一种敲除c‑di‑AMP分解酶的重组耻垢分枝杆菌株及其应用的制作方法

本发明属于结核病疫苗及免疫治疗领域。本发明涉及一种敲除c-di-amp分解酶的重组耻垢分枝杆菌株。本发明还涉及上述重组耻垢分枝杆菌株用于预防和/或治疗结核病的疫苗及制剂中的应用。

背景技术：

结核病流行现状

结核病(tuberculosis，tb)是全球范围内严重危害人类健康的慢性传染病。结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，mtb)是tb的病原体，据who报告，2015年，全球估计新发病例1040万，新发病例中有120万(11％)hiv患者，共计140万人死于tb。tb在死亡原因中仍排在前十位。印度、印度尼西亚、中国、尼日利亚、巴基斯坦和南非这六个国家占了新发病例总数的60％。积极的tb防治研究及措施在2000年至2015年避免了4900万tb死亡，但目前tb流行态势和危害程度表明，在tb预防、诊断和治疗方面的缺口还很大。

结核病防治现状

卡介苗(bacilluscalmette-guérinvaccine，bcg)是目前用于结核病预防的唯一疫苗。bcg主要作为mtb感染前的预防性疫苗，并针对mtb的早期感染，不能预防和控制潜伏感染状态mtb的复发，但其存在着保护期短、保护性免疫应答不强等缺点，并且作为一种减毒活疫苗，不能用于免疫低下人群的接种，因此研制开发安全、可靠的新型tb疫苗迫在眉睫。

在tb的治疗方面，由于tb化疗疗程长达6个月以上，导致患者不能坚持服药和依从性差，并往往引起耐药，特别是出现广泛结核耐药和超级耐药结核菌。随着对mtb本质认识的逐步深入，已证实tb患者th1型细胞免疫反应较低，因此可提高机体免疫功能、尤其是th1型反应的治疗性疫苗具有较好的应用前景。该类疫苗主要用于己感染mtb无症状携带者或是己发病的患者，选择性地诱导人体的特异性和非特异性免疫应答，最终达到治疗的目的(mi,etal.therapeuticvaccinesfortuberculosis--asystematicreview.vaccine.2014,32(26):3162-8)。目前正在开发的tb新型疫苗主要包括亚单位疫苗、基因疫苗、重组bcg疫苗、减毒或增强的全菌体活疫苗、营养缺陷型活疫苗、结合dc的疫苗等，但目前还没有一种新型疫苗可以替代传统的bcg或用于tb的免疫治疗。

重组分枝杆菌疫苗的研究

将外源性基因导入分枝杆菌构建成重组活疫苗是该领域研究重要方向之一。bcg是研究较多的分枝杆菌活疫苗载体，但存在生长缓慢、转化效率低、遗传操作复杂等问题，且bcg本身为减毒株，不能用于免疫低下人群接种。

耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis，ms)是一种生长快，转化效率高的非致病菌分枝杆菌和强细胞免疫佐剂，具有与bcg相似的免疫学特性。如zhudy,etal.(recombinantm.smegmatisvaccinetargeteddeliveringil-12/glsintomacrophagescaninducespecificcellularimmunityagainstm.tuberculosisinbalb/cmice.vaccine,2007,25(4):638-648.)等构建了表达il12和gls融合基因的rms，该疫苗能够刺激t淋巴细胞增殖，启动th1细胞免疫应答，促使细胞因子分泌，提高机体对分枝杆菌的免疫清除。tulliusmv等(highextracellularlevelsofmycobacteriumtuberculosisglutaminesynthetaseandsuperoxidedismutaseinactivelygrowingculturesareduetohighexpressionandextracellularstabilityratherthantoaprotein-specificexportmechanism.immunolcellbiol.2003,87(7):209-215.)将mtb蛋白转入ms表达，结果表明重组蛋白与天然蛋白的生化及免疫特性几乎完全相同。另外，ms生长速度快，goldstonerm等(anewvectorandexpressionprotocolforfastandefficientrecombinantproteinexpressioninmycobacteriumsmegmatis.proteinexpressionandpurification,2008,57(1):81-87.)建立了在ms菌株中可溶表达mtb蛋白的方法，其研究表明，ms表达外源蛋白产量高且其产量为bcg的5～10倍。bashiri等用ms作为宿主菌表达的重组蛋白，可用于结构和功能研究(bashirig,bakeren.productionofrecombinantproteinsinmycobacteriumsmegmatisforstructuralandfunctionalstudies.proteinsci.2015,24(1):1-10.)。因此，ms是分枝杆菌活疫苗的优良载体。

