一种电化学发光快速检测抗生素ZwittermicinA浓度的方法与流程

本发明是抗生素的在线检测，属于生物技术领域，特别涉及一种电化学发光快速检测抗生素Zwittermicin A浓度的方法。

背景技术：

Zwittermicin A（ZwA）是苏云金芽胞杆菌（英文缩写Bt）和蜡状芽胞杆菌（英文缩写Bc）在发酵过程中产生的一种抗生素，于1994年由Siol-Suh等人首次分离出来，简写为ZwA，其结构式参见说明书附图，图1 ZwA的分子结构式（分子量396D）。

农药的使用影响环境生态，生物防治是将来的发展方向。在生物防治中，虽然Bt菌杀虫晶体蛋白的应用可以降低农药的使用量，但是杀虫效果缓慢。近年来的研究发现，ZwA与Bt菌杀虫晶体蛋白的杀虫效果有协同作用。即ZwA对Bt菌产生的杀虫晶体蛋白起到很好的增效作用，能够起到减少Bt杀虫晶体蛋白的使用量，延缓害虫抗性的产生，拓宽杀虫谱。

目前，国内外一直没有ZwA标准品，为此，建立对其检测方法的开发极为困难。已经具有的ZwA检测方法：⑴生物活性检测法，即ZwA对草生欧文氏杆菌有抑菌作用，依据抑菌圈的大小判断ZwA含量；⑵茚三酮显色分光光度计检测法，茚三酮使ZwA由无色变有色，计算出含量；⑶HPLC检测法，色谱条件：色谱柱C₁₈（10mm×25cm），210nm紫外检测器，5mmol/L醋酸铵为流动相，流速为l.0mL/min，ZwA的保留时间为2.27min。

技术实现要素：

本发明的目的是为了针对现有技术中检出限高、专一性差等缺陷，提供一种操作更加简单、检出限更低、低成本的电化学发光快速检测抗生素Zwittermicin A浓度的方法。

具体步骤为：

(1)用二次蒸馏水作为溶剂，分别配制5mmol/L的三联吡啶钌溶液（Ru(bpy)₃²⁺）、60mmol/L 且pH值为8.5的 Na₂HPO₄-NaOH缓冲溶液和1mg/mL的Zwittermicin A标准溶液，其中1mg/mL的Zwittermicin A标准溶液用于绘制标准曲线。

(2)在流动注射化学发光分析仪的检测池中加入150µL步骤(1)配制的缓冲溶液、100µL步骤(1)配制的三联吡啶钌溶液及20µL步骤(1)配制的Zwittermicin A标准溶液，使用循环伏安法对步骤(1)配制的Zwittermicin A标准溶液进行测试，设定初始电压为0.2V，高电位为1.25V，低电位为0.2V，扫描速率为0.1V/s，静止时间为4s，光电倍增管的高压为800V，空白样即缓冲溶液和三联吡啶钌溶液的化学发光强度记为Io，Zwittermicin A样品的化学发光强度记为Is，增光强度记为△I，△I=Is-Io，该测试过程中光电倍增管及所用试剂均在30℃恒温条件下进行。

(3)根据步骤(2)中对步骤(1)配制的Zwittermicin A标准溶液进行测试的结果，绘制标准曲线，并作出标准曲线方程：△I=206.31x+26.677，其中x为Zwittermicin A的浓度，其单位为mg/mL，其取值范围为0.001~0.1，R²=0.9947。

(4) Zwittermicin A样品的浓度测定：重复步骤(2)的操作过程，将Zwittermicin A标准溶液换为待测Zwittermicin A样品，测试其化学发光强度Is，计算出增光强度△I，代入步骤(3)作出的标准曲线方程，即计算出Zwittermicin A样品的浓度x。

本发明方法操作简单，灵敏度高，重复性好，线性范围宽，被检测样品用量少，且所使用仪器设备简单，检测成本低，能够在线进行常规性测定，易于应用到工业或农业生产中。

附图说明

图1为本发明中Zwittermicin A的结构式。

图2为本发明实施例中绘制的Zwittermicin A标准曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。

实施例：

本实施例中所用的仪器均为IFFM-E型流动注射化学发光分析仪（西安瑞迈电子有限公司）。分析过程中采样、注样、实验数据采集及处理，均由Windows XP系统下IFFM-E型流动注射化学发光分析仪完成。

本实施例中，抗生素ZwA纯品：≧85%，实验室自己分离提取；抗生素活性检测指示菌：草生欧文氏杆菌LS005，菌种由中国农业科学院植物保护研究所提供。

具体步骤为：

(1)用二次蒸馏水作为溶剂，分别配制5mmol/L的三联吡啶钌溶液（Ru(bpy)₃²⁺）、60mmol/L 的pH 8.5的 Na₂HPO₄-NaOH缓冲溶液和1mg/mL的Zwittermicin A标准溶液，其中1mg/mL的Zwittermicin A标准溶液用于绘制标准曲线。

(2)在IFFM-E型流动注射化学发光分析仪（西安瑞迈电子有限公司）的检测池中加入150µL步骤(1)配制的缓冲溶液、100µL步骤(1)配制的三联吡啶钌溶液及20µL步骤(1)配制的Zwittermicin A标准溶液，使用循环伏安法对步骤(1)配制的Zwittermicin A标准溶液进行测试，设定初始电压为0.2V，高电位为1.25V，低电位为0.2V，扫描速率为0.1V/s，静止时间为4s，光电倍增管的高压为800V，空白样即缓冲溶液和三联吡啶钌溶液的化学发光强度记为Io，Zwittermicin A样品的化学发光强度记为Is，增光强度记为△I，△I=Is-Io，该测试过程中光电倍增管及所用试剂均在30℃恒温条件下进行。

(3)根据步骤(2)中对步骤(1)配制的Zwittermicin A标准溶液进行测试的结果，绘制标准曲线，并作出标准曲线方程：△I=206.31x+26.677，其中x为Zwittermicin A的浓度，其单位为mg/mL，其取值范围为0.001~0.1，R²=0.9947。

(4) Zwittermicin A样品的浓度测定：重复步骤(2)的操作过程，将Zwittermicin A标准溶液换为待测Zwittermicin A样品，测试其化学发光强度Is，计算出增光强度△I=5，代入步骤(3)作出的标准曲线方程，即计算出Zwittermicin A样品的浓度x。