一种检测多巴胺的电化学发光传感器及其制备与应用
【专利摘要】本发明提供一种检测多巴胺的电化学发光传感器，所述电化学发光传感器包括电极，所述电极包括基底、复合物层和修饰层，所述基底为导电材料，所述复合物层生长于所述导电基底表面上，由鲁米诺和硫酸联苯胺聚合而成，所述修饰层由修饰于复合物层表面的酪胺氧化酶构成。本发明还提出所述电化学发光传感器的制备和应用。本发明将具有生物活性的酶用于电化学发光分析，可以有效解决电化学发光方法选择性差的问题。本发明电化学传感器的制备和检测方法简单，灵敏度高，多巴胺检测过程中不受尿酸和抗坏血酸等的影响，抗干扰性好。
【专利说明】
一种检测多巴胺的电化学发光传感器及其制备与应用
技术领域
[0001]本发明属于检测领域，具体涉及一种电化学发光传感器及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]多巴胺是一种天然存在的儿茶酚胺，是哺乳动物体内一种重要的神经传导递质，对许多基本生理功能和脑高级功能至关重要。多巴胺对躯体具有非常重要的调节作用，它在体内的浓度水平与帕金森氏综合症等神经退行性疾病密切相关。鉴于多巴胺重要的生理功能，准确测定其在体内的含量对于疾病的预防治疗变得尤为重要。
[0003]在线测定多巴胺浓度的方法有很多，包括化学发光、电化学法、液相色谱结合质谱、表面等离子体共振和表面增强拉曼等方法，例如专利CN201310479300.84用氧化锌纳米片球/泡沫石墨烯复合材料作为电极材料用于多巴胺检测。这些手段在测试中存在的一个问题是它们造价较高，测量过程耗时较长，并且有些测试需要对样品进行预处理以及需要特殊的测试环境。
[0004]电化学发光分析方法作为化学发光与电化学相结合的分析方法，由于其发光反应的空间区域集中在电极表面的附近区域，具有发光反应的控制性强和灵敏度高等优点，因此受到分析工作者的广泛关注。电化学发光分析具有设备搭建简单，检测信号背景噪音低，高灵敏度以及较宽的检测范围等优势，可用来检测葡萄糖，内酰胺酶和DNA等高分子有机物，如专利CN201510482877.3—种纳米复合材料的电化学发光传感器的制备方法，介绍了一种纳米复合材料的电化学发光传感器的制备方法，将复合材料luminol-AuBSA-ant1-CEA沉积于金的电极表面，得到对抗原CEA具有靶向作用的电化学发光免疫传感器。专利CN201010271247.9—种电化学发光适配体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，将纳米金粒子修饰到裸金电极表面，再在工作电极表面修饰上单链DNA，然后将标记有异鲁米诺(ABEI)的适配体修饰到电极表面，加入过氧化氢，检测电发光信号，以检测赭曲霉毒素A。专利CN201510594214.03提供了基于甲硫氨酸金纳米团簇的电致化学发光传感器，以甲硫氨酸保护的金纳米团簇材料为发光体，过硫酸根离子为共反应剂，将甲硫氨酸保护的金纳米团簇修饰在玻碳电极上，进行电化学发光测试，并实现对多巴胺的检测。该传感器对对多巴胺检测的线性范围为0.1?4ymol/L和4?25ymol/L，检测限为0.032ymol/L。
[0005]在电化学发光法探测多巴胺浓度的研究中，检测传感器的制备尤为重要。由于鲁米诺和聚鲁米诺具有电化学活性与高效的发光性能，其在电化学发光检测多巴胺浓度的应用尤为广泛。但是鲁米诺和聚鲁米诺的量子产率不高，检测灵敏度较低。同时在活体环境中高浓度的抗坏血酸和尿酸与多巴胺共存，由于三者的氧化电位很相似，容易对多巴胺的检测造成干扰。因此研究高灵敏度与高选择性的电化学发光传感器将大大推进多巴胺检测领域的发展。
【发明内容】
[0006]本发明创新性地提出了一种用于多巴胺检测的电化学发光传感器，其目的在于克服现有多巴胺检测方法造价昂贵、耗时长、灵敏度低，选择性差等缺点。针对以上问题，本发明将鲁米诺和硫酸联苯胺聚合，用硫酸联苯胺调制鲁米诺的光物理性能，以提高其在多巴胺检测中的量子产率，增强发光强度，从而提高其检测灵敏度。
[0007]本发明的另一目的是提出所述检测多巴胺的电化学发光传感器的制备方法。
[0008]本发明的第三个目的是提出所述电化学发光传感器的应用。
[0009]实现本发明上述目的的技术方案为:
[00?0] —种检测多巴胺的电化学发光传感器，所述电化学发光传感器包括电极，所述电极包括基底、复合物层和修饰层，所述基底为导电材料，所述复合物层生长于所述导电基底表面上，由鲁米诺和硫酸联苯胺聚合而成，所述修饰层由修饰于复合物层表面的酪胺氧化酶构成。
[0011]由于酪胺氧化酶可以选择性催化氧化多巴胺，原位生成的H2O2可以显著增敏鲁米诺-硫酸联苯胺的电化学发光，本发明将酪胺氧化酶固定于复合膜电极表面作为多巴胺的识别元素，将酶催化反应的选择性和聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)电化学发光方法的灵敏性结合在一起，构成快速、灵敏、选择性高的多巴胺浓度测定的传感器。
