本发明涉及功能微生物应用
技术领域：
，具体提供了一种阿胶益生菌口服液及其制备方法。
背景技术：
：益生菌是有益于宿主健康的一类微生物，1965年在Science上首次被提出。肠道菌系平衡是对人体营养和健康至关重要的因素，益生菌对人体肠道菌系有很好的调节作用，这使得益生菌的研究成为食品研究的一大热点。近年来，随着对益生菌的深入研究，益生微生物的种类也越来越多，其主要分为三大类:第一类为乳酸菌，主要包括嗜酸乳杆菌、粪链球菌和乳双歧杆菌等；第二类为芽胞杆菌；第三类为酵母菌。乳酸菌在自然界中的种类很多，分布极广。目前自然界已发现的这类菌在细菌分类学上划分至少有18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的，且具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人体的肠道中。乳酸菌包括乳酸杆菌属、肉食杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、明串珠球菌属、片球菌属、气球菌属、奇异菌属、漫游球菌属、利斯特氏菌属、芽孢乳杆菌属、芽孢杆菌属中的少数种、环丝菌属、丹毒丝菌属、孪生菌属和糖球菌属等。乳酸菌主要归属于乳链球菌及乳酸杆菌两大家族，乳酸杆菌与人体保健有着密切的关系，有44个种，连同亚种共51个种。乳杆菌、乳球菌及双歧杆菌属为最常用的菌株。乳酸菌能提高食品的营养价值，改善食品风味，提高食品的保藏性和附加值。近年来乳酸菌的特殊生理活性和营养功能，正日益引起人们的重视。大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制机体内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。由此可见，乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关。乳酸菌对人体有特殊的生理作用，是机体内必不可少的正常生理菌群，目前它已成为各国学者研究的热门课题，在保健食品的研究应用中必将占据重要地位。拓展菌种来源，选育既有优良发酵特性，又有特殊保健功能的活菌数高、优良、安全的乳酸菌菌种仍是研究重点。技术实现要素：本发明的目的是提供一种新型益生菌口服液及其制备方法。所述益生菌口服液是以阿胶作为发酵培养基养分之一，选用干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）和发酵乳杆菌（Lactobacillusfermentum）三者混合发酵制备得到的。所述口服液能有效提高肠道益生菌含量，提高机体免疫力，应用前景广阔。本发明一方面提供了一种阿胶益生菌口服液，是以含阿胶的原料为培养基，将干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌混合发酵制备得到的。所述干酪乳杆菌优选干酪乳杆菌KDB-LC（LactobacilluscaseiKDB-LC），已经于2016年8月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016431。所述嗜酸乳杆菌优选嗜酸乳杆菌KDB-03（LactobacillusacidophilusKDB-03），已经于2016年8月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016429。所述发酵乳杆菌优选发酵乳杆菌KDB-8（LactobacillusfermentumKDB-8），已经于2016年8月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016430。一种益生菌口服液的制备方法，具体为：按发酵量的3-5%将嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和发酵乳杆菌的混合种子液接种于发酵罐中的液体发酵培养基中，搅拌15-20min，充分混匀后关闭搅拌；控制发酵温度为35～40℃，发酵时间为15～20小时，冷水迅速降温至10℃以下，进行无菌灌装、包装，即得到益生菌口服液。所述的混合种子液中嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和发酵乳杆菌的活菌数比例为1：1：1～3；进一步优选的，所述的混合种子液中嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和发酵乳杆菌的活菌数比例为1：1：1。所述的液体发酵培养基中各组分及其质量体积比分别为红糖6.5-8%、阿胶0.5-2%、蛋白胨0.3-0.5%、酵母浸粉0.3-0.5%、乳清粉0.07-0.1%、土豆泥0.06-0.1%、低聚果糖0.05-0.08%、K2HPO40.03-0.05%、KH2PO40.02-004%、MgSO40.03-0.05%。