重组耻垢分枝杆菌(rms)活疫苗用于mtb感染的治疗，可以通过恢复保护性免疫，促进单核巨噬细胞产生更多的h2o2和no，有效清除mtb，增强机体免疫应答能力(徐苗,等.耻垢分枝杆菌疫苗对小鼠巨噬细胞产生一氧化氮的影响.中国医学科学院学报,2009,(4):410-412.)；还可改变免疫应答的th1/th2模式，使免疫应答从th2型向th1型偏移，从而有助于机体免疫细胞杀灭mtb持留菌和耐药菌，缩短化疗疗程(徐苗等.耻垢分枝杆菌疫苗对小鼠细胞因子产生及th1/th2应答的影响.中华结核和呼吸杂志,2005,(11):49-52.)。ms为无毒的分枝杆菌，许多实验已证实其安全性，国内徐苗、王国治等(无细胞耻垢分枝杆菌疫苗对豚鼠的长期毒性研究.中国新药杂志,2006,(19):1640-1643.)研究表明，长期使用无细胞ms疫苗对豚鼠无显著毒性作用，并且他们制备的无细胞ms菌用于tb的免疫治疗，取得了比较好的效果(耻垢分枝杆菌作为免疫调节剂的研究.中华微生物学和免疫学杂志,2005,(9):752-755.)。因此，rms具有高效、安全性好等显著优势，是tb新型预防和治疗性疫苗的重要工具。

选择合适的靶抗原可显著提高疫苗的保护效率。对于mtb保护性抗原的研究已持续多年，主要有分泌蛋白如esat-6、cfp10、ag85、tb10.4、mtb39和mtb32等，热休克家族如hsp65、hsp70、hspx等，及融合蛋白mtb72f等抗原。但是，目前仍未获得可用于预防和治疗的重组疫苗，表明仍需广泛筛选新的mtb抗原，以获得免疫效果更好的重组分枝杆菌，用于tb的防治。

第二信号分子c-di-amp成为细菌性疫苗研究新靶点

2008年，新发现一种细菌信号分子——环二腺苷(cyclicdi-adenosinemonophosphate，c-di-amp)(witte,g.,etal.structuralbiochemistryofabacterialcheckpointproteinrevealsdiadenylatecyclaseactivityregulatedbydnarecombinationintermediates.molcell,2008.30(2):167-78.)。c-di-amp参与金黄色葡萄球菌、链球菌、枯草芽胞杆菌、李斯特假单胞菌等细菌的细胞壁合成、压力感应、生物被膜形成、离子代谢等多种生理过程(krastevapvetal.versatilemodesofcellularregulationviacyclicdinucleotides.natchembiol.2017,13(4):350-359)。研究表明，c-di-amp调节mtb菌体长度、细胞壁形成、脂代谢以及致病性。研究还表明，c-di-amp可直接激活sting，诱导宿主细胞i型干扰素释放为特征的固有免疫应答(andradewa,etal.groupbstreptococcusdegradescyclic-di-amptomodulatesting-dependenttypeiinterferonproduction.cellhostmicrobe.2016,20(1):49-59.)，而且c-di-amp单独或联合抗原免疫，可调节th1/th2/th17适应性免疫应答，具有显著的免疫佐剂作用(ebensen,t,etal.bis-(3',5')-cyclicdimericadenosinemonophosphate:strongth1/th2/th17promotingmucosaladjuvant.vaccine,2011,29(32):5210-20.)。c-di-amp仅存在于细菌中，而真核细胞中没有，因此c-di-amp成为细菌性疫苗和药物研究的新靶点。

c-di-amp由两分子atp经二腺苷酸环化酶(diadenylatecyclasea，daca)催化合成。rv3586是mtb中合成c-di-amp的dac酶。junyang等(deletionofthecyclicdi-ampphosphodiesterasegene(cnpb)inmycobacteriumtuberculosisleadstoreducedvirulenceinamousemodelofinfection.2014,93(1):65-79.)研究证明，含有dhh结构域的rv2837c为mtb的c-di-amp降解酶，并将其命名为cnpb。manikandank等(two-stepsynthesisandhydrolysisofcyclicdi-ampinmycobacteriumtuberculosis.plosone.201423；9(1):e86096.)发现rv2837c可先将c-di-amp降解为papa，进一步降解为5'-amp。posticg等(characterizationofnrnahomologsfrommycobacteriumtuberculosisandmycoplasmapneumoniae.201218(1):155-65.)发现rv2837c具有rna酶活性，推测其在细菌致病过程中具有重要的调节作用。junyang等进一步研究发现，rv2837c突变株c-di-amp水平升高，该突变株感染sting-/-缺陷小鼠mφ，il-1β释放显著增加。动物实验表明，该菌株促进宿主免疫清除mtb，动物存活时间延长。deyrj等(inhibitionofinnateimmunecytosolicsurveillancebyanm.tuberculosisphosphodiesterase.natchembiol.2017,13(2):210-217.)研究发现，突变c-di-amp分解酶rv2837c可使mtb毒性降低，而rv2837c抑制剂的使用，可通过胞浆cgas-sting通路的激活，改变mtb感染的结局。综上所述，含有dhh结构域的rv2837c蛋白具有降解c-di-amp的酶活性，在mtb中突变该酶，不仅使菌株毒力下降，还可使细菌c-di-amp水平显著上升，分泌的c-di-amp可激活胞浆sting通路介导的固有免疫应答，最终促进胞内菌的免疫清除，因此，还有dhh结构域的c-di-amp降解酶成为疫苗和药物研究的新靶点。

