本发明属于免疫检测分析技术领域，涉及一种基于化学发光法的septin9检测试剂盒。
背景技术：
Septin是一个广泛存在于除植物以外所有真核生物中的基因家族。最初认为septin家族是与酵母细胞胞质分裂相关的基因家族，然而随着研究的深入，人们发现这类基因编码的蛋白在许多生物体内出现了较大的功能分化，尤其是在哺乳动物中，他们不仅成员众多，而且参与了细胞分裂、细胞极化、囊泡运输及胞膜重构等多个过程。更引起研究人员重视的是：最近有大量的数据表明，这一家族的一些成员与肿瘤发生、神经功能障碍和病原微生物感染的过程直接相关。
SEPT9定位于染色体17q25.3，该染色体区段是散发性卵巢癌和乳腺癌的常见杂合性丢失部位。在卵巢癌，约70％的17q等位基因丢失为17q25。Kalikin等以17个微卫星标记确定了卵巢癌17q的最小缺失区，并克隆到了一个候选肿瘤抑制基因，命名为，arian/breast(Ov/Br)septin蛋白(即SEPT9)。但是，新近研究又支持SEPT9为潜在原癌基因。在PyV-mT过渡表达所致的乳腺癌，SKY和CGH检测发现17q25.3区有扩增，RT-PCR证实有SEPT9基因表达上调，9个乳腺癌细胞系中表达也上调。SEPT9表达上调的乳腺癌细胞系Thsp-1和Bax下调，细胞凋亡受抑制。siRNA抑制septin 9表达后，细胞凋亡抑制效应解除。7287例人新鲜组织和292个人细胞系的Affymetrix HG_U133基因芯片检测结果的分析表明，SEPT9在乳腺、中枢神经系统、子宫内膜、肾脏、肝、肺、淋巴、食管、卵巢、胰腺、软组织、皮肤、甲状腺等来源的肿瘤中高表达，RT-PCR与免疫组织化学染色的结果大致与芯片结果一致。最近前列腺癌细胞系体内外实验研究发现，MSF-(SEPT9-vla)可以通过抑制缺氧诱导因子1a(hypo-xia-inducible factor-，HIF1a)的泛素化降解途径，从而促进HIF1a的表达，并促进肿瘤血管形成。该研究为septin家族在肿瘤发生、发展中的作用提供了直接证据。
Septin9蛋白是一个潜在的重要的肿瘤标志物，但是目前检测septin9蛋白的方法复杂且昂贵，因此，需要一种准确快速定量的检测方法满足科学研究已经临床的需要。本发明提供的人septin9酶联免疫试剂盒，可以快速准确的检测人血液、组织液等体液中的septin9的含量。
技术实现要素：
本发明提供一种基于化学发光法的septin9检测试剂盒。该试剂盒具有检测灵敏度高，特异性强，操作简单，稳定性好，无污染，重复性好的特点。
一种基于化学发光法的septin9检测试剂盒，主要包括：
(1)包被有septin9单克隆抗体的磁微粒试剂；
(2)辣根过氧化物酶标记的septin9抗体；
(3)Septin9校准品；
(4)Septin9质控品
(5)发光底物液；
(6)样本稀释液；
(7)浓缩洗涤液；
(8)反应杯。
所述磁微粒试剂为含有包被有septin9单克隆抗体的磁微粒和稳定剂的溶液。
所述校准品及质控品为含有一定量septin9抗原的BSA缓冲液。所述septin9标准品溶液6瓶，0ng/ml，0.3ng/ml，0.9ng/ml，2.7ng/ml，8.1ng/ml，24.3ng/ml，1ml/瓶。
所述发光底物液为含有鲁米诺、过氧化氢、对碘苯酚的Tris缓冲液。
所述浓缩清洗液为含有Tris、NaCl和表面活性剂的缓冲液。
所述样本稀释液为含有BSA的溶液。
本发明还提供一种基于化学发光法的septin9检测试剂盒制备方法。主要包括磁微粒包被抗体、HRP标记抗体、发光底物液配制、校准品、质控品、浓缩清洗液和样本稀释液配制。
步骤1，磁微粒包被抗体
采用表面含有羧基的磁微粒，用EDC活化微球表面的羧基，然后加入一定量的septin9抗体偶联，偶联完毕加入淬灭液消除剩余的活化的羧基，然后用BSA封闭微球表面剩余的位点。
步骤2，HRP标记septin9抗体
采用改良的过碘酸钠法偶联HRP和septin9抗体，在低pH条件下用NaIO4氧化HRP形成醛化酶，加入septin9抗体后醛化酶与抗体的氨基相连，然后用硼氢化钠还原生成稳定的酶标记抗体。标记完毕用含10％BSA pH 7.4的0.05M PBS作为酶结合物稀释液，将酶结合物稀释到所需比例。
步骤3，发光底物液的配制
将鲁米诺、过氧化氢、对碘苯酚用pH 8.5 0.05M Tris溶液溶解。
步骤4，相关溶液配制
称取一定量septin9标准品用空白血清稀释成如下浓度0ng/ml，0.3ng/ml， 0.9ng/ml，2.7ng/ml，8.1ng/ml，24.3ng/ml，分装后2-8℃保存。