[0012]本发明所述的电化学发光传感器的制备方法，包括步骤:
[0013]I)在磷酸缓冲盐溶液中，配置鲁米诺和硫酸联苯胺溶液，采用循环伏安法，在导电基底上制备聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)复合物层，
[0014]2)将上述电极取出，干燥，以缓冲溶液配置酪胺氧化酶溶液，用循环伏安法在所述步骤I)得到的聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)复合物层表面固定酪胺氧化酶修饰层。
[0015]优选地，所述步骤I)中，磷酸缓冲盐溶液的pH值为5.5?8.5，循环伏安法制备中，以导电基底为工作电极，铂片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，所述导电基底为FTO(掺杂氟的SnO2透明导电玻璃)或ITO(氧化铟锡)导电玻璃。
[0016]磷酸缓冲盐溶液的pH值对聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)膜性能影响较小，在本发明所阐述的pH=5.5?8.5范围内制备均可得到聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)膜。
[0017]所述步骤I)中，缓冲盐溶液中鲁米诺的摩尔浓度为I?lOmmol/L，硫酸联苯胺的摩尔浓度为1.5?15mmol/L。
[0018]更优选地，鲁米诺和硫酸联苯胺的摩尔比例为3:2?2:3。
[0019]其中，所述步骤I)中，在导电基底上制备聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)复合物层时，循环伏安扫描的电位范围为-0.2V?1.0V，扫描圈数30?100圈，扫描速率80?200mV/s。
[0020]其中，所述步骤2)中，所述缓冲溶液为pH为6.5?7.5的磷酸盐缓冲溶液，在所述缓冲溶液中含有浓度为0.05?2mg/mL的酪胺氧化酶。
[0021]进一步地，所述步骤2)中，循环伏安扫描的电位范围为-0.2V?0.6V，扫描圈数10?30圈，扫描速率80?150mV/s。
[0022]本发明还提出所述电化学发光传感器的应用。
[0023]应用本发明提出的电化学发光传感器检测多巴胺的方法，将待测溶液的pH值调节为6.8?7.2，在避光条件下，将所述电化学发光传感器的电极置于待测溶液中，施加方波电位，电位范围为-0.5?-0.9V(vs.Ag/AgCl)，测量电极的响应信号。
[0024]优选地，方波电位可以选用以0V，-0.5?-0.9V(vs.Ag/AgCl)两个阶梯的电压为一个循环，循环2?5次。
[0025]其中，用磷酸缓冲盐或硼砂缓冲溶液调节待测溶液的pH值。
[0026]其中，待测溶液中多巴胺的含量在0.5nmo I /L以上。
[0027]本发明的有益效果在于:
[0028]基于电化学发光测试多巴胺浓度的方法，不同于传统的使用鲁米诺或聚鲁米诺作为电化学发光传感器，本发明选择将鲁米诺和硫酸联苯胺进行电化学聚合，利用硫酸联苯胺调制增强鲁米诺的光物理性能，并用酪胺氧化酶作为多巴胺的识别物质修饰于上述制备的聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)复合膜上，制成用于检测多巴胺浓度的电化学发光传感器。
[0029]本发明将具有生物活性的酶用于电化学发光分析，可以有效解决电化学发光方法选择性差的问题。本发明电化学传感器的制备和检测方法简单，灵敏度高，多巴胺检测过程中不受尿酸和抗坏血酸等的影响，抗干扰性好。
【附图说明】
[0030]图1a为本发明实施例1A)中制备的聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)膜的AFM图片；图1b为本发明实施例1B)中制备的酪胺氧化酶-聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)，即本发明中的电化学发光传感器的AFM图片；
[0031]图2a为本发明实施例1A)中采用循环伏安法制备的聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)膜的反应过程曲线；图2b为本发明实施例1B)中采用循环伏安法在发明实施例1A)中聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)膜表面固定酪胺氧化酶的反应过程曲线；
[0032]图3a为本发明实施例2中电化学发光传感器检测不同多巴胺浓度时的电化学发光信号；图3b为本发明实施例2中传感器的电化学发光信号强度随多巴胺浓度的变化及线性拟合情况；