在ms中，msmeg_2630编码与rv2837c相似的dhh结构域蛋白，两者同源性为82％。msmeg_2630基因1023bp，编码蛋白分子量约为35.5kda。国内华中农业大学tangq等(functionalanalysisofac-di-amp-specificphosphodiesterasemspdefrommycobacteriumsmegmatis.intjbiolsci.2015,11(7):813-24)采用sacb-lacz营养缺陷型筛选系统，构建了msmsmeg_2630基因突变株。表型研究表明，msmeg_2630具有与rv2837c相似的磷酸二酯酶活性，可水解c-di-amp。敲除msmeg_2630基因，ms菌株菌落形态、脂代谢及离子代谢改变，并且菌株的c-di-amp水平显著上升。因此，msmeg_2630是ms的c-di-amp降解酶，敲除该基因，细菌产生c-di-amp水平显著增加，该菌株免疫后，其分泌的c-di-amp将促进固有免疫应答，有利于宿主免疫清除胞内菌。

技术实现要素：

本发明的目的是获得一种敲除c-di-amp分解酶的重组耻垢分枝杆菌株。所述菌株可用于结核病预防和治疗性疫苗的研制。

本发明是这样实现的：

以ms的基因组为模板，pcr扩增c-di-amp降解酶基因msmeg_2630的上下游同源臂，将其分别连入pmsg360载体，阳性克隆质粒命名为pw75。制备ms感受态细胞，转化含有重组酶gp60和gp61基因的pjv53质粒，阳性克隆命名为ms-pjv53。制备ms-pjv53菌株感受态细胞，电转化重组质粒pw75，博来霉素抗性平板筛选阳性克隆，pcr和westren-blot鉴定目的基因敲除情况，阳性克隆命名为敲除c-di-amp分解酶的重组耻垢分枝杆菌株(rms-δcnpb)，已送中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为：cctccm2016336。

所述的重组rms-δcnpb用于预防和治疗结核病疫苗及制剂中的应用。

所述的菌株rms-δcnpb扩大培养后，取10⁷皮下免疫小鼠，免间隔2周，免疫2次，免疫完成后6周，检测体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平(脾淋巴细胞增殖、细胞因子转录和分泌水平)；免疫完成后6周，以mtbh37ra株攻击感染免疫小鼠，6周后，检测体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平(脾淋巴细胞增殖、细胞因子转录和分泌水平)，并计数主要脏器荷菌数。结果显示，获得的rms-δcnpb菌株免疫小鼠，可诱导小鼠体液免疫应答反应，但整体水平不高；细胞免疫中，可诱导显著的脾淋巴细胞增殖，ifn-γ水平升高，但水平低于ms，而th2型细胞因子il-10水平没有显著升高；以h37ra攻击感染后，th1型细胞因子ifn-γ和il-2水平显著升高，而il-10水平仍保持在比较低的水平，表明rms-δcnpb免疫后，可诱导适度的体液和细胞免疫应答，而感染后，细胞免疫应答水平迅速上升，尤其是th1型反应，有助于宿主抗感染免疫。ms和rms-δcnpb免疫，均可抵抗一定量的h37ra攻击感染。rms-δcnpb菌株和ms菌株均有有诱导宿主免疫应答的作用，rms-δcnpb菌株单纯免疫，诱导ifn-γ水平不高，而感染后，其诱导th1型细胞因子显著升高，而il-10水平仍保持在比较低的水平，表明对th1/th2反应的调节显著优于ms，因而具有比较好的应用前景。

