本发明涉及生物
技术领域：
，具体而言，涉及检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池及其应用。
背景技术：
：结核病是主要经呼吸道传播的、严重危害我国和全世界的重要传染病之一。据世界卫生组织，全世界有17-20亿的结核分枝杆菌感染者，每年至少200万人死于本病(谢建平，结核分枝杆菌功能基因组研究的方法学，微生物通报.2001.28(5):92-97)。因此，准确筛检感染者的方法在结核病的防治甚至最终的消灭中扮演极其重要的作用。现有的诊断技术对结核分枝杆菌感染者的诊断非常难。近几十年来，临床上采用结核菌素试验(tst)来诊断结核分枝杆菌感染者。但tst活性成份是纯蛋白衍生物(purifiedproteinderivativeoftubercμlin，ppd)，是结核分枝杆菌培养上清液的粗提物，含有200多种成分，与卡介苗(bacilluscalmette-guerin，bcg)接种和环境分枝杆菌感染存在交叉反应。tst检测结果可被现在临床广泛使用的疫苗—卡介苗免疫所干扰[p.andersen，etal.lancet356(2000)1099-1104.]。从1921年及明卡介苗到现在为止，全世界已有35亿人接种卡介苗。因此tst对感染者的诊断价值受到很大的影响，导致tst诊断的准确性较低，因此我们无法根据其结果判断是否真正存在结核分枝杆菌感染。对结核病病人的诊断技术中，痰涂片抗酸染色或痰菌培养，培养困难，耗时较长；肺部x射线检查肺部病理改变，也仅在具有典型的临床症状后才能诊断；其他血清学诊断方法和分子诊断方法缺乏特异性，假阳性率较高。有关研究人员指出，不同诊断性检查方法的敏感性和特异性如下：分枝杆菌培养(分别为73％和100％)；pcr(分别为42％和100％)；胸部x线(分别为67％～77％和66％～76％)；结核菌素试验(分别为94％和20％)；血清学(分别为33％和87％)。由此可见，现有的分枝杆菌检测方法的敏感性和特异性无法同时达到最优。结核分枝杆菌感染人体后，首先会被人体的免疫系统识别，激活机体的t细胞免疫应答，分泌产生γ干扰素(ifn-γ)，后者发挥抗结核感染作用。部分t细胞转化为免疫记忆细胞，当再次与结核分枝杆菌相遇后，会再次分泌产生ifn-γ，发挥抗结核感染作用。抗原特异的刺激产生ifn-γ及其产生量与机体是否感染或发病密切相关。因此，如果采用结核分枝杆菌特异的抗原在体外刺激感染者和患者的t细胞，可诱导这些t细胞产生高水平的结核分枝杆菌特异的ifn-γ，而非结核分枝杆菌感染者或非结核病患者产生的ifn-γ的量与未用抗原刺激产生的量相近，从而实现诊断的目的。由此可见，寻找并发现结核分枝杆菌特异性抗原，对发展新一代的诊断试剂具有重要价值和意义。1996年，stover等通过减数杂交的方法确定了bcg在体外传代过程中丢失的域，定义为缺失区(regionofdifference，rd)，rd区域存在于结核分枝杆菌中，而在bcg和大多数环境分枝杆菌中缺失[程渝,李茂全.结核分枝杆菌的实验室诊断进展.国外医学临床生物化学和检验学分册.2002；23(6)：342-343.]。其中，rd1区域编码的早期分抗原靶6kd(earlysecretingantigentarget6kd，esat-6)和培养滤液蛋白10kd(cμltufiltrateprotein10kd，cfp-10)是两种小分子量分泌蛋白，它们是t细胞最主要的抗原之一，可以诱导较强的细胞免疫反应。对于儿童或者免疫低下样本，有文献报道，仅以esat-6和cfp-10或其多肽作为刺激原，其灵敏度约为73.5％-88.9％(孙琳，elispot检测技术在儿童结核病诊断中的应用，标记免疫分析与临床.2008.6:349-353；钟华清，干扰素-γ释放试验在儿童结核感染中的应用价值，检验医学.2016.3:176-179；李海，应用酶联免疫斑点法快速诊断儿童结核分枝杆菌感染的研究，中国妇幼保健，2012.11:1703-1706)。对于一些特殊样本，如儿童、免疫低下及新近感染样本，esat-6和cfp-10多肽及衍生物试剂盒结核分枝杆菌样本检出依然不高，出现假阴性，不能满足临床需求。技术实现要素：针对现有检测方法对于一些特殊样本，如儿童、免疫低下及新近感染结核分枝杆菌样本的检出率不足，本发明的目的在于提供一种检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池，该特异性抗原多肽池特异性刺激结核分枝杆菌感染的新鲜全血，能特异性的分泌ifn-γ，增加检测灵敏度。一种检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池，该抗原多肽池包括含有氨基酸序列如seqidno.1～seqidno.26中所示的任八条多肽或任八条以上多肽的组合。如上所述的抗原多肽池，优选地，所述多肽是人工合成的或是天然分离的。