[0033]图4为本发明实施例3中的抗干扰测试结果，具体为传感器在不同溶液中的电化学发光信号强度，其中DA为多巴胺，AA为抗坏血酸，UA为尿酸。
[0034]图5为本发明提出电化学传感器结构示意图。图中，I为导电基底，2为复合物层，3为修饰层。
【具体实施方式】
[0035]现以以下最佳实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0036]如无特殊说明，实施例中采用的手段均为本领域常用的技术手段。
[0037]实施例1:
[0038]本实施例中，电化学发光传感器的制备方法包括如下步骤[0039 ] A)聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)膜的制备
[0040]配置磷酸缓冲盐溶液，通过改变0.1mol/L NaH2PO4和0.lmol/L Na2HPO4水溶液的比例调节磷酸缓冲盐溶液的pH值为5.7。试验结果表明，溶液pH值对聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)膜性能影响较小，在pH = 5.5?8.5范围内制备均可得到聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)膜;将鲁米诺和硫酸联苯胺加入上述磷酸盐缓冲溶液中配置成反应溶液，具体浓度为8mmol/L鲁米诺和12mmol/L硫酸联苯胺，选择FTO导电玻璃作基底，以FTO为工作电极，铀片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，采用循环伏安电化学聚合法将上述鲁米诺和硫酸联苯胺聚合到FTO基底上，循环伏安参数设置为扫描步长100mV/S，扫描范围-0.2V?1.0V，循环次数40，聚合过程的曲线如图2a所示。将上述复合膜清洗，干燥，得到聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)膜，其AFM图像如图1 a所示(图1的坐标单位为μπι)。
[0041]B)酪胺氧化酶的固定
[0042]配置磷酸缓冲盐溶液，通过改变0.1mol/L NaH2PO4和0.lmol/L Na2HPO4水溶液的比例调节磷酸缓冲盐溶液的PH值为7，用所述磷酸缓冲盐溶液将酪胺氧化酶以0.lmg/mL的比例配成反应液。以步骤A)中制得的生长在FTO表面的聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)膜为基底即工作电极，铂片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，采用循环伏安法将上述酪胺氧化酶固定在基底上，具体循环伏安参数设置为扫描步长100mV/S，扫描范围-0.2V?0.6V，循环次数20，反应曲线如图2b所示。将样品清洗，干燥，得到复合物膜，即电化学发光传感器，其AFM图像如图1b所示。
[0043]制得的电极结构如图5，导电基底I为FTO导电玻璃，复合物层2是由鲁米诺和硫酸联苯胺聚合而成，修饰层3由修饰于复合物层表面的酪胺氧化酶构成。
[0044]实施例2
[0045]实施例1制得的电化学发光传感器用于检测多巴胺浓度的方法包括如下步骤:
[0046]测试在室温条件下进行，测试前，配置磷酸缓冲盐溶液，通过改变0.lmol/LNaH2PO4和0.lmol/L Na2HPO4水溶液的比例调节磷酸缓冲盐溶液的pH值为7，在所述磷酸缓冲盐溶液中加入多巴胺使其分别浓度为0.51111101/1，11111101/1，101111101/1和201111101/1，以实施例I中制备的电化学发光传感器为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl (饱和KCl)为参比电极，将上述体系置于微弱发光仪的暗箱中，对以上体系施加如下方波电位:(13s，0V)和(4s，-0.85V)(Vs.Ag/AgCl)，两个方波为一个循环，工作四个循环。测试过程中首先对
0.1mol/L，pH = 7的磷酸缓冲盐溶液进行测试，以得到空白信号，然后将上述磷酸缓冲盐溶液换成上述四种浓度的多巴胺溶液，对以上体系进行光电化学发光测试，得到样品信号，最终得到传感器的电化学发光强度为样品信号减去空白信号。图3a所示为所述电化学发光传感器对不同浓度的多巴胺响应信号，随着多巴胺浓度的增加，发光信号也随之增强，该传感器对多巴胺的检测限达到了0.5nmol/L。将多巴胺浓度与电化学发光信号作图，并进行线性拟合(图3b，相关系数R = 0.9991)，图3的纵坐标为测试过程中电化学发光强度，在lnmol/L?20nmol/L范围内传感器的发光强度与多巴胺浓度呈现很好的线性关系。