浓缩清洗液为含有Tris、NaCl和Tween80的缓冲液。
样本稀释液为含有BSA的pH7.4 0.05M PBS溶液。
本发明还提供一种人肾损伤分子(septin9)磁微粒化学发光免疫检测试剂盒检测流程。主要包括：
步骤1，样品前处理
采用正确医用技术收集全血标本，37℃静置1h，离心分离提取血清1h后用于检测。
血清样本如果有浑浊或可见物，3000rpm离心5min，取上层清液即可。血清样本收集后室温放置不可超过8h，存放于2-8℃应不超过48h，若长期保存应存放于-20℃。
步骤2，实验前准备
将所有试剂平衡至室温，取出一次性平底试管和磁分离器，打开水浴锅调节温度为37℃，准备化学发光仪，并仔细阅读仪器说明书。将试剂盒中各试剂混匀，磁微粒试剂混匀后应为均匀悬浊液，无明显凝集。
步骤3，检测过程
(1)加样与第一步免疫反应：在每一个平底试管中加入15ul校准品或质控品、待测样本，30ul磁微粒试剂，混匀后37℃温育5min；
(2)洗涤：将平底试管在磁分离器上静置2min，然后弧线倾倒上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干，每管中加入300ul清洗液，混匀后，将平底试管在磁分离器上静置2min，然后弧线倾倒上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干，重复两次；
(3)第二步免疫反应：在每一个平底试管中加入30ul酶标septin9抗体，混匀后37℃温育5min；
(4)洗涤：将平底试管在磁分离器上静置2min，然后弧线倾倒上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干，每管中加入300ul清洗液，混匀后，将平底试管在磁分离器上静置2min，然后弧线倾倒上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干，重复两次；
(5)加入发光底物液：每个试管加入200ul发光底物；
(6)读取发光值：用化学发光仪测定每管的发光值。
(7)注意事项：如遇到高值hook样本，为了避免出现高值hook效应，检验临床检测时根据其余指标选择合适的稀释倍数对样品进行稀释。
本发明的有益效果：
1.使用磁珠为固相，使免疫反应更接近液相，反应更充分和迅速，而且使结合的免疫复合物更加容易分离，降低了非特异吸附。
2.使用的化学发光底物液，使检测的灵敏度得到了提高，而且线性范围更 宽。
具体实施方式
实施例1磁微粒试剂制各
1.取一个干净的1.0L容量瓶，加入700ml纯化水。称取Tris 6.02g、叠氮钠0.99g、硫酸新霉素0.99g、四环素0.03g、BSA4.97g加入到纯化水中，混匀，室温搅拌至固体药品完全溶解。量取Tween 20 2.76ml加入到上述溶液中搅拌均匀。用1.0M盐酸调节pH至8.0，用纯化水定容至1L，用0.22um滤膜过滤，存储于4℃.
2.将直径0.1um的四氧化三铁微球用戊二醛进行活化，室温均匀4h后，用0.01M pH7.4PBS清洗三次，并用该溶液进行悬浮，浓度为50-100mg/ml；然后每毫升悬液中加入septin9抗体100ug，于37℃混匀温育3-8h，用等体积的含5％BSA的0.01M pH7.4PBS于37℃封闭40min，最后，用含0.5％BSA的0.02M pH 8.0Tris缓冲液清洗三次，并用上述磁珠缓冲液配制一定浓度的工作液。
实施例2辣根过氧化物标记抗体
采用改良过碘酸钠法。以标记20mg单抗为例：准确称取HRP 40mg，加入0.2M pH5.6醋酸缓冲液2ml，溶解后加入0.06M NaIO4溶液2ml，室温反应20min。加入0.16M乙二醇-10％NaCl溶液2ml，室温反应20min，将酶液装入透析袋中，对0.001M pH4.0醋酸盐缓冲液透析过夜；加入2M pH 9.6碳酸盐缓冲液0.8ml，加入septin9特异性单抗II 20mg，4℃搅拌反应2h；加入新配制的5mg/ml NaBH4溶液0.4ml，4℃搅拌反应2h；滴加饱和硫酸铵溶液9.2ml，4℃搅拌反应30min，4℃3500rpm离心20min，弃上清，将沉淀溶于2ml 0.02M pH7.4的磷酸盐缓冲液，用0.02M pH7.4的磷酸盐缓冲液透析24h，加2ml甘油，混匀后-20℃保存。
实施例3发光底物液的配制
取一个干净的1.0L容量瓶，加入700ml纯化水。称取Tris 6.02g、鲁米诺5g、过氧化氢5ml、对碘苯酚2g加入到纯化水中，混匀，室温搅拌至固体药品完全溶解。量取Tween 20 2.76ml加入到上述溶液中搅拌均匀。用1.0M盐酸调节pH至8.0，用纯化水定容至1L，用0.22um滤膜过滤，存储于4℃。
