一种电致化学发光生物传感器标记物的制备方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种电致化学发光生物传感器标记物的制备方法及应用，涉及纳米科学、生物免疫技术、电化学传感等领域。本发明利用金纳米颗粒和多孔石墨相氮化碳纳米片优异的催化性能，制备了金纳米颗粒负载的多孔石墨相氮化碳纳米片，通过氨基封端的聚乙二醇进行修饰，实现了发光试剂鲁米诺和生物分子的固定。纳米复合物对共反应试剂良好的催化性能极大提升了发光试剂的发光效率。多臂聚乙二醇不但提高了发光试剂和生物分子的固定量，其抗蛋白性质降低了非特异性分子的吸附，提高了灵敏度。该标记物可以适用于多种电化学发光生物传感器的制备，在科研和临床中具有广泛的应用前景。
【专利说明】
一种电致化学发光生物传感器标记物的制备方法及应用
技术领域
[0001]本发明涉及纳米科学、生物免疫技术、电化学传感等领域，具体涉及一种电致化学发光生物传感器标记物的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]物标志物检测是目前唯一无创的早期预警癌症等疾病的方法，在临床中对肿瘤的普查、诊断及判断预后等具有十分重要的意义。在众多的生物标志物检测方法中，电化学发光免疫分析是目前最先进的免疫测定技术，具有操作简便、样品量少、快速灵敏、成本低廉且易于实现微型化等优点，在临床和科研中得到了广泛应用。
[0003]电化学发光免疫传感器通常通过对抗原或抗体等生物分子进行标记来检测信号，但通常标记过程复杂，操作费时，并且信号较低。因此基于具有良好催化性能的纳米材料构建的电化学发光传感器标记物引起了人们极大的研究兴趣。电化学发光传感器具有步骤简单、方便快速、重现性好等优点，具有良好的应用前景。
[0004]具有稳定发光性能和良好生物相容性的标记物制备是构建电化学发光传感器的关键。石墨相氮化碳纳米片是一种具有良好催化性能的二维纳米材料，近来被用于构建电化学发光传感器，与传统半导体发光纳米材料相比，具有合成简单，成本低廉，生物相容性好等特点。但依然存在石墨相氮化碳纳米片修饰困难、缺乏简单而有效的标记方法等问题。传统的发光试剂在生物分子上的固定通常需要复杂的共价修饰过程，较低的固载量使发光性能大大降低，同时生物分子识别单元在纳米载体上的固定也需要复杂的修饰过程。
[0005]本发明利用金纳米颗粒和多孔石墨相氮化碳纳米片优异的催化性能，制备了金纳米颗粒负载的多孔石墨相氮化碳纳米片，通过氨基封端的聚乙二醇进行修饰，实现了发光试剂鲁米诺和生物分子的固定。纳米复合物对共反应试剂良好的催化性能极大提升了发光试剂的发光效率。多臂聚乙二醇不但提高了发光试剂和生物分子的固定量，其抗蛋白性质降低了非特异性分子的吸附，提高了灵敏度。本发明的目的之一是提供简单通用的电化学发光生物传感器用生物标记物的制备方法，解决传统标记物标记困难、信号差等问题。
[0006]本发明的目的之二是提供快速、低成本、通用的生物传感检测方法，为电化学发光生物传感器在实际中的应用提供技术基础。
[0007]—种电致化学发光生物传感器标记物的制备方法及应用，包括以下步骤:
(1)多孔石墨相氮化碳纳米片的制备:用三聚氰胺和硫脲作为前驱体通过550°C高温缩聚反应制备多孔石墨相氮化碳，然后将100 mg多孔石墨相氮化碳在100 mL超纯水中超声剥离10?24小时，5000转离心去掉未剥离的多孔石墨相氮化碳，制得多孔石墨相氮化碳纳米片的水溶液；
(2)金纳米颗粒的制备:用梓檬酸钠还原法制备粒径为10-14nm的金纳米颗粒；
(3)将2mL金纳米颗粒水溶液加入到5 1^浓度为0.5 mg.mL—1的多孔石墨相氮化碳纳米片水溶液中，振荡12小时，10000转离心得到金纳米颗粒与多孔石墨相氮化碳纳米片的纳米复合物； (4)在21^浓度为0.5 mg.mL—1的纳米复合物水溶液中加入50 口1^浓度为0.5 mg.mL—1的氨基封端的4臂或8臂聚乙二醇水溶液，振荡2小时后离心，重新分散到2 mL水中得到聚乙二醇包覆的纳米复合物；
(5)在聚乙二醇包覆的纳米复合物水溶液中加入5UL浓度为I mmol.mL—1的鲁米诺水溶液，用戊二醛进行交联，离心；
(6)将上述离心所得沉淀重新分散于2mL、0.1 mol.L—\pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，然后加入0.1 mL、10 yg.mL—1的二抗溶液，在4摄氏度下孵化2 h，离心，重新分散于2mL、0.1 mo I.L—\pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，即制得一种电致化学发光生物传感器二抗标记物溶液。
[0008]本发明的有益成果
(I)该标记物制备方法利用石墨相氮化碳纳米片的多孔结构很好地实现了金纳米颗粒的负载，从而便于进行氨基封端聚乙二醇的修饰。
[0009](2)该方法制备的标记物结合了石墨相氮化碳纳米片和金纳米颗粒对双氧水的双重催化作用，使鲁米诺的电化学发光效率大大提升。
[0010](3)该方法制备的标记物由于聚乙二醇的抗蛋白作用，避免了生物分子在标记物上的非特异性吸附，标记后可以直接进行传感器的构建。
【具体实施方式】
[0011]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0012]实施例1
前列腺特异性抗原二抗标记物的制备
(1)多孔石墨相氮化碳纳米片的制备:用三聚氰胺和硫脲作为前驱体通过550°C高温缩聚反应制备多孔石墨相氮化碳，然后将100 mg多孔石墨相氮化碳在100 mL超纯水中超声剥离24小时，5000转离心去掉未剥离的多孔石墨相氮化碳，制得多孔石墨相氮化碳纳米片的水溶液；