进一步优选的，所述的液体发酵培养基中各组分及其质量体积比分别为红糖7%、阿胶1.5%、蛋白胨0.3%、酵母浸粉0.5%、乳清粉0.07%、土豆泥0.1%、低聚果糖0.05%、K2HPO40.03%、KH2PO40.04%、MgSO40.03%。有益效果本发明提供的阿胶益生菌口服液中嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和发酵乳杆菌的总活菌数超过50亿/mL，能明显提高人体肠道内乳酸菌和双歧杆菌的数量，有效改善胃肠道环境。所述口服液中含有的阿胶成分不仅改善了口服液的风味，更具有益气补血的功效，能显著提升机体免疫力，增强机体抗病能力，有助于维护人体的健康。在阿胶益生菌口服液生产过程中，阿胶在发酵培养基中的添加量对于口服液中乳酸菌的总活菌数有重要影响。当阿胶添加量在0.5-2.0%时，制备得到的阿胶益生菌口服液中乳酸菌总活菌量随着阿胶添加量的增加而增加，乳酸菌增长率为22%-122%；而当阿胶的添加量超过2%时，乳酸菌总活菌量随着阿胶添加量的增加而迅速下降。说明阿胶中的某些成分对于上述三种乳酸菌的生长繁殖具有明显的促进作用，但当这些成分超过一定剂量时又会反过来抑制其生长，取得了意料不到的技术效果。具体实施例本发明实施例中涉及的嗜酸乳杆菌KDB-03（LactobacillusacidophilusKDB-03）、发酵乳杆菌KDB-8（LactobacillusfermentumKDB-8）和干酪乳杆菌KDB-LC（LactobacilluscaseiKDB-LC）均筛选自在沈阳苏家屯农村收集的自然发酵的酸菜汁。其中：嗜酸乳杆菌KDB-03（LactobacillusacidophilusKDB-03），已经于2016年8月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016429。所述菌株对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌均有明显的抑制作用，尤其对大肠杆菌的抑制作用最强，抑菌圈直径达24mm。所述嗜酸乳杆菌能在胃酸中进行有效繁殖，并对胆汁盐具有强耐受性。所述嗜酸乳杆菌KDB-03能强力去除胆固醇，去除率高达91.4%；该菌株还具有很强的抗氧化能力，其发酵上清液对DPPH·和羟基自由基的清除率分别高达92.6%和94.1%。发酵乳杆菌KDB-8（LactobacillusfermentumKDB-8），已经于2016年8月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016430。所述菌株对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用，尤其对幽门螺旋杆菌的抑制作用最强，抑菌圈直径高达23mm。所述发酵乳杆菌对胃酸和胆汁盐的耐受性强，且能在胃酸环境下实现有效增殖。所述发酵乳杆菌KDB-8对胆固醇的去除率达到93.2%；在1.2mmol/LH2O2中仍能保持98.5％的存活率；其发酵上清液和无细胞提取物对羟基自由基的清除率分别高达95.1%和90.4%。干酪乳杆菌KDB-LC（LactobacilluscaseiKDB-LC）已经于2016年8月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016431。所述菌株对大肠杆菌、沙门氏菌和幽门螺旋杆菌均有明显的抑制作用，尤其对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，抑菌圈直径高达24mm。所述干酪乳杆菌对胃酸和胆汁盐的耐受性强，且能在胃酸环境下实现有效增殖。所述干酪乳杆菌KDB-LC还具有很强的抗氧化能力，在1.0mmol/LH2O2中仍能保持97.44％的存活率；其发酵上清液和无细胞提取物对羟基自由基的清除率分别高达92.3%和87.1%。植物乳杆菌DY-1（LactobacillusplantarumDY-1），筛选自健康成年人粪便，已于2016年3月22日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2016137。嗜酸乳杆菌1.1878，嗜酸乳杆菌1.3342，副干酪乳杆菌1.2884，干酪乳杆菌1.580，发酵乳杆菌1.2133，发酵乳杆菌1.3261，植物乳杆菌1.3252，均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。本发明实施例中所用的原料可选购自市场上任意一种，例如阿胶可选购自东阿县贵妃阿胶制品有限公司生产的阿胶。