附图说明

图1：msmeg_2630上下游同源臂克隆入pmsg360载体酶切鉴定结果图。

图2：rms-δcnpb重组菌基因型鉴定pcr结果图。

图3：rms-δcnpb重组菌表型鉴定western-blot结果图。

图4：rms-δcnpb免疫小鼠血清抗体检测结果图。

图5：rms-δcnpb免疫小鼠脾淋巴细胞增殖结果图。

图6：rms-δcnpb免疫小鼠脾淋巴细胞因子转录水平rt-pcr检测结果图。

图7：rms-δcnpb免疫小鼠脾淋巴细胞因子分泌水平elisa检测结果图。

图8：rms-δcnpb免疫小鼠h37ra感染后脾淋巴细胞因子分泌水平rt-pcr检测结果图。

图9：rms-δcnpb免疫小鼠h37ra感染后脾淋巴细胞因子分泌水平elisa检测结果图。

图10：rms-δcnpb免疫小鼠h37ra感染后脏器荷菌数结果图。保藏证明

分类命名

耻垢分枝杆菌rms-δcnpb

拉丁文学名

mycobacteriumsmegmatisrms-δcnpb

保藏单位名称

中国典型培养物保藏中心

地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山

保藏日期

2016年6月20日

保藏号

cctccm2016336

具体实施方式

msmeg_2630基因同源重组敲除质粒的构建

根据msmc²155株的基因组msmeg_2630基因上下游序列设计引物：

由上海生工生物科技有限公司合成引物。以msmc²155株的基因组为模板，pcr扩增目的基因，反应参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环，末次循环后72℃延伸5min。1％琼脂糖凝胶电泳分析表明，分别扩增出456bp和468bp目的条带。凝胶回收试剂盒回收目的片段，分别酶切，先后与同样酶切并回收的pmsg360质粒连接，并转化e.colidh5α感受态细胞，用博莱霉素抗性平板筛选。挑取阳性克隆接种于lb液体培养基37℃振荡培养过夜，试剂盒提取质粒dna，酶切鉴定阳性质粒进行序列测定(图1)。序列测定结果显示，与msmc²155株基因组msmeg_2630基因上、下游公布序列完全一致，表明成功构建msmeg_2630基因同源重组敲除质粒，命名为pw75，该载体中插入的msmeg_2630基因上、下游序列分别如seqidno:1和no:2所示。

msmeg_2630基因敲除株(rms-δcnpb)的构建

ms感受态细胞制备

ms接种于3ml7h9培养基，37℃100rpm振荡培养48h，按1:100的比例转接于50ml培养基，继续培养至od600＝0.8～1.0，冰浴1h。预冷的10％甘油溶液洗涤三次，分装(100μl/管)，-80℃保存。

构建含有重组酶gp60和gp61的ms感受态细胞

在大肠杆菌中扩增pjv53，试剂盒纯化质粒，冰上融化ms感受态细胞45μl，加入pjv53质粒5μl，混匀后冰上放置10min，将50μl混合液移至0.1cm的电转杯(biorad)中，电转化参数：1.25kv，25μf，1000ω，冰上放置10min，加入1ml7h9培养2h，涂布抗生素平板，37℃培养3-4d至菌落生成。pcr鉴定阳性克隆。命名为ms-pjv53。

构建msmeg_2630敲除株(rms-δcnpb)

按照上述方法制备感受态细胞和电转化方法，取ms-pjv53菌株制备感受态细胞，电转化pw75，博来霉素抗性平板筛选克隆，挑取克隆pcr鉴定，以msmeg_2630引物扩增，不能扩增出目的基因的菌株为敲除株(图2)，挑取阳性克隆于7h9培养基，37℃震荡培养3-4d，制备菌体总蛋白样品，12％sds-page电泳后，转印到pvdf膜，以msmeg_2630蛋白免疫后的多克隆小鼠血清为一抗，westren-blot鉴定结果显示，rms株菌体蛋白36kda处目的蛋白缺失，表明目的基因成功敲除(图3)，阳性克隆命名为敲除c-di-amp分解酶的重组耻垢分枝杆菌株(rms-δcnpb)，已送中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为：cctccm2016336。

rms-δcnpb免疫小鼠应答水平检测

实验动物分组及免疫：取6周龄雌性balb/c小鼠随机分为4组(n＝6)，正常对照组(naive)、未免疫组(un)、ms免疫组和rms-δcnpb免疫组。ms和rms组以10⁷cfu/只经腹股沟皮下免疫接种，间隔2周，免疫2次；免疫完成后6w，处死小鼠，检测体液和细胞免疫水平。