如上所述的抗原多肽池，优选地，所述抗原多肽池还包括esat-6和cfp-10。优选地，所述esat-6的氨基酸序列如seqidno.27所示，所述cfp-10的氨基酸序列如seqidno.28所示。如上所述的抗原多肽池，优选地，所述抗原多肽池还包括esat-6-cfp-10。优选地，所述esat-6-cfp-10的氨基酸序列如seqidno.29所示。如上所述的抗原多肽池，优选地，该抗原多肽池包括与所述seqidno.1～seqidno.26中任一所示序列具有85％同源性的多肽。一种检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，该试剂盒包括如上所述的抗原多肽池。一种检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，优选地，该试剂盒还包括ifn-γ的检测试剂。如上所述的检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池的应用，采用所述抗原多肽池作为刺激剂刺激全血，检测产生的ifn-γ。采用本发明提供的抗原多肽池与ifn-γ的特异性抗原蛋白(esat6-cfp10，esat6和cfp10)，用于检测结核分枝杆菌感染后的全血样本，具有以下特点：(1)免疫低下样本阳性检出率高，灵敏度高。针对现有检测方法对于一些特殊样本，如儿童、免疫低下及新近感染样本或潜伏感染者的检出不足，本发明提供用于敏感性和特异性高的结核分枝杆菌感染的抗原多肽池，该多肽池合并esat-6和cfp-10可实现对结核病病人或早期感染者或潜伏感染者(未出现结核病病症)的快速、特异的检测，在阻断结核病的传播和流行，以及对结核病的控制具有重大意义。(2)检测用时短，操作方便，诊断快速。与传统结核分枝杆菌检测相比，利用本发明提供的多肽池合并ifn-γ的特异性抗原蛋白检测用时短，诊断快速。传统结核分枝杆菌培养诊断需时间1-2月，tst检测需要3天，本发明全部检测时间在1-2天内可完成。(3)对感染结核分枝杆菌能进行早期检测。由于结核分枝杆菌一旦感染人体，首先就被机体的免疫系统所识别，激活体液和细胞免疫应答，发病时间在感染后1-2个月，因此，利用本发明提供的多肽池合并全血ifn-γ的特异性抗原蛋白的细胞免疫学检测方法即可快速做出诊断，诊断出样本是否感染结核分枝杆菌。而现有的技术中，x光片诊断只有在感染者肺部出现明显的病理改变后才可做出诊断，这通常需要很长的时间。抗原抗体检测也只有在疾病症状处于活动期的情况下检测，但环境中分枝杆菌广泛存在，其与结核分枝杆菌的共同抗原，可干扰实验的诊断结果。可见，本发明对结核分枝杆菌新近感染或免疫低下者的早期检测有重要意义，对结核病的控制和消灭具有积极的意义。本发明还提供了一种新的可用于结核分枝杆菌感染检测的检测试剂，实验证明，本发明可直接利用外周血进行抗原刺激，无需分离外周血单个核细胞，实验数据显示用于结核分枝杆菌感染检测具有较高的灵敏度和特异性，有效避免假阴性，且操作简便，成本较低，具有较高的临床应用价值。具体实施方式为了实现本发明的目的，发明人根据计算机软件进行多肽预测，综合优选合适的多肽，通过大量试验研究验证，最终获得氨基酸序列如seqidno.1～seqidno.26所示的多肽，其中这些多肽的筛选研究是通过如下技术手段确定：1、单多肽刺激有效性筛选：将初步筛得的多肽配制成一定浓度的多肽溶液，刺激新鲜全血，用γ干扰素检测试剂盒检测其是否感染结核分枝杆菌，选择对阳性样本有刺激效果，且对阴性样本无非特异性刺激的多肽。2、多肽组合刺激效果：将筛选到有效的多肽随机8-20个配制成混合多肽溶液，刺激新鲜全血，37℃孵育20±4小时，离心收集上清，将上清加入人ifn-γ检测试剂盒(酶联免疫法)中进行检测，选择对阳性样本有刺激效果，且对阴性样本无非特异性刺激的混合多肽，确定能组合有效的混合多肽序列。3、合并esat-6和cfp-10刺激效果：将筛选的有效混合多肽溶液合并esat-6和cfp-10配制成刺激剂溶液，刺激新鲜全血，37℃孵育20±4小时，离心收集上清，将上清加入人ifn-γ检测试剂盒(酶联免疫法)中进行检测，选择对阳性样本有刺激效果，且对阴性样本无非特异性刺激的混合多肽，确定能组合有效的混合多肽序列。4、合并esat-6-cfp-10刺激效果：将筛选的有效混合多肽溶液合并esat-6-cfp-10配制成刺激剂溶液，刺激新鲜全血，37℃孵育20±4小时，离心收集上清，将上清加入人ifn-γ检测试剂盒(酶联免疫法)中进行检测，选择对阳性样本有刺激效果，且对阴性样本无非特异性刺激的混合多肽，确定能组合有效的混合多肽序列。