幽门螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒及耐药性检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于检测分析幽口螺杆菌抗生素耐药性的试剂盒W及耐药性检 测方法，尤其设及一种基于多重基因分析系统的幽口螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒及检 测方法。
【背景技术】
[0002] 幽口螺杆菌化elicobacterPylo;ri，H.wlori)生存于人体胃部，是最常见的细菌 病原体之一，世界有多半人口受到过幽口螺杆菌的感染。幽口螺杆菌感染可能引起慢性胃 炎、消化性溃瘍，严重者则发展为胃癌、胃黏膜相关性淋己组织淋己瘤。
[0003] 随着抗生素的广泛使用，幽口螺杆菌耐药菌株也在日益增多，幽口螺杆菌对抗生 素产生耐药已经成为其根除率下降的最主要原因，运不但给临床治疗带来困难，也增加了 患者的经济负担，导致医疗资源极大浪费。
[0004] 耐药性检测是实施个体化治疗的前提，可W避免重复使用已经产生耐药性的抗生 素、并根据药敏实验选择有效抗生素。
[0005] 目前，已有多种检测幽口螺杆菌抗生素耐药性的方法，传统方法检测幽口螺杆菌 抗生素耐药性主要局限于药敏试验，但E-test耗材昂贵，纸片扩散法缺乏有效的判断标 准，琼脂稀释法对操作技术要求较高；而且药敏试验不能鉴定H.pylori菌株基因突变的位 点。另外，幽口螺杆菌对培养要求苛刻，微需氧条件下生长缓慢，不适合临床常规开展。如： ①分离培养鉴定：幽口螺杆菌培养成菌落后，经生化反应鉴定。由于幽口螺杆菌培养需要 微需氧条件，对营养条件要求苛刻，所W极易造成假阴性，其灵敏度仅有40%-70 %，检出 率低。且幽口螺杆菌培养需要一定时间，不利于快速诊断。②UBT:根据标志物不同可分为 "C-UBT和"C-UBT，临床应用广泛，技术要求低。缺点是费用高，易受抑酸剂和抑菌药物影 响，敏感度低。③免疫学检查：检测粪便中幽口螺杆菌的抗原或血清中幽口螺杆菌抗体。优 点是快速、无损伤，缺点是不能判断现症感染还是既往感染。④组织病理切片染色法：该法 是把患者胃镜检查活检组织切片，染色后观察组织中的幽口螺杆菌。优点是可同时进行胃 黏膜的病理学诊断，且特异性和敏感性均较高。但该方法受幽口螺杆菌载量影响明显，且操 作繁琐、费时，不适于大通量样本的检测。
[0006] 随着分子生物学技术的发展，PCR、巧光原位杂交、基因忍片、DNA测序等技术已被 用于幽口螺杆菌抗生素耐药性的检测，包括：普通PCR、寡核巧酸探针杂交、基因忍片、测序 等。但W上检查方法均存在检测位点少、特异性低，通量小等缺点，且不能同步进行耐药性 分析。
[0007] 目前检测幽口螺杆菌抗生素耐药的分子生物学技术还存在费用高、临床难普及等 缺点，因此，亟需开发一种快速、准确、便捷、经济的多重基因检测的方法，同步完成幽口螺 杆菌鉴定、多位点耐药性分析，从而探索一种新的基于耐药性分析的幽口螺杆菌检测及个 体化幽口螺杆菌根除模式，更好地指导临床合理应用抗生素，降低耐药菌株的出现，减少患 者经济负担。
【发明内容】
[000引针对目前幽口螺杆菌对抗生素耐药性检测方法存在的问题，本发明提供了一种基 于多基因的幽口螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒及耐药性检测方法。
[0009] 本发明第一个方面是提供一种幽口螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒，包括引物， 所述引物包括针对幽口螺杆菌抗生素耐药相关基因W及鉴定基因16SrRNA设计的引物。
[0010] 其中，所述幽口螺杆菌抗生素耐药相关基因选自：23SrRNA、gyrA、porD中的一种 或几种。