实施例4校准品、质控品、浓缩清洗液、样品稀释液配制
称取一定量septin9标准品用空白血清稀释成如下浓度0ng/ml，0.3ng/ml，0.9ng/ml，2.7ng/ml，8.1ng/ml，24.3ng/ml，分装后2-8℃保存。
浓缩清洗为0.2M PBST溶液。
样本稀释液：加入500ml纯化于容器中，称取Tris 6g、NaCl18.8g、BSA 60g、Proclin300 1ml，调节pH至7.5。纯化水定容至1L，过滤保存。
实施例5人肾损伤分子(septin9)磁微粒化学发光免疫检测试剂盒检测流程
1、样品前处理
采用正确医用技术收集全血标本，37℃静置1h，离心分离提取血清1h后用于检测。
血清样本如果有浑浊或可见物，3000rpm离心5min，取上层清液即可。血清样本收集后室温放置不可超过8h，存放于2-8℃应不超过48h，若长期保存应存放于-20℃。
2、实验前准备
将所有试剂平衡至室温，取出一次性平底试管和磁分离器，打开水浴锅调节温度为37℃，准备化学发光仪，并仔细阅读仪器说明书。将试剂盒中各试剂混匀，磁微粒试剂混匀后应为均匀悬浊液，无明显凝集。
3、检测过程
(1)加样与第一步免疫反应：在每一个平底试管中加入15ul校准品或质控品、待测样本，30ul磁微粒试剂，混匀后37℃温育5min；
(2)洗涤：将平底试管在磁分离器上静置2min，然后弧线倾倒上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干，每管中加入300ul清洗液，混匀后，将平底试管在磁分离器上静置2min，然后弧线倾倒上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干，重复两次；
(3)第二步免疫反应：在每一个平底试管中加入30ul酶标septin9抗体，混匀后37℃温育5min；
(4)洗涤：将平底试管在磁分离器上静置2min，然后弧线倾倒上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干，每管中加入300ul清洗液，混匀后，将平底试管在磁分离器上静置2min，然后弧线倾倒上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干，重复两次；
(5)加入发光底物液：每个试管加入200ul发光底物；
(6)读取发光值：用化学发光仪测定每管的发光值。
注意事项：如遇到高值hook样本，为了避免出现高值hook效应，检验临床检测时根据其余指标选择合适的稀释倍数对样品进行稀释。
实施例6试剂盒性能指标
1试剂盒最低检出限
本实施例检测本发明试剂盒的检出限。具体操作为：抽取一盒试剂盒，按照实施例2的方法检测样品稀释液，重复检测20次，计算检测发光值的平均值(M)和标准差(SD)，计算M-2SD的值，将M-2SD对应的发光值代入标准曲线，计算所得到的浓度值即为试剂盒检出限，经过验证本试剂盒的检出限为0.01ng/ml。
2试剂盒特异性
本实施例检测本发明试剂盒的特异性。具体操作为：抽取一盒试剂盒，按照实施例2的方法检测100ng/ml NAGL、100ng/mlC反应蛋白、100ng/ml胱抑素C，检测结果应小于0.1ng/ml。
3试剂盒重复性
本实施例检测本发明试剂盒的重复性。具体操作为：抽取一盒试剂盒，按照实施例2的方法检测浓度为1.0ng/ml的标准品溶液，重复检测10次。计算测定结果的平均浓度和标准差(S)，按照公式(1)计算变异系数(CV)，CV应不高于10％。
4试剂盒的剂量-反应曲线的线性
本实施例检测本发明试剂盒的剂量-反应曲线的线性。具体操作为：抽取一盒试剂盒，按照实施例2的方法检测浓度为检测浓度为0ng/ml，0.3ng/ml，0.9ng/ml，2.7ng/ml，8.1ng/ml，24.3ng/ml的septin9测定样品液，每个浓度检测2支，记录各浓度水平的测量结果，并计算各浓度水平两次测量值的平均值(yi)，以浓度值(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(2)计算线性回归的相关系数(r)，r应≥0.975。其中为5个浓度值的平均值；为测量值的平均值。
5试剂盒稳定性
本实施例检测本发明试剂盒的稳定性。具体操作为：将试剂盒2-8℃下放置1年，分别在第1、2、3、6、8、12、15个月检测，其检出限、特异性、重复性、剂量-反应曲线的线性应符合要求。