一种用于检测麦角菌的试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测麦角菌的试剂盒，其包括引物、Bst DNA聚合酶、反应缓冲液和核酸染料。本发明还提供了一种检测麦角菌的LAMP方法。使用本发明的LAMP试剂盒或方法能够快速、准确地对麦角菌进行鉴定和检测，具有高特异性、耗时短、灵敏度高、鉴定简便等优点，适于实验室或田间检验使用。
【专利说明】
一种用于检测麦角菌的试剂盒及检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种用于检测麦角菌的试剂 盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]麦角菌(Claviceps purpurea)属麦角菌科、麦角菌属，是一类主要以禾本科杂草 和粮谷类植物为寄生宿主的真菌。其寄生于宿主的子房内，受侵染的子房不形成种子而是 形成坚硬的菌核。菌核结构比较致密，并且外面包有一层角状外壳，由此得名"麦角" (Ergots)(Alderman, 1999)。麦角菌在高湿度、高水分条件下生长旺盛，容易感染植株。大部 分麦角病菌的麦角是其宿主植物种子的1-4倍。由麦角病菌及其菌核所导致宿主植物所发 生的病一般称为"麦角病"（Ergot diseases)。麦角病是麦类和禾本科植物牧草的重要病 害，不但使麦类大幅度减产，而且麦角中的生物碱对人、畜有毒，历史上因误食含麦角的谷 物而引起中毒事件时有发生，如牲畜误食带麦角的饲草中毒死亡，人摄入过多含麦角的谷 物食品也会发生流产甚至死亡现象。因此，需要开发适于田间或实验室对麦角菌进行快速 检测的试剂盒或方法。
[0003] 目前分子生物学检测以其快速、灵敏的特点，在微生物检测领域逐渐取代传统的 形态学鉴定，成为热门研究方向。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)是日本学者Notomi于2000年建立的一种新型的核酸扩增技 术。该技术针对靶基因 6个区域设计4条引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶在恒温条件 下快速、高特异性地扩增靶基因，产物是两端带有茎环结构的哑铃状DNA分子。与实验室常 规检测的PCR方法相比，LAMP技术具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优势，在食品、动植 物检验检疫中被广泛应用于各种病原检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于检测麦角菌的LAMP试剂盒及LAMP方法。
[0005] 为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供一种用于检测麦角菌的LAMP 试剂盒，其包括引物、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物如下所示：
[0006] 外引物F3:CGGACACTCAAGATCGACC(SEQ ID N0:1)
[0007] 外引物B3:CGATATCGGGCCTTGTGAAT(SEQ ID NO:2)
[0008] 内引物FIP:TGGGGTTCGTTTCGGCTTGAA-GACAAGCGTGCTTGACCAAT(SEQ ID N0:3)
[0009] 内引物BIP:GAGAATCTGAGGCCGGCTACTG-TCCTTCCTATGCCCTGCT(SEQ ID N0:4)。
[0010] 优选地，所述反应缓冲液由2mM dNTP、10XThermoPol反应缓冲液、0.6mM甜菜碱和 6mM Mg2+组成。
[0011] 优选地，所述核酸染料为1000XSYBR Green I。
[0012] 优选地，本发明的试剂盒进一步包括DNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。
[0013] 优选地，所述DNA提取试剂例如CTAB抽提缓冲液。
[0014] 在另一个方面中，本发明提供了引物在制备用于检测麦角菌的LAMP试剂盒中的应 用。所述引物如序列SEQ ID N0s:l-4所示。
[0015] 在又一个方面中，本发明还提供了一种检测麦角菌的LAMP方法，其中使用本发明 的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
[0016] (1)向待测样品中加入CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取DNA;