实施例1阿胶对于乳酸菌生长的影响1、乳酸菌的选择嗜酸乳杆菌1.1878，嗜酸乳杆菌1.3342，嗜酸乳杆菌KDB-03；副干酪乳杆菌1.2884，干酪乳杆菌1.580，干酪乳杆菌KDB-LC；发酵乳杆菌1.2133，发酵乳杆菌1.3261，发酵乳杆菌KDB-8；植物乳杆菌1.3252，植物乳杆菌DY-1。2、乳酸菌发酵实验将上述11株乳酸菌分别接种于100mLMRS液体培养基和100mL含2%（质量体积比）阿胶的MRS液体培养基中，37℃静置培养48h后，分别检测发酵液中乳酸菌的活菌数，具体结果见表1。表1乳酸菌在不同培养基中发酵后活菌数比较编号菌株名称MRS液体培养基发酵后活菌数cfu/mL含2%阿胶的MRS液体培养基发酵后活菌数cfu/mL1嗜酸乳杆菌1.18782.0×1082.3×1082嗜酸乳杆菌1.33425.2×1085.0×1083嗜酸乳杆菌KDB-033.5×1082.6×1094副干酪乳杆菌1.28842.6×109.1.2×1085干酪乳杆菌1.5806.7×1089.1×1076干酪乳杆菌KDB-LC9.2×1084.2×1097发酵乳杆菌1.21338.8×1089.3×1088发酵乳杆菌1.32614.6×1081.5×1089发酵乳杆菌KDB-81.2×1095.0×10910植物乳杆菌1.32524.4×1088.4×10711植物乳杆菌DY-16.1×1082.7×108从表1的结果可以看出，阿胶在MRS液体培养基中的添加对上述11种乳酸菌的生长产生了截然不同的影响。其中，阿胶对嗜酸乳杆菌1.1878，嗜酸乳杆菌1.3342和发酵乳杆菌1.2133三株乳酸菌的生长影响不显著，所述菌株在两种培养基中发酵后的活菌数相当；阿胶对副干酪乳杆菌1.2884，干酪乳杆菌1.580，发酵乳杆菌1.3261，植物乳杆菌1.3252和植物乳杆菌DY-1五株乳酸菌的生长具有明显的抑制作用，所述菌株在含阿胶的MRS液体培养基中发酵后的活菌数明显减少；而阿胶对嗜酸乳杆菌KDB-03，干酪乳杆菌KDB-LC和发酵乳杆菌KDB-8三株菌的生长具有明显的促进作用，所述菌株在含阿胶的MRS液体培养基中发酵后的活菌数明显增加，取得了意料不到的效果。实施例2益生菌口服液的制备方法配制液体发酵培养基：在发酵罐中加入适量水，分别将红糖、蛋白胨、酵母浸粉、乳清粉、土豆泥、低聚果糖、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4加入到罐中，搅拌溶解后定容。利用高温蒸汽控制发酵罐内压力0.09～0.10MPa，使温度控制在115℃～121℃，杀菌25～45min，结束后冷却降温至35～40℃，其中各成分的质量体积比最终分别为：红糖6.5-8%、蛋白胨0.3-0.5%、酵母浸粉0.3-0.5%、乳清粉0.07-0.1%、土豆泥0.06-0.1%%、低聚果糖0.05-0.08%、K2HPO40.03-0.05%、KH2PO40.02-004%、MgSO40.03-0.05%，培养基的初始pH值为5.5-6.0。按发酵量的3-5%接种嗜酸乳杆菌KDB-03、干酪乳杆菌KDB-LC和发酵乳杆菌KDB-8的混合种子液（三种乳酸菌的活菌数比例为1：1：1-3）于发酵罐中，搅拌15-20min，充分混匀后关闭搅拌；控制发酵温度为35～40℃，发酵时间为15～20小时，冷水迅速降温至10℃以下，进行无菌灌装、包装，即得到益生菌口服液，其中乳酸菌的总活菌数约为30-50亿/mL。进一步优选的，申请人配制的液体发酵培养基中各组分质量体积比分别为：红糖7%、蛋白胨0.3%、酵母浸粉0.5%、乳清粉0.07%、土豆泥0.1%%、低聚果糖0.05%、K2HPO40.03%、KH2PO40.04%、MgSO40.03%，培养基的初始pH值为6.0，嗜酸乳杆菌KDB-03、干酪乳杆菌KDB-LC和发酵乳杆菌KDB-8混合种子液中活菌数比例分别为1:1:1，接种量为5%，充分混匀后关闭搅拌；控制发酵温度为37℃，发酵时间为18小时，冷水迅速降温至10℃以下，进行无菌灌装、包装，即得到益生菌口服液，其中乳酸菌的总活菌数约为50亿/mL。实施例3阿胶的添加量对益生菌口服液的影响申请人为了验证阿胶的添加量对于益生菌口服液的影响，选用实施例2所述益生菌口服液的优选制备方法：液体发酵培养基中各组分质量体积比分别为：红糖7%、蛋白胨0.3%、酵母浸粉0.5%、、乳清粉0.07%、土豆泥0.1%%、低聚果糖0.05%、K2HPO40.03%、KH2PO40.04%、MgSO40.03%，培养基的初始pH值为6.0，嗜酸乳杆菌KDB-03、干酪乳杆菌KDB-LC和发酵乳杆菌KDB-8混合种子液中活菌数比例分别为1:1:1，接种量为5%，充分混匀后关闭搅拌；控制发酵温度为37℃，发酵时间为18小时。