本发明中筛选的多肽经验证均能特异性刺激结核分枝杆菌感染的病人新鲜全血特异性的分泌ifn-γ，具体为致病结核分枝杆菌的特异性蛋白质：ag85b(seqidno.1～seqidno.6)、mpt649(seqidno.7～seqidno.10)、rv1985c(seqidno.11～seqidno.16)、rv1989c(seqidno.17～seqidno.21)、rv3425(seqidno.22～seqidno.26)，筛选的这些蛋白质能针对cd8+淋巴细胞的结合位点的多肽，通过反复的临床验证实验，这些多肽合并esat-6和cfp-10能提高检测灵敏度，该合并刺激剂可特异性作用于结核分枝杆菌感染样本的全血中的淋巴细胞表位，通过检测全血中释放的细胞因子ifn-γ，从而间接地反应机体是否感染过结核分枝杆菌。该方法提高结核分枝杆菌感染样本的检出率，特别是新近感染样本、儿童、免疫低下感染结核分枝杆菌样本的检出灵敏度，有效避免现有检测技术中易出现的漏检、错检问题。以下结合实施例对本发明作进一步说明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。下列实施例中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；所用试剂如无特别说明均为市售购买产品。实施例1单个多肽刺激有效性筛选本发明的多肽序列，其氨基酸序列如seqidno.1～seqidno.26所示，这些可通过人工合成的或是天然分离，本实施例及以下实施例中用的多肽是通过人工合成的。seqidno.1：rlwvycgngtpnelseqidno.2：lmigtaaavvlpglseqidno.3：vqfqsggnnspavyseqidno.4：mpvggqssfysdwyseqidno.5：saaiglsmagssamseqidno.6：pafewyyqsglsivseqidno.7：yqsaipprgtqavvseqidno.8：iqmsdpayninislseqidno.9：kslenyiaqtrdkfseqidno.10：mlvtavvllccsgvseqidno.11：rkafrraitrpthfseqidno.12：mvdpqldgpqlaalseqidno.13：kldspiiaritdtvseqidno.14：rlaaqtallesealseqidno.15：itiavnadsmatwfseqidno.16：rekpcrattagiplseqidno.17：llfpaiyladsaqaseqidno.18：avldlttpqareavseqidno.19：kmleaayrlhtidvseqidno.20：tayeqrtrpgqlqlseqidno.21：grwnppllfpaiylseqidno.22：relaysvettaeslseqidno.23：vswtrsalsdlprwseqidno.24：lsdlprwreppqiyseqidno.25：slffasgqlrelayseqidno.26：alsdlprwreppqi将制备的多肽用无菌低内毒素(内毒素应小于2.5eu/μg)pbs溶解到浓度为250μg/ml。取10例临床确诊结核症状人群的新鲜血样，10例无结核症状健康人群的新鲜血样，(下同)，用已市售的γ干扰素检测试剂盒(武汉海吉力生物科技有限公司)检测其是否感染结核分枝杆菌。同时取多肽溶液20μl于无菌培养管中(多肽的终浓度为100μg/ml)，每管加入1ml新鲜采集全血，混合均匀后于37℃烘箱20±4小时，混合血液后，6000rpm离心1min，取上清检测γ干扰素含量。结果表明，本发明所设计的如seqidno.1～seqidno.26所示的多肽对阳性样本有刺激效果，且对阴性样本均无非特异性刺激。需要说明的是，与seqidno.1～seqidno.26中任一多肽具有85％同源性的多肽也可实现上述目的。实施例2合并刺激效果将任取8条多肽溶液合并esat-6和cfp-10配制成刺激剂溶液，其中，esat-6和cfp-10由大肠杆菌基因工程菌重组表达获得，esat-6序列为seqidno.27：mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqkwdatatelnnalqnlartiseagqamastegnvtgmfa；cfp-10序列为seqidno.28：maemktdaatlaqeagnferisgdlktqidqvestagslqgqwrgaagtaaqaavvrfqeaankqkqeldeistnirqagvqysradeeqqqalssqmgf。本实施例中仅列举部分多肽的实验结果，编号为刺激剂1～刺激剂4(刺激剂1：seqidno.1～seqidno.8+esat-6+cfp-10；刺激剂2：seqidno.6～seqidno.13+esat-6+cfp-10；刺激剂3：seqidno.11～seqidno.18+esat-6+cfp-10；刺激剂4：seqidno.19～seqidno.26+esat-6+cfp-10)，取结核分枝杆菌感染的阳性和未感染的阴性样本进行试验。