1、免疫小鼠体液免疫水平检测

以ms菌体蛋白为抗原包被elisa板，间接法检测各组免疫小鼠血清中特异性抗体，结果表明，ms免疫组和rms-δcnpb免疫组可检测到较低浓度的抗体(图4)。

2、免疫小鼠细胞免疫水平检测

(1)脾淋巴细胞增殖

在小鼠免疫完成后6w，无菌分离各组小鼠脾淋巴细胞，96孔板每孔接种1×10⁵个细胞，加入终浓度为25mg/l的ms菌体蛋白刺激培养72h后，加入20μl/孔的mts(5mg/ml)，继续培养4h，最后加入10％sds25μl/孔，测定a490值。结果用增殖指数si表示：si＝a490(实验组－空白对照)/a490(阴性对照－空白对照)。结果显示，以ms菌体蛋白为刺激蛋白，ms免疫组和rms-δcnpb免疫组si呈升高趋势(p<0.05)，但两组之间无显著差异(p>0.05)(图5)。

(2)脾淋巴细胞因子转录水平

免疫完成后6w，无菌取小鼠脾组织，试剂盒提取组织总rna，qrt-pcr相对定量法检测细胞因子转录水平，结果显示：ms免疫组和rms-δcnpb免疫组ifn-γ、il-2和il-10转录水平均显著上升(p<0.001)，而两组间无显著差异(p>0.05)(图6)。

(3)脾淋巴细胞因子分泌水平

收集上述脾淋巴细胞刺激培养上清，elisa检测上清中细胞因子ifn-γ、il-2和il-10的水平。结果显示：ms免疫组和rms-δcnpb免疫组ifn-γ、il-2和il-10转录水平均显著上升(p<0.001)，而rms-δcnpb免疫组ifn-γ分泌水平显著低于ms组(p<0.05)，表明rms-δcnpb免疫可能调节宿主细胞免疫，使其对ms免疫后ifn-γ反应水平下降(图7)。

rms-δcnpb免疫小鼠对h37ra感染的保护作用

上述各组小鼠免疫完成后6w，以mtbh37ra10⁴cfu/只经尾静脉攻击感染免疫的小鼠，感染后6w，处死小鼠，进行如下检测。

1、免疫小鼠h37ra感染后脾淋巴细胞因子转录水平

无菌取小鼠肺、脾组织，试剂盒提取组织总rna，qrt-pcr绝对定量法检测脾淋巴细胞因子转录水平，结果显示，ms免疫组和rms-δcnpb免疫组ifn-γ、il-2和il-10转录水平均显著上升，rms-δcnpb免疫组th1型细胞因子ifn-γ、il-2转录水平显著高于ms组(p<0.05，p<0.01)，而th2型细胞因子il-10转录水平与ms组相当(p>0.05)(图8)。

2、免疫小鼠h37ra感染后脾淋巴细胞因子分泌水平

同上方法分离小鼠脾淋巴细胞，抗原刺激并培养后，elisa法检测细胞培养上清中的细胞因子水平，结果显示，un组、ms免疫组和rms-δcnpb免疫组ifn-γ、il-2分泌水平均显著上升，rms-δcnpb免疫组ifn-γ、il-2分泌水平显著高于ms免疫组(p<0.01，p<0.05)；各组il-10分泌水平均显著上升，而rms-δcnpb免疫组il-10水平增高幅度显著低于un组和ms组(p<0.01，p<0.01)(图9)。

3、免疫小鼠h37ra感染后主要脏器荷菌数

感染6w后，无菌取脾、肺脏，加入5ml1640培养液，在200目筛网上充分研磨后，取100μl悬液倍比稀释后，计数脏器荷菌数。结果显示，ms免疫组和rms-δcnpb免疫组小鼠均可有效抵抗mtbh37ra的感染(p<0.01，p<0.001)，ms免疫组和rms-δcnpb免疫组间不存在差异(p>0.05)(图10)。

sequencelisting

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>一种敲除c-di-amp分解酶的重组耻垢分枝杆菌株及其应用

<160>2

<210>1

<211>456

<212>dna

<213>耻垢分枝杆菌（mycobacteriumsmegmatis）

<400>1

gatatcggccatcgagtacgagatcaaggatccgcgcctggcgggcgtgacgatcaccga60

cgcgaaggtgtccggggatctgcacgacgccacgctgtactacaccgtgctgggggcttc120

gctcgacgaggacccggattacgagggtgcggcagcggcgctggagaaggccaaaggtgt180

gctgcgcaccaaggtgggcgccgggaccggggtgaggttcaccccgaccctggcgttcgt240

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cgcggacgaggatctggcgagagttcgggagggcgccaagcacgcaggcgatcccgaccc360

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<213>耻垢分枝杆菌（mycobacteriumsmegmatis）

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