[0011] 在本发明的一种优选实施例中，所述引物包括针对幽口螺杆菌16SrRNA基因、W 及抗生素耐药相关基因23SrRNA、gyrA、porD设计的引物。
[001引在本发明的一种优选实施例中，在正向引物5'端连接正向通用Tag序列，反向引 物5'端连接反向通用Tag序列。
[001引其中，所述正向通用Tag序列为：5' -AGGTGACACTATAGAATA-3'。
[0014]其中，所述反向通用Tag序列为：5' -GTACGACTCACTATAGGGA-3'。
[0015] 在本发明的一种优选实施例中，针对每一抗生素耐药相关基因设计的引物包括至 少两条反向引物。
[0016] 其中，两条反向引物分别针对野生型基因和突变型基因设计。
[0017] 其中，所述突变优选为：
[001引23SrRNA基因2143位点碱基A发生突变，如突变后碱基为G;
[0019]porD基因347位点碱基C发生突变，如突变后为T、G、A中的任意一种；
[0020] gyrA基因261位点碱基C/T发生突变，如突变后为G/A。
[00引]其中，更优选地，针对23SrRNA基因设计的引物序列为：
[0022]沈QIDNo. 1 :5' -AACCGCGGCAAGACGGCA-3,；
[0023]沈QIDNo. 2 :5, -GATCTAACCGCGGCAAGACGGTG-3,；
[0024]沈QIDNo. 3 :5' -GGTATCTCAAGGATGGCTCC-3,。
[0025] 其中，更优选地，针对23SrRNA基因设计的引物序列连接Tag序列后为：
[0026] 5, -GTACGACTCACTATAGGGAAACCGCGGCAAGACGGCA-3,；
[0027] 5, -GTACGACTCACTATAGGGAGATCTAACCGCGGCAAGACGGTG-3,；
[0028] 5, -AGGTGACACTATAGAATAGGTATCTCAAGGATGGCTCC-3，。
[0029] 其中，更优选地，针对gyrA基因设计的引物序列为：
[0030]沈QIDNo. 4 :5' -AGACACTAGCGCATCATAAACCGAR-3,；
[0031]SEQIDNo. 5 :5, -CTAGCGCATCATAAACCGTY-3,；
[0032]沈QIDNo. 6 :5, -TAGAAGTGGGGATTGATTCT-3,。
[0033] 其中，更优选地，针对gyrA基因设计的引物序列连接Tag序列后为：
[0034] 5' -GTACGACTCACTATAGGGAAGACACTAGCGCATCATAAACCGAR-3,；
[0035] 5' -GTACGACTCACTATAGGGACTAGCGCATCATAAACCGTY-3,；
[0036] 5' -AGGTGACACTATAGAATATAGAAGTGGGGATTGATTCT-3，。
[0037] 其中，更优选地，针对porD基因设计的引物序列为：
[0038]沈QIDNo. 7:5, -GAACAAATTGAGCCTGCYGC-3' ；
[0039]沈QIDNo. 8:5' -ACCAAGAACAAATTGAGCCTGCYCD-3';
[0040]沈QIDNo. 9 :5' -GCGTTGATGGGGTGATAGCA-3,。
[0041] 其中，更优选地，针对porD基因设计的引物序列连接Tag序列后为：
[0042] 5, -GTACGACTCACTATAGGGAGAACAAATTGAGCCTGCYGC-3,；
[0043] 5, -GTACGACTCACTATAGGGAACCAAGAACAAATTGAGCCTGCYCD-3,；
[0044] 5, -AGGTGACACTATAGAATAGCGTTGATGGGGTGATAGCA-3，。
[0045] 其中，更优选地，针对16SrRNA基因设计的引物序列为：
[0046]沈QIDNo. 10 :5, -CTGGAGAGACTAAGCCCTCC-3,；
[0047]沈QIDNo. 11 :5, -ATTACTGAAGCTGATTGCGC-3，。