取同实施例1中的20例全血样本，用γ干扰素检测试剂盒检测其是否感染结核分枝杆菌。同时取刺激剂1～刺激剂4各20μl于无菌培养管中(各多肽的终浓度为100μg/ml)，每管加入1ml新鲜采集全血，混合均匀后于37℃烘箱20±4小时，混合血液后，6000rpm离心1min，取上清用γ干扰素检测试剂盒检测,检测方法及试剂同实施例1，检测结果见表1，其中，市售试剂盒为武汉海吉力生物科技有限公司的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法),下同。表1.混合多肽合并esat-6和cfp-10刺激结果统计市售试剂盒刺激剂1刺激剂2刺激剂3刺激剂410阳性样本检出例数89910910阴性样本检出例数1010101010结果说明本发明制备的多肽池结合esat-6和cfp-10用于检测结核分枝杆菌感染的全血，提高了检测灵敏度，有效避免现有技术检测的假阴性和漏检。实施例3合并刺激效果将任取8条多肽溶液合并esat-6-cfp-10配制成刺激剂溶液，其中，esat-6-cfp-10由大肠杆菌基因工程菌重组表达获得，esat-6-cfp-10序列为seqidno.29：mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqkwdatatelnnalqnlartiseagqamastegnvtgmfanvamaemktdaatlaqeagnferisgdlktqidqvestagslqgqwrgaagtaaqaavvrfqeaankqkqeldeistnirqagvqysradeeqqqalssqmgf，编号为刺激剂5～刺激剂8(刺激剂5：seqidno.1～seqidno.8+esat-6-cfp-10；刺激剂6：seqidno.6～seqidno.13+esat-6-cfp-10；刺激剂7：seqidno.11～seqidno.18+esat-6-cfp-10；刺激剂8：seqidno.19～seqidno.26+esat-6-cfp-10)，取结核分枝杆菌阳性和阴性样本进行试验，配制成刺激剂溶液，取同实施例1中的20例全血样本，用γ干扰素检测试剂盒检测其是否感染结核分枝杆菌。同时取刺激剂5～刺激剂8各20μl于无菌培养管中(各多肽的终浓度为100μg/ml)，每管加入1ml新鲜采集全血，混合均匀后于37℃烘箱20±4小时，混合血液后，6000rpm离心1min，取上清用γ干扰素检测试剂盒检测。检测方法同实施例2，检测结果见表2。表2.混合多肽合并esat-6-cfp-10刺激结果市售试剂盒刺激剂5刺激剂6刺激剂7刺激剂810阳性样本检出例数899101010阴性样本检出例数1010101010结果说明本发明制备的多肽池结合esat-6-cfp-10用于检测结核分枝杆菌感染的全血，提高了检测灵敏度，有效避免现有技术检测的假阴性和漏检。实施例4合并混合多肽检测灵敏度和特异性样本：取20例临床确诊结核症状人群的新鲜血样，20例无结核症状健康人群的新鲜血样。采集上述样本的全血样本，分别用刺激剂9(esat-6(10μg/ml)和cfp-10(10μg/ml)+混合多肽(seqidno.6～seqidno.13，各100μg/ml))、刺激剂10(esat-6-cfp-10(10μg/ml)+混合多肽(seqidno.6～seqidno.13，各100μg/ml))、刺激剂11(esat-6(10μg/ml)和cfp-10(10μg/ml))、刺激剂12(esat-6-cfp-10(10μg/ml))和刺激剂13(市售试剂盒：武汉海吉力生物科技有限公司的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)各20μl于无菌培养管中，每管加入1ml新鲜采集全血刺激，混合均匀后于37℃烘箱20±4小时，混合血液后，6000rpm离心1min，取上清用γ干扰素检测试剂盒检测。结果见表3。表3.合并混合多肽灵敏度和特异性检测结果统计结果说明本发明制备的多肽池结合esat-6和cfp-10或esat-6-cfp-10用于检测结核分枝杆菌感染的全血，其检测灵敏度可达95％，灵敏度和特异性较强，有效避免现有技术检测的假阴性和漏检。实施例5本发明的灵敏度和特异性检测样本：取100例临床确诊结核症状人群的新鲜血样，其中65岁年龄及以上样本21例，6岁以下年龄样本数18例，hiv样本51例，男56例，女44例；50例无结核症状健康人群的新鲜血样，其中65岁年龄及以上样本20例，6岁以下年龄样本数7例，hiv样本23例，男26例，女24例。采集上述样本的全血样本，分别用刺激剂(esat-6(10μg/ml)和cfp-10(10μg/ml)+混合多肽(seqidno.11～seqidno.18，各100μg/ml))和市售试剂盒(武汉海吉力生物科技有限公司的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法))刺激剂各20μl于无菌培养管中，每管加入1ml新鲜采集全血刺激，混合均匀后于37℃烘箱20±4小时，混合血液后，6000rpm离心1min，取上清用市售的γ干扰素检测试剂盒检测进行检测，市售试剂盒按其说明书进行操作。