构建无选择标记的自主发光脓肿分枝杆菌的方法及建立相应体外高通量筛药模型的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种通过生物技术改造获得的脓肿分枝杆菌 a办cessys)，具体地说是一种无选择标记的可自主发光的脓肿分枝杆菌。此外，本发明还首 次将安普霉素抗性基因作为抗性筛选标记应用到脓肿分枝杆菌中。
【背景技术】
[0002] 分枝杆菌属（Mycobacterium)是一类细长略弯曲的微生物，有时有分枝或出现丝 状体。目前在分类学上已将分枝杆菌属归纳于放线菌中。对人致病的放线菌可分含和不含 分枝菌酸两类。分枝杆菌属于含分枝菌酸类。本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂 质，主要是分枝菌酸。这和其染色性、生长特性、致病性、抵抗力等密切相关。一般不易着 色，若经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌 (acid-fast bacilli)。该菌属无鞭毛、无芽胞、一般不产生内、外毒素，其致病性和菌体成 分有关。引起的疾病都呈慢性，并伴有肉芽肿。分枝杆菌种类较多，主要可分为结核分枝杆 菌复合群、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌三类。
[0003] 胺肿分枝杆菌a/wcesstts)是一种快速生长的非 结核分枝杆菌NTM)，于1992年被命名。脓肿分枝杆菌可 引起肺部、皮肤和皮下软组织感染，其他感染包括颈淋巴结炎、中耳等。它可以引起散在的 和爆发性的流行，近年来已经成为医院内感染的重要病原菌，是在肺部疾病中最常被分离 出来的快速生长的非结核分枝杆菌。在美国和澳大利亚、中国都分别有报道指出，在过去的 十年中，由于脓肿引起的感染成上升的趋势。
[0004] 脓肿分枝杆菌对抗生素的敏感性，多数资料表明仅有中度及低度的敏感药物，无 高度敏感的药物。除少数脓肿分枝杆菌对一些氨基糖苷类药物如克拉霉素、阿奇霉素、丁胺 卡那（MIC>2 yg/mL)及喹诺酮药物如阿米卡星MIC>2 yg/mL)等敏感外，对其他药物呈不 同程度的耐药或部分菌株高度耐药。所有的脓肿分枝杆菌对抗结核药物均高度耐药：利福 平MIC>512 yg/mL，异烟肼MIC>256 yg/mL。目前，脓肿分枝杆菌的致病和耐药机制尚不 清楚，临床治疗只能依赖于药物敏感试验的结果选用抗生素治疗，但此菌生长缓慢，药敏试 验结果需要4~5天时间才能完成；由于对多种抗生素耐药，治疗相当困难，使病程迀延，经 久不愈。为寻找有效的治疗药物，本文就其耐药机制的研宄进展进行综述。因此，寻找能够 有效治疗脓肿分枝杆菌的药物具有重要的临床意义。
[0005] 目前，对分枝杆菌噬菌体进行遗传操作，通常采用卡那霉素抗性基因或潮霉素抗 性基因作为抗性筛选标记。但是，脓肿分枝杆菌对卡那霉素以及潮霉素B不敏感，所以为了 方便对其进行遗传操作急需找到可用的抗性筛选标记。本次发明中涉及的抗安普霉素基因 是首次作为抗性筛选标记在脓肿分枝杆菌中应用。
[0006] 之前，以张天宇为主要发明人的专利"整合质粒pOPHI及无抗性筛选标记的自主 发光分枝杆菌"，是采取的技术方案与此次构建构建的自主发光的脓肿分枝杆菌方案类似。 但是，其专利使用的整合酶基因是来自于分枝杆菌噬菌体L5,而该技术使用的整合酶 基因是来自于分枝杆菌噬菌体Tweety。同时，此次专利首次将々tt抗性基因作为脓肿 分枝杆菌的抗性筛选标记，并且，在此之前没有发现任何可用于脓肿分枝杆菌的抗性筛选 记D
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种重组质粒pOPAIlB。
[0008] 本发明的另一个目的是提供一种无抗性筛选标记的自主发光脓肿分枝杆菌。
[0009] 本发明所采取的技术方案是： 一种转化脓肿分枝杆菌的重组质粒P0PAI1B，其特征在于：该重组质粒pOPAIlB按逆时 针方向依次含有启动子，发光所需酶基因抗性筛选基因々tt和整合酶基因7/^的 融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列诉/S和诉/I，以及噬菌体整合位点W沈和复 制子。
[0010] 进一步的，上述抗性筛选基因为安普霉素抗性基因々7T，其序列如SEQ ID NO: 1所 不〇
