的癌胚抗原的电化学免疫传感器的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及电化学免疫传感技术领域，特别是涉及一种基于纳米探针C6O的癌胚抗原(CEA)的电化学免疫传感器的构建方法。具体涉及一种金纳米簇作为抗体捕获基底，AuNPs@L-cys-C6Q标记的第二抗体作为氧化还原探针的电化学免疫传感器的构建方法。
【背景技术】
[0002]CEA属于胚胎抗原中的一种，是一种正常成分，因其在胚胎发育阶段由胚胎组织产生。随着胚胎的生长，胚胎的后期胚胎抗原的含量减少，出生后会逐渐消失或仅存在极微量。当细胞癌变时，此类抗原可被重新合成，并且表达于肿瘤细胞表面，也可分泌到血液中，其含量与细胞恶性程度常常呈正相关，因此，临床诊断上常把CEA作为检测肿瘤的一个重要指标。目前测定CEA的免疫方法主要有酶联免疫分析，荧光免疫分析，放射免疫分析等。这些传统的免疫分析方法通常存在操作复杂，价格昂贵，不适合实时检测。电化学免疫传感器由于所需仪器设备简单，灵敏度高，检测速度快，成本低，尤其是满足实时检测的需要而备受人们的广泛关注。基于电化学传感器的优良性质本发明制备了一种基于纳米探针C6q的CEA的电化学免疫传感器，以C6q为电化学探针，通过抗原抗体之间高度的特异性结合实现对CEA的检测。
[0003]本发明中金纳米簇作为第一抗体捕获基底，由于其良好的生物相容性，优异的导电性和大的表面积，不仅可以负载更多的抗体，而且可以促进蛋白质和电极之间的电子传递。AuNPs@L-cys-C6o作为电化学检测时的氧化还原纳米探针用于第二抗体的标记，基于抗原抗体之间良好的特异性，该传感器用于检测CEA。在本发明中构建的电化学免疫传感器具有成本低，稳定性好，制备过程简单，灵敏度高等优点，有效克服了目前CEA检测方法的不足。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是以AuNPs@L-cys-C6Q为电化学氧化还原探针，构建了一种简单快速，稳定性好，灵敏度高的电化学免疫传感器。
[0005]本发明的目的之二是将该电化学免疫传感器用于CEA的检测。
[0006]本发明的技术方案为:
1.一种基于纳米探针C6O的CEA的电化学免疫传感器的构建方法:
(1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3 min，氮气吹干；以10 mL含有浓度为1.0 mmoL/L的HAuCl4溶液为底液，以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极在-0.8?0.6 V电位范围内进行循环伏安扫描30圈后，将电极在0.1 moL/L的KCl溶液中浸泡过夜，用PBS(pH 7.4)缓冲液冲洗得到金纳米簇修饰玻碳电极(nano-Au/GCE)；
(2)取10yL 1-2.5 yg/mL的CEA第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4°C冰箱中孵育12 h，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到Abi/nano-Au/GCE;
(3)取10yL质量分数为1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到Abi/nano-Au/GCE表面，在37 °C下孵育I h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Abi/nano-Au/GCE ；
(4)将10yL 0.1 pg/mL?1.0ng/mL的一系列不同浓度的CEA标准溶液滴涂到BSA/Abi/nano-Au/GCE表面用于与抗体特异性识别，在37 °C下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到CEA/BSA/Abi/nano-Au/GCE ；
(5)滴加6~10yL AuNPs@L-cys-C6Q标记CEA第二抗体(Ab2-AuNPs@L-cys-C6Q)到上述电极表面，在37 °C下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，再取10 yL 10.0mmoL的四辛基溴化铵甲苯溶液滴涂到电极表面室温下孵育1min后用I3BS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于纳米探针C6q的CEA的电化学免疫传感器(Ab2-AuNPS@L-cyS-Ceo/CEA/BSA/Abi/nano-Au/GCE)。
[0007]2.上述的Ab2-AuNPs@L-cys-C6Q的制备:
(1)AuNPs@L-cys-C6Q的制备
在磁力搅拌下，将0.40 g的L-cys加入到于I mL 7.1 moL/L的NaOH溶液中，然后加入8mL乙醇继续搅拌使得溶液充分混勾，将2 mL I mg/mL的Cso的甲苯溶液加入到上述混合溶液中，在室温下持续搅拌24 h，用超纯水离心洗涤3次得到L-cys-C6Q；将L-cys-C6Q重新分散至IJ4 mL超纯水中，取2 mL 0.01 mol/L的HAuCU加入到上述溶液中搅拌24 h，之后滴加0.03 mol/L的抗坏血酸直至溶液成黑色，用超纯水离心洗涤得到AuNPs@L-cys-C6Q，将AuNPs@L-cys-C6Q重新分散到2 mL超纯水中；
(2)Ab2-AuNPs@L-cys-C6Q的制备
取0.2 mL 10 yg/mL的Ab2在搅拌的条件下加入到2 mL AuNPs@L-cys-C6Q溶液中，室温下搅拌30 min后在4 °C下孵育过夜，得到的混合溶液在9000 r/s离心15 min，弃去上清液，重新溶解到I mL PBS (pH 7.4)缓冲溶液中，得到Ab2-AuNPs@L-cys-C6Q溶液。