检测结果见表4和表5。表4.结核分枝杆菌感染样本的酶联免疫法检测结果统计表5.健康样本的酶联免疫法检测结果统计结果说明本发明制备的多肽池结合esat-6和cfp-10及其衍生物可提高对一些特殊样本，如儿童、免疫低下及新近感染样本检出率，灵敏度和特异性较强，有效避免现有技术检测的假阴性和漏检。本发明对结核分枝杆菌新近感染或免疫低下者的早期检测有重要意义，对结核病的控制和消灭具有积极的意义。sequencelisting<110>武汉海吉力生物科技有限公司<120>检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池及其应用<130><160>29<170>patentinversion3.5<210>1<211>14<212>prt<213>人工合成<400>1argleutrpvaltyrcysglyasnglythrproasngluleu1510<210>2<211>14<212>prt<213>人工合成<400>2leumetileglythralaalaalavalvalleuproglyleu1510<210>3<211>14<212>prt<213>人工合成<400>3valglnpheglnserglyglyasnasnserproalavaltyr1510<210>4<211>14<212>prt<213>人工合成<400>4metprovalglyglyglnserserphetyrserasptrptyr1510<210>5<211>14<212>prt<213>人工合成<400>5seralaalaileglyleusermetalaglyserseralamet1510<210>6<211>14<212>prt<213>人工合成<400>6proalapheglutrptyrtyrglnserglyleuserileval1510<210>7<211>14<212>prt<213>人工合成<400>7tyrglnseralaileproproargglythrglnalavalval1510<210>8<211>14<212>prt<213>人工合成<400>8ileglnmetseraspproalatyrasnileasnileserleu1510<210>9<211>14<212>prt<213>人工合成<400>9lysserleugluasntyrilealaglnthrargasplysphe1510<210>10<211>14<212>prt<213>人工合成<400>10metleuvalthralavalvalleuleucyscysserglyval1510<210>11<211>14<212>prt<213>人工合成<400>11arglysalapheargargalailethrargprothrhisphe1510<210>12<211>14<212>prt<213>人工合成<400>12metvalaspproglnleuaspglyproglnleualaalaleu1510<210>13<211>14<212>prt<213>人工合成<400>13lysleuaspserproileilealaargilethraspthrval1510<210>14<211>14<212>prt<213>人工合成<400>14argleualaalaglnthralaleuleugluserglualaleu1510<210>15<211>14<212>prt<213>人工合成<400>15ilethrilealavalasnalaaspsermetalathrtrpphe1510<210>16<211>14<212>prt<213>人工合成<400>16argglulysprocysargalathrthralaglyileproleu1510<210>17<211>14<212>prt<213>人工合成<400>17leuleupheproalailetyrleualaaspseralaglnala1510<210>18<211>14<212>prt<213>人工合成<400>18alavalleuaspleuthrthrproglnalaargglualaval1510<210>19<211>14<212>prt<213>人工合成<400>19lysmetleuglualaalatyrargleuhisthrileaspval1510<210>20<211>14<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