[0011] 进一步的，上述菌体整合位点为分枝杆菌菌体Tweety的aM/3位点，其 序列如SEQ ID N0:4所示。
[0012] 进一步的，上述菌体整合酶//?(为分枝杆菌菌体Tweety的整合酶其序列 如 SEQ ID N0:6 所示。
[0013] 进一步的，上述诉/S的序列如SEQ ID NO: 2所示，仍YI的序列如SEQ ID NO: 3所 不〇
[0014] 进一步的，上述重组质粒pOPAIlB的核苷酸序列如SEQIDN0:7所示。
[0015] 一种转化脓肿分枝杆菌的重组质粒pOPAIlB的构建方法，包括如下步骤： 1) 构建质粒P0P1B :起始质粒pOPHI用限制性内切酶5^ I和通〇1消化后，回收约9 kb的功能片段A;以质粒pTTPlB为模板，用引物attplBf与引物attplBr扩增出约250 bp 的片段（SEQ ID N0:4)，片段fee I和沿o I酶切后与功能片段A进行连接， 得到约9 kb的质粒pOPlB; 2) 构建质粒pU⑶Hmke :将质粒pU⑶is用油al消化，得到约2. 7 kb的功能片段；以质 粒pNBVl为模板，用引物hygr727与引物hygf0616扩增出约1. lkb的场叉片段（SEQ ID NO: 5)，片段办g经油al酶切后与约2. 7 kb的功能片段进行连接，得到约3. 8 kb的质粒 pUCDH，再将质粒pUCDH中的办g基因内部的办两个酶切位点进行点突变，获得质 粒 pUCDHmke; 3) 构建质粒pUCDIlB :质粒pUCDHmke用限制性内切酶I和油a I消化后，回收约 2. 7kb的功能片段B;以质粒pTTPlB为模板，用引物intlBf与引物intlBr扩增出约1.4 kb的片段（SEQ ID N0:6)，片段7/7經兔a I和油a I酶切后与功能片段B进行连接， 得到约4. lkb的质粒pU⑶I1B; 4) 构建质粒pU⑶IAm :用限制性内切酶油al消化质粒pU⑶I，回收约4. 0 kb功能片段； 以质粒PIJ6902为模板，用引物AprXf与引物AprXr扩增出约860 bp的々tt片段（SEQ ID N0:1);将上述约4. 0 kb功能片段和々tt片段连接得约4. 9 kb的质粒pUCDAI，再将pUCDAI 中々tt基因内部的通〇1酶切位点进行点突变，去掉通〇1位点，得质粒pUCDIAm ; 5)构建质粒pUCDAIlB :用限制性内切酶油al消化质粒pU⑶I1B，得到约4. 1 kb功能 片段；用限制性内切酶油al消化质粒pUCDIAm，回收约860bp的功能片段观a 1-如广观al ; 将该2种功能片段进行连接，得到约5. 0 kb的质粒pUCDAIlB ; 6 )构建质粒pOPAI 1B:用限制性内切酶通〇1消化质粒pOP 1B，得到约9. 3 kb功 能片段；用限制性内切酶通〇1消化质粒pUCDAI 1B，回收约2. 3 kb的功能片段通〇 I-〇7/_ - ZAo I ;将该2种功能片段进行连接，得到红11. 7 kb的质粒 pOPAIlB ； 上述引物 attplBf、attplBr、hygr727、hygf0616、intlBf、intlBr、AprXf 和 AprXr 的序 列依次分别如SEQ ID NO:8~15所示。
[0016] 一种无抗性筛选标记的自主发光的脓肿分枝杆菌，其制备方法包括以下步骤： 1) 电转化法将上述的重组质粒pOPAI 1B转入脓肿分枝杆菌中，获得自主发光脓肿分枝 杆菌； 2) 将获得的自主发光脓肿分枝杆菌传代培养筛选出抗性基因和整合酶基因均丢失的 发光菌即为无抗性筛选标记的自主发光脓肿分枝杆菌。
[0017] 进一步的，上述步骤2)的具体操作为：将步骤1)得到的发光菌挑取少量菌落到无 抗性的7H9培育基中，摇床培养，培养物稀释后铺板37°C培养，挑取多个单菌落同时划线到 无抗生素的7H11板和含安普霉素（Apr)的7H11板上，37°C培养，挑取在Apr板上未长出， 而在相应的无抗板上长出的克隆到7H9培养基中培养，再取培养物铺于Apr板上培养，若平 板上无单克隆长出，则筛选所得相应克隆是正确的丢失Apr抗性的克隆。
[0018] 本发明的有益效果是： 1)本发明是首次将安普霉素抗性基因作为抗性筛选标记应用到脓肿分枝杆菌中，在此 之前未发现任何可以用于脓肿分枝杆菌的抗性筛选标记。本提供了含有安普霉素抗性基因 的用于构建自主发光脓肿分枝杆菌的质粒pOPAI 1B，为后续的脓肿分枝杆菌遗传操作提供 一个新的方法。
[0019] 2)由质粒pO