[0047]实施例3
[0048]本发明提出的电化学发光传感器用于检测多巴胺在高浓度尿酸和抗坏血酸存在条件下的选择性测试如下:
[0049]测试在室温条件下进行，测试前，配置磷酸缓冲盐溶液，通过改变0.lmol/LNaH2PO4和0.lmol/L Na2HPO4水溶液的比例调节磷酸缓冲盐溶液的pH值为7，在溶液中加入lnmol/L多巴胺，100nmol/L尿酸和100nmol/L抗坏血酸配成干扰性测试溶液，以实施例1中制备的电化学发光传感器为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl (饱和KCl)为参比电极，将上述体系置于微弱发光仪的暗箱中，对其施加如下方波电位:(13s，0V)和(4s，-0.85V)(vs.Ag/AgCl)，测试四个循环。首先我们对0.1mol/L，pH=7的磷酸缓冲盐溶液进行测试，以得到空白信号，然后将上述磷酸缓冲盐溶液换成之前配置的干扰性测试溶液，对上述体系进行测试，得到样品信号，最终得到的传感器的电化学发光强度为样品信号减去空白信号。
[0050]图4反映了干扰性测试结果，发现，在100倍于多巴胺浓度的条件下，尿酸和抗坏血酸的电化学发光信号远远低于多巴胺，两种干扰性物质可以忽略，由此得出所制备的电化学发光传感器对多巴胺检测具有很好的选择性。
[0051]以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
【主权项】
1.一种检测多巴胺的电化学发光传感器，所述电化学发光传感器包括电极，所述电极包括基底、复合物层和修饰层，其特征在于，所述基底为导电材料，所述复合物层生长于所述导电基底表面上，由鲁米诺和硫酸联苯胺聚合而成，所述修饰层由修饰于复合物层表面的酪胺氧化酶构成。2.权利要求1所述的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，包括步骤: 1)在磷酸缓冲盐溶液中，配置鲁米诺和硫酸联苯胺溶液，采用循环伏安法，在导电基底上制备聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)复合物层， 2)将上述电极取出，干燥，以缓冲溶液配置酪胺氧化酶溶液，用循环伏安法在所述步骤I)得到的聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)复合物层表面固定酪胺氧化酶修饰层。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤I)中，磷酸缓冲盐溶液的pH值为5.5?8.5，循环伏安法制备中，以导电基底为工作电极，铂片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，所述导电基底为FTO或ITO导电玻璃。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤I)中，缓冲盐溶液中鲁米诺的摩尔浓度为I?10mmol/L，硫酸联苯胺的摩尔浓度为1.5?15mmol/L。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤I)中，在导电基底上制备聚(鲁米诺-硫酸联苯胺)复合物层时，循环伏安扫描的电位范围为-0.2V?1.0V，扫描圈数30?100圈，扫描速率80?200mV/s。6.根据权利要求2?5任一所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述缓冲溶液为pH为6.5?7.5的磷酸盐缓冲溶液，在所述缓冲溶液中含有浓度为0.05?2mg/mL的酪胺氧化酶。7.根据权利要求2?5任一所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，循环伏安扫描的电位范围为-0.2V?0.6V，扫描圈数10?30圈，扫描速率80?150mV/s。8.应用权利要求1所述电化学发光传感器检测多巴胺的方法，其特征在于，将待测溶液的PH值调节为6.8?7.2，在避光条件下，将所述电化学发光传感器的电极置于待测溶液中，施加方波电位，电位范围为-0.5?-0.9V(vs.Ag/AgCl)，测量电极的响应信号。9.根据权利要求8所述电化学发光传感器检测多巴胺的方法，其特征在于，用磷酸缓冲盐或硼砂缓冲溶液调节待测溶液的PH值。10.根据权利要求8或9所述电化学发光传感器检测多巴胺的方法，其特征在于，待测溶液中多巴胺的含量在0.5nmol/L以上。
【文档编号】G01N21/76GK105973876SQ201610286963
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】贺涛, 王艳杰, 张雪华, 张鑫
【申请人】国家纳米科学中心