₃，X₁²，X₃²是显著的模型参数，同时模型R-Sqμared＝0.9675，为更加准确的反映降解模型，将该模型的R-Sqμared调整为0.9257。模型失拟系数<0.01，可能存在噪声因素的可能性较大，但是在模型信噪比检测中精密度为13.837(精密度大于4是可取的)，即该模型可以用来设计空间试验，在该模型的主效应影响中分别为X₃，X₂，X₁。

2)模型最优化试验参数

根据Design-Expert Box-Behnken模型设计，得出嗜碱性假单胞杆菌对蒽的降解温度为35.73℃、降解盐度为0.69％、PAHs/活性炭百分数为3.89％，培养5天测定得到脱氢酶量值为140.353±6.43μg。嗜碱性假单胞杆菌对芘的降解温度为34.78℃、降解盐度为0.73％、PAHs/活性炭百分数为6.39％，培养5天测定得到脱氢酶量值为84.032±0.063μg。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。