(2)金纳米颗粒的制备:用梓檬酸钠还原法制备粒径为10-14nm的金纳米颗粒；
(3)将2mL金纳米颗粒水溶液加入到5 1^浓度为0.5 mg.mL—1的多孔石墨相氮化碳纳米片水溶液中，振荡12小时，10000转离心得到金纳米颗粒与多孔石墨相氮化碳纳米片的纳米复合物；
(4)在21^浓度为0.5 mg.mL—1的纳米复合物水溶液中加入50 口1^浓度为0.5 mg.mL—1的氨基封端的分子量为10 kDa的8臂聚乙二醇水溶液，振荡2小时后离心，重新分散到2 mL水中得到聚乙二醇包覆的纳米复合物；
(5)在聚乙二醇包覆的纳米复合物水溶液中加入5UL浓度为I mmol.mL—1的鲁米诺水溶液，用戊二醛进行交联，离心；
(6)将上述离心所得沉淀重新分散于2mL、0.1 mol.L—\pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，然后加入0.1 mL、10 yg ^mL-1的前列腺特异性抗原二抗溶液，在4摄氏度下孵化2 h，离心，重新分散于2 mL、0.1 mo I.L—\pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，即制得前列腺特异性抗原二抗标记物溶液。
[0013]实施例2
前列腺特异性抗原电致化学发光免疫传感器的构建
(1)用移液枪将5UL浓度为1.0 mg.mL.1的氨基化石墨烯溶液滴涂在处理、活化好直径为4 mm的玻碳电极表面，室温瞭干；
(2)用移液枪将5UL前列腺特异性抗原捕获抗体溶液(10 Hg mL—1)滴涂在步骤(I)制得的电极表面，4°C条件下晾干。
[0014](3)非特异性位点封闭:用超纯水多次冲洗步骤(2)制得的电极，用移液枪将6 pL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液滴涂在步骤(2)制得的电极表面，4°C条件下晾干，超纯水冲洗。
[0015](4)用移液枪滴涂5 UL前列腺特异性抗原标准溶液或未知样品溶液至电极表面，4°C下晾干，超纯水冲洗。
[0016](5)将4 yL前列腺特异性抗原二抗标记物溶液滴至电极表面，置于40C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干。
[0017](6)以步骤(5)制得的电极为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt电极为对电极，用pH为7.4的PBS缓冲溶液配制的20 mmol.mL—1的H2O2溶液作为底液，在电化学发光工作站上以循环伏安模式测定0.2?0.8 V电势下的发光信号，制得一种前列腺特异性抗原的电致化学发光生物传感器。
【主权项】
1.一种电致化学发光生物传感器标记物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)多孔石墨相氮化碳纳米片的制备:用三聚氰胺和硫脲作为前驱体通过550°C高温缩聚反应制备多孔石墨相氮化碳，然后将100 mg多孔石墨相氮化碳在100 mL超纯水中超声剥离10?24小时，5000转离心去掉未剥离的多孔石墨相氮化碳，制得多孔石墨相氮化碳纳米片的水溶液； (2)金纳米颗粒的制备:用梓檬酸钠还原法制备粒径为10-14nm的金纳米颗粒； (3)将2mL金纳米颗粒水溶液加入到5 1^浓度为0.5 mg.mL—1的多孔石墨相氮化碳纳米片水溶液中，振荡12小时，10000转离心得到金纳米颗粒与多孔石墨相氮化碳纳米片的纳米复合物； (4)在21^浓度为0.5 mg.mL—1的纳米复合物水溶液中加入50 口1^浓度为0.5 mg.mL—1的聚乙二醇水溶液，振荡2小时后离心，重新分散到2 mL水中得到聚乙二醇包覆的纳米复合物； (5)在聚乙二醇包覆的纳米复合物水溶液中加入5UL浓度为I mmol.mL—1的鲁米诺水溶液，用戊二醛进行交联，离心； (6)将上述离心所得沉淀重新分散于2mL、0.1 mol.Γ\ρΗ 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，然后加入0.1 mL、10 yg.mL—1的二抗溶液，在4摄氏度下孵化2 h，离心，重新分散于2 mL、0.1 mo I *L—\pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，即制得一种电致化学发光生物传感器二抗标记物。2.根据权利要求1所述的一种电致化学发光生物传感器标记物的制备方法，其特征在于，所述的聚乙二醇为氨基封端的4臂或8臂聚乙二醇，分子量为10?40 kDa。3.根据权利要求1所述的一种电致化学发光生物传感器标记物的制备方法，其特征在于，所述制备的标记物用于构建一抗/抗原/ 二抗标记物的双抗体夹心型生物传感器，通过所制备的二抗标记物的电致化学发光信号实现目标物的检测。
【文档编号】G01N21/76GK106066324SQ201610369739
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年5月30日 公开号201610369739.9, CN 106066324 A, CN 106066324A, CN 201610369739, CN-A-106066324, CN106066324 A, CN106066324A, CN201610369739, CN201610369739.9
【发明人】马洪敏, 魏琴, 吴丹, 张勇, 庞雪辉, 胡丽华, 杜斌, 范大伟
【申请人】济南大学