[0017] (2)在PCR管中制备LAMP反应体系，包括0.2μπιο1/μ1的外引物F3 1μ1、0.2μπιο1/μ1 的外引物Β3 1μ1、1.2μL?〇1/μ1的内引物FIP 1μ1、1.2μL?〇1/μ1的内引物ΒΙΡ ΙμL、反应缓冲液 2.5μ1、8υ/μ1的Bst DNA聚合酶ΙμL、模板DNA 2μ1，加水补充至25μ1，并以麦角菌基因组DNA 作为阳性对照，以lOOmM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；
[0018] (3)将步骤(2)中的PCR管于63°C恒温反应60min;
[0019] (4)分析判断反应产物结果：在（3)中所得反应产物中加入ΙμL核酸染料SYBR Green I，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，食品中不含麦角菌，如反应液颜色为绿 色，表示结果为阳性。
[0020] 本发明的发明人针对麦角菌序列的6个区域设计出4条引物，灵敏度高、特异性好。 本发明用于检测麦角菌的LAMP试剂盒及方法能够准确鉴定食品、谷物、田间的麦角菌，假阳 性率低、快速、高效，且通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤， 成本低、操作简单、鉴定简便，适于基础实验室和现场检测，值得推广应用。
【具体实施方式】
[0021] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本领域技术人员应当 领会的是，可以在不偏离本发明精神的情况下进行多种修改，这些修改将包含在本发明的 范围内。
[0022] 实施例1本发明的试剂盒的制备
[0023] 1.1试剂
[0024]引物由天根生化科技(北京)有限公司合成;Bst DNA聚合酶和lOXThermoPol反应 缓冲液购自Takara; SYBR Green I购自Invitrogen;其余PCR试剂和配制CTAB抽提缓冲液所 需的试剂购自Sigma。
[0025] 1.2试剂盒的制备：
[0026] 获得以下试剂，以制备本发明的试剂盒：
[0027] CTAB抽提缓冲液：按照以下配方配制：100mM Tris-HCl pH 8.0、50mM EDTA、1M NaCl、1 % (v/v) β-巯基乙醇、2 % CTAB，调整pH值至7 · 2;
[0028] 反应缓冲液:按照以下配方配制：2mM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、0.6mM甜 菜喊、6mM MgSCU;
[0029] 引物：外引物F3,其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；外引物B3,其核苷酸序列如 SEQIDN0:2所示；内引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDN0:3所示，内引物BIP，其核苷酸序 列如SEQ ID N0:4所示。其中外引物F3和B3的浓度为0.2μπιο1/μ1，内引物FIP和BIP的浓度为 1 ·2μηιο1/μ1〇
[0030] 浓度为8υ/μ1的Bst DNA聚合酶；
[0031] 核酸染料：1000 X SYBR Green I;
[0032] 阳性对照:麦角菌基因组DNA;
[0033] 阴性对照：100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA。
[0034] 实施例2麦角菌特异性检测
[0035] 2 · 1LAMP特异性检测
[0036] 2.1.1待测植株
[0037] 待测植株包括来自河北省农林科学院的麦角病植株8株(包括黑麦3株、大麦5株）、 炭疽病黄瓜2株、白粉病豌豆2株以及健康的大麦2株。麦角病植株穗上均可见麦角形成。 [0038] 2.1.2样品预处理：
[0039]将麦角病植株从茎基部剪断，将上部用无菌水冲洗后，用消毒剪刀将其剪成小段， 置于PDA培养基上，25度恒温培养，直至形成菌落。
[0040]用接种环刮取白粉病豌豆植株叶片上的白色霉层，接种于PDA平板上，划线培养。 用消毒剪刀剪下炭疽病黄瓜叶片适量，在PDA培养基上分离培养炭疽病菌。
[0041 ]挑取上述病菌菌落的菌丝少量，在光学显微镜下观察其形态学特征。观察显示，培 养所得菌落均符合相应病菌的菌落特征。
[0042] 2.1.3LAMP 检测
[0043] 使用实施例1制备的试剂盒按照以下步骤进行检测：
[0044] (1)收集PDA平板上的菌落并离心，加入CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取 DNA；