[0048] 其中，更优选地，针对16SrRNA基因设计的引物序列连接Tag序列后为：
[0049] 5, -GTACGACTCACTATAGGGACTGGAGAGACTAAGCCCTCC-3,；
[0050] 5' -AGGTGACACTATAGAATAATTACTGAAGCTGATTGCGC-3，。
[0051] 在本发明的一种优选实施例中，所述试剂盒还可W包括如下试剂中的任意一种或 几种：缓冲液、DNA聚合酶、巧光标记物、dNTPs、DNA聚合酶激活剂。
[0052] 其中，所述DNA聚合酶可W是大肠杆菌DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、真核生物DNA聚 合酶中的任意一种或几种，并优选为化qDNA聚合酶。
[0053] 其中，所述DNA聚合酶激活剂优选为能够提供Mg2+的物质，如氯化儀。
[0054] 本发明第二个方面是提供一种幽口螺杆菌抗生素耐药性检测方法，包括：
[0055] 提取幽口螺杆菌核酸；
[0056] 采用本发明第一个方面所述试剂盒对所提取的核酸中的抗生素耐药相关基因进 行多重PCR扩增；
[0057] 毛细管电泳检测。
[0058] 其中，所述PCR扩增反应过程中，同时使用所述试剂盒中针对每一种抗生素耐药 基因设计的引物。
[0059] 其中，所述PCR扩增反应过程包括：
[0060] 105°C热盖预处理；
[0061] 95°C变性 2min;
[0062] 94°C变性30s，58°C退火30s，70°C延伸Imin ;该步骤进行33次循环；
[006引反应结束。
[0064] 本发明所述基于多基因的幽口螺杆菌抗生素耐药性检测方法，优选为非疾病诊断 和治疗为目的的方法。
[0065] 其中，所述基于多基因的幽口螺杆菌抗生素耐药性检测方法，可W应用于药物的 研发和/或筛选。
[0066] 本发明上下文内容中，所述耐药优选为对大环内醋类药物、和/或硝基巧喃类药 物、和/或哇诺酬类药物耐药。
[0067] 其中，所述大环内醋类药物优选为克拉霉素等。
[0068] 其中，所述硝基巧喃类药物优选为巧喃挫酬等。
[0069] 其中，所述哇诺酬类药物优选为左氧氣沙星等。
[0070]本发明上下文内容中，没有特别说明的情况下，核巧酸序列中R代表核巧酸A或G， Υ代表核巧酸c或Τ/υ，D代表核巧酸A或G或Τ/υ。
[0071] 本发明基于多重基因分析，各诊断基因独立分明，能够实现在同一个反应体系内 实现对幽口螺杆菌的快速鉴定及多种抗生素耐药性的分析，灵敏度可达到90%W上，准确 率也可W达到90 %，避免传统培养方法和药敏检测耗时长、阳性率低、费用高等缺点。
【附图说明】
[0072] 图1为采用本发明试剂盒和方法检测标准菌株ATCC26695的毛细管电泳图；
[0073]图2为采用本发明试剂盒和方法检测临床Η. pylori菌株的毛细管电泳图；
[0074] 图3为采用本发明试剂盒和方法检测另一种临床H.pylori菌株的毛细管电泳图。
【具体实施方式】
[00巧] L材料
[0076] 1. 1.研究对象
[0077]H.pylori标准菌株（ATCC26695)、两种分离的H.pylori临床菌株。
[0078] L 2.材料巧试剂
[0079] GoTaqDNA堤合峭 巧WPromega公-uj SampleLoadingSolution 巧邑eckmanCoulter公 DNAsi巧standard40日marker 巧ii;;lBeckmanCou帖r公d GenomeLabSeparationBuffer 关!i;l邑eckmanCoulter公-d 10ObpDNALa加er 人选Takara公-!ij 矿物她 美国BeckmanCoulter'公-iij 细菌基因组DNA抽提试剂盒 北京天根公司 100bpDNALadder 人连Taka巧公i'j 邑iowesiagarose 、;J.、i.邑iowesi公， 10mm细蘭培养皿