[0008]3.CEA的检测:
(1)实验在电化学工作站上进行，采用三电极体系以所制备的免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极。在PBS(pH 7.4)缓冲溶液中进行测试；
(2)用差分脉冲伏安法对一系列不同浓度CEA标准溶液及未特异性结合CEA的电极进行检测，扫描的电位区间为-0.4 V-0.4 V，扫描速度为100 mV/s，记录示差脉冲伏安图，根据所得的峰电流值和CEA浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)将待测样品溶液代替CEA标准溶液进行检测。
[0009]本发明的有益成果
(I)本发明以金纳米簇作为第一抗体捕获基底，不仅可以负载更多的抗体，而且可以促进蛋白质和电极之间的电子传递，进而增加电极的灵敏度；另外AuNPs@L-cys-C6Q作为电化学检测时的氧化还原纳米探针用于第二抗体的标记，一方面可以增加第二抗体的负载量，另一方面可以有效避免氧化还原探针分子的渗漏；
(2)本发明制备的电化学免疫传感器用于CEA的检测，具有简单、快速、高灵敏检测的优势，线性范围为0.1 pg/mL?1.0ng/mL，检出限为0.05 pg/mL。
[0010]【附图说明】: 图1所示为不同浓度CEA的差分脉冲伏安图。
[0011 ]图2所示为本发明峰电流差值与Igc线性关系图。
[0012]其中，图1中由a到j的氧化峰图分别代表CEA的浓度为0、1.0 X 10—13、5.0X10-13、1.0X10—12、5.0X10—12、1.0X10—n、5.0X10—η、1.ΟΧΙΟ—10、1.0X10—9 g/mL；
【具体实施方式】:
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
[0013]实施例1一种基于纳米探针C6q的CEA的电化学免疫传感器的构建方法
(1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3 min，氮气吹干；以10 mL含有浓度为1.0 mmoL/L的HAuCl4溶液为底液，以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极在-0.8?0.6 V电位范围内进行循环伏安扫描30圈后，将电极在0.1 moL/L的KCl溶液中浸泡过夜，用PBS(pH 7.4)缓冲液冲洗得到金纳米簇修饰玻碳电极(nano-Au/GCE)；
(2)取10yL 1.0 yg/mL的CEA第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4°C冰箱中孵育12 h，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到Abi/nano-Au/GCE;
(3)取10yL质量分数为1%的BSA溶液滴涂到Ah/nano-Au/GCE表面，在37 °C下孵育Ih，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到854/^131/11&110-Au/GCE；
(4)将10yL 0.1 pg/mL?1.0ng/mL的一系列不同浓度的CEA标准溶液滴涂到BSA/Abi/nano-Au/GCE表面用于与抗体特异性识别，在37 °C下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到CEA/BSA/Abi/nano-Au/GCE ；
(5)滴加6yL AuNPs@L-cyS-C6Q标记CEA第二抗体(Ab2-AuNPs@L_cyS-C6Q)到上述电极表面，在37 °C下孵育60 min，用roS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，再取10 yL 10 mmoL的四辛基溴化铵甲苯溶液滴涂到电极表面室温下孵育1min后用I3BS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于纳米探针C6q的CEA的电化学免疫传感器(Ab2-AuNPsOL-Cys-C60/CEA/BSA/Abi/nano-Au/GCE)。
[0014]实施例2—种基于纳米探针C6q的CEA的电化学免疫传感器的构建方法
(1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3 min，氮气吹干；以10 mL含有浓度为1.0 mmoL/L的HAuCl4溶液为底液，以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极在-0.8?0.6 V电位范围内进行循环伏安扫描30圈后，将电极在0.1 moL/L的KCl溶液中浸泡过夜，用PBS(pH 7.4)缓冲液冲洗得到金纳米簇修饰玻碳电极(nano-Au/GCE)；
(2)取10yL 2.0 yg/mL的CEA第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4°C冰箱中孵育12 h，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到Abi/nano-Au/GCE;
(3)取10yL质量分数为2%的BSA溶液滴涂到Abi/nano-Au/GCE表面，在37 °C下孵育Ih，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到854/^131/11&110-Au/GCE；
(4)将10yL 0.