申请人按质量体积比为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%分别向上述液体发酵培养基中添加阿胶，其他操作同上，最终获得8种阿胶益生菌口服液，依次命名为口服液1#，2#，……，8#。同时，以实施例2中不加阿胶的益生菌口服液作为对照，命名为口服液0#，分别检测每种口服液中乳酸菌的总活菌数，计算乳酸菌增长率。具体结果见表2。乳酸菌增长率（%）=（阿胶益生菌口服液活菌数-对照益生菌口服液活菌数）/对照益生菌口服液活菌数×100%表2阿胶益生菌口服液中乳酸菌活菌数比较编号发酵培养基中阿胶添加量口服液中乳酸菌活菌数乳酸菌增长率0#0%5×109cfu/mL-1#0.5%6.1×109cfu/mL22%2#1.0%9.2×109cfu/mL84%3#1.5%10.8×109cfu/mL116%4#2.0%11.1×109cfu/mL122%5#2.5%7.3×109cfu/mL46%6#3.0%5.2×109cfu/mL4%7#3.5%2.3×109cfu/mL-54%8#4.0%1.4×109cfu/mL-72%从表2的结果可以看出，在阿胶益生菌口服液生产过程中，阿胶在发酵培养基中的添加量对于口服液中乳酸菌的总活菌数有重要影响。当阿胶添加量在0.5-2.0%时，制备得到的阿胶益生菌口服液中乳酸菌总活菌量随着阿胶添加量的增加而增加，乳酸菌增长率为22%-122%；而当阿胶的添加量超过2%时，乳酸菌总活菌量随着阿胶添加量的增加而迅速下降；尤其是，当阿胶添加量超过3%时，口服液中乳酸菌总活菌量开始低于不添加阿胶的对照益生菌口服液。上述结果表明，阿胶中的某些成分对于嗜酸乳杆菌KDB-03、干酪乳杆菌KDB-LC和发酵乳杆菌KDB-8的生长繁殖具有明显的促进作用，但当这些成分超过一定剂量时又会反过来抑制上述乳酸菌的生长，取得了意料不到的技术效果。实施例4阿胶益生菌口服液及其制备方法配制液体发酵培养基：在发酵罐中加入适量水，分别将红糖、阿胶、蛋白胨、酵母浸粉、乳清粉、土豆泥、低聚果糖、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4加入到罐中，搅拌溶解后定容。利用高温蒸汽控制发酵罐内压力0.09～0.10MPa，使温度控制在115℃～121℃，杀菌25～45min，结束后冷却降温至35～40℃，其中各成分的质量体积比最终分别为：红糖6.5-8%、阿胶0.5-2%、蛋白胨0.3-0.5%、酵母浸粉0.3-0.5%、乳清粉0.07-0.1%、土豆泥0.06-0.1%%、低聚果糖0.05-0.08%、K2HPO40.03-0.05%、KH2PO40.02-004%、MgSO40.03-0.05%，培养基的初始pH值为5.5-6.0。按发酵量的3-5%接种嗜酸乳杆菌KDB-03、干酪乳杆菌KDB-LC和发酵乳杆菌KDB-8的混合种子液（三种乳酸菌的活菌数比例为1：1：1）于发酵罐中，搅拌15-20min，充分混匀后关闭搅拌；控制发酵温度为35～40℃，发酵时间为15～20小时，冷水迅速降温至10℃以下，进行无菌灌装、包装，即得到阿胶益生菌口服液，其中乳酸菌的总活菌数超过50亿/mL。进一步优选的，液体发酵培养基中各成分的质量体积比分别为红糖7%、阿胶1.5%、蛋白胨0.3%、酵母浸粉0.5%、乳清粉0.07%、土豆泥0.1%%、低聚果糖0.05%、K2HPO40.03%、KH2PO40.04%、MgSO40.03%，培养基的初始pH值为6.0，嗜酸乳杆菌KDB-03、干酪乳杆菌KDB-LC和发酵乳杆菌KDB-8混合种子液中活菌数比例分别为1:1:1，接种量为5%，充分混匀后关闭搅拌；控制发酵温度为37℃，发酵时间为18小时。冷水迅速降温至10℃以下，进行无菌灌装、包装，即得到阿胶益生菌口服液，其中乳酸菌的总活菌数超过100亿/mL。实施例5阿胶益生菌口服液的效果评价从健康人群中随机挑选成年男女各20名，收集其新鲜粪便检测其中的乳酸菌及双歧杆菌数平均为2.14×108CFU/g和8.82×109CFU/g。40名健康成年人每天食用本发明所述阿胶益生菌口服液50ml，一周后检测其新鲜粪便中乳酸菌及双歧杆菌数平均为9.97×109CFU/g和9.52×1011CFU/g。上述结果表明，食用本发明提供的阿胶益生菌口服液能显著提高人体肠道内乳酸菌和双歧杆菌的数量，有效改善胃肠道环境。所述口服液中含有的阿胶成分不仅改善了口服液的风味，更具有益气补血的功效，能显著提升机体免疫力，增强机体抗病能力，有助于维护人体的健康。长期研究数据表明，每日饮用本发明提供的阿胶益生菌口服液，不仅能大幅增加肠道中益生菌的数量，改善胃肠道的消化与吸收功能，还能有效降低人体血液中胆固醇的含量，清除自由基，增强机体的免疫力，维护身体健康。当前第1页1 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