[0045] (2)在PCR管中制备LAMP反应体系，其中四种引物各ΙμL、反应缓冲液2.5μ1、8υ/μ1 的Bst DNA聚合酶ΙμL、步骤（1)所得模板DNA 2μ1，加水补充至25μ1，并以麦角菌基因组DNA 作为阳性对照，以lOOmM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；
[0046] (3)将步骤(2)中PCR管置于63°C恒温反应60min;
[0047] (4)分析判断反应产物结果:在(3)中所得反应产物中加入ΙμL 1000 XSYBR Green I，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
[0048] 2.2检测结果
[0049] 8株麦角病植株以及阳性对照的PCR管中均呈现绿色，而豌豆、黄瓜、健康大麦以及 阴性对照的显色结果均为橙色，表明引物能够准确地鉴定出携带麦角菌的病害植株，具有 很强的特异性。
[0050] 实施例3麦角菌灵敏度检测
[0051 ] 3 · 1LAMP灵敏度检测
[0052]按照实施例2的步骤(1)提取麦角菌DNA，紫外分光光度计测量其0D值，并以10倍浓 度系列稀释法稀释成l〇ng、lng、lOOpg、10pg、lpg、lOOfg共6个梯度。
[0053] LAMP反应体系和反应条件以及结果分析同实施例2第2.1.3节的步骤(2)-(4)。
[0054] 3.2检测结果
[0055] 麦角菌DNA浓度为10ng、lng、100pg、10pg、lpg的PCR管中均呈现绿色，表明本发明 的检测方法的最低检测极限达到lpg DNA，灵敏度很高。
【主权项】
1. 一种用于检测麦角菌的LAMP试剂盒，其特征在于，可以包括特异性引物组、反应缓冲 液、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物如下所示： 外引物F3:CGGACACTCAAGATCGACC(SEQ ID N0:1) 外引物B3:CGATATCGGGCCTTGTGAAT(SEQ ID NO:2) 内引物FIP: TGGGGTTCGITTCGGCTTGAA-GACAAGCGTGCTTGACCAAT(SEQ ID NO: 3) 内引物BIP: GAGAATCTGAGGCCGGCTACTG-TCCTTCCTATGCCCTGCT(SEQ ID NO: 4)。2. 根据权利要求1所述的用于检测麦角菌的LAMP试剂盒，其中所述反应缓冲液由2mM dNTP、10 X ThermoPo 1反应缓冲液、0 · 6mM甜菜碱和6mM Mg2+组成。3. 根据权利要求1或2所述的用于检测麦角菌的LAMP试剂盒，其进一步包括DNA提取试 剂以及阳性对照和阴性对照。4. 根据权利要求3所述的用于检测麦角菌的LAMP试剂盒，其中所述DNA提取试剂是CTAB 抽提缓冲液。5. -种检测麦角菌的LAMP方法，所述方法用于对食品中的麦角菌进行鉴定，其包括以 下步骤： (1) 向待测样品中加入CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取DNA; (2) 在PCR管中制备LAMP反应体系，其包括O . 2μπιο 1 /μ 1的外引物F3 1μ I、0.2μπιο 1 /μ 1的 外引物Β3 1μ1、1.2μL?〇1/μ1的内引物FIP 1μ1、1.2μL?〇1/μ1的内引物BIP ΙμL、反应缓冲液 2.5μ1、8υ/μ1的Bst DNA聚合酶ΙμL、模板DNA 2μ1，加水补充至25μ1，并以麦角菌基因组DNA 作为阳性对照，以IOOmM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照， 其中所述引物如下所示： 外引物F3:CGGACACTCAAGATCGACC(SEQ ID N0:1) 外引物B3:CGATATCGGGCCTTGTGAAT(SEQ ID NO:2) 内引物FIP: TGGGGTTCGITTCGGCTTGAA-GACAAGCGTGCTTGACCAAT(SEQ ID NO: 3) 内引物BIP:GAGAATCTGAGGCCGGCTACTG-TCCTTCCTATGCCCTGCT(SEQ ID NO: 4); (3) 将步骤(2)中的PCR管于63 °C恒温反应60min; (4) 分析判断反应产物结果:在(3)中所得反应产物中加入ΙμL核酸染料SYBR Green I， 如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，食品中不含麦角菌，如反应液颜色为绿色，表示结 果为阳性。
【文档编号】C12Q1/68GK105886619SQ201610268387
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】张梅
【申请人】张梅