专利名称：无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒以及利用该试剂盒来无创伤一步地对胃幽门螺旋杆菌进行检测的方法。
背景技术：
从近年来对HP (胃幽门螺旋杆菌)感染的大量研究中提出了许多HP致胃癌的可能机制①细菌的代谢产物直接转化黏膜；②类同于病毒的致病机制，HP的DNA的某些片段转移入宿主细胞，引起转化；③HP引起炎症反应，其本身具有基因毒性作用。在这些机制中， 广泛认为第三个机制可能是引起疾病的最直接致病机制。临床上对于HP感染的患者，HP根除治疗是非常必要的。世界卫生组织/国际癌症研究机构(WH0/IARC)现已将幽门螺旋杆菌定为I类致癌原。因此临床上对于有HP感染的患上消化道疾病的患者常规HP根除治疗是非常必要的。流行病学研究表明幽门螺旋杆菌感染了世界一半以上的人口，其发病率在各个国家或地区不同，甚至同一个国家的各个地区也不尽相同。目前已知发病率的高低与社会经济水平、人口密集程度、公共卫生条件以及水源供应均有较密切的关系。也有报道指出，HP 感染有明显的季节性分布特征，以7 8月份为高峰。我国及大多数发展中国家人群HP感染因地区有所不同，低至20%，高达90%，人群中总感染率高于发达国家。因此早期诊断对 HP的临床诊断及指导临床治疗具有重要的意义。目前医院采用的实验室诊断方法有胃镜取活检标本检查、酶检查、尿素酶检查、 15N-尿素试验、免疫学检测、酶联免疫吸附试验、聚合酶链反应(PCR试验)等。但是，这些方法检测都一定程度上存在不足。胃镜取活检标本检查是指通过胃镜检查钳取胃黏膜(多为胃窦黏膜)作直接涂片、染色，组织切片染色及细菌培养来检测HP。其中胃黏膜细菌培养是诊断HP最可靠的方法，可作为验证其他诊断性试验的“金标准”，同时又能进行药敏试验，指导临床选用药物。 但本方法要进行胃镜检查，给患者带来痛苦，致使有些患者不能忍受而拒绝检查。另外有些患者不适合行胃镜检查，如心脏病患者、年老体弱者等。同时胃镜检查可能存在胃穿孔、胃出血甚至心跳骤停等并发症。15N-尿素试验是用15N标记的尿素供患者口服，然后收集池尿检出其15N—尿氨的排出率，以判断胃内HP感染程度，能反映胃内整体感染情况，可避免活检时由于感染灶分布不均而造成的偏差。这一试验具有13C02呼气试验同样的优点，它是无损伤性的，不需作胃镜，亦无放射性损伤；它的敏感性特异性高，是定量的，且是反映整个胃的感染情况，克服了活检标本采样有损伤性和分布不均的缺点，采样比呼气试验方便，测定的准确性较高， 缺点与13C—呼气试验相同，检测需用质谱仪，检测费用较高。由于15N—尿氨排出试验是一种尿素在胃内分解后，15N经吸收通过肾脏由尿排出的试验，因此有严重肝肾功能损害者不宜使用。酶联免疫吸附试验是采用酶标免疫分析法测定标本中IgG水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入HP抗原、生物素化的抗人HP IgG 抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的HP IgG呈正相关。 用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值)，计算样品浓度。试剂盒保存温度为_20°C，当频繁使用时，可放置在2-8°C，对保存温度要求苛刻，不充分的洗涤易造成假阳性，所以对操作人员要求高。操作时间约4. 5小时，时间较长，步骤繁琐。聚合酶链反应(PCR试验)是一种体外扩增特异性DNA片段的方法。PCR方法检测幽门螺旋杆菌的特异性较高，近年来随着分子生物学技术的迅速发展，特别是聚合酶链反应(PCR)技术的应用，能特异地检出活检组织中的HP，该技术是基于天然DNA复制的原理而设计的一种体外DNA扩增方法。该测定方法最大特点是特异性强和灵敏度高。目前应用 PCR检测HP的扩增物有以下两类①扩增HP尿素酶基因某个片段；②扩增HP16Sr RNA基因片段。随着PCR技术日臻完善，其应用前景为作为非侵入性方法，诊断HP感染；作为流行病学调查工具，确定细菌感染的来源及传播途径；研究HP遗传学特性，进行细菌致病因子基因的分裂、克隆，然后确定与HP毒素决定因子表达有关的基因，如尿素酶基因、细胞毒素基因和粘着素基因，有助于更深入地了解HP的致病机。但是，PCR试验在操作时，尤其要避免外界污染和残留污染，以免发生假阳性，并且被核酸污染的气溶胶较难清除。PCR试验的开展需要较高的实验条件，对实验人员和试验设备要求较高。综上所述，现有的用于幽门螺旋杆菌的检测方法大多需要昂贵的仪器设备，对标本的要求也比较高，需要进一步的提纯处理才能进行，也很少能适应高通量、现场的快速检测；对于侵入法的检测方法会给患者造成巨大的痛苦和一定的创伤，受到用户的普遍排斥； 同位素类的方法则需要换着直接接触放射性物质，对患有严重肝肾功能损害者不宜使用； 检测抗体的方法需要抽血分离血清进行检测，抽血也有一定的感染和传播疾病的风险，容易引起一些用户的排斥。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种便于观察检测结果、结构简单、测试迅速的无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒。本发明还提供了一种对患者无创伤的、测试快速的利用无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒对胃幽门螺旋杆菌进行检测的方法。本发明无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒所采用的技术方案是本发明包括盒体、样品垫、印迹膜、吸水垫，本发明还包括结合释放垫，所述结合释放垫的一端与所述样品垫相接触，另一端与所述印迹膜的一端相接触，所述吸水垫设置在所述印迹膜的另一端并与所述印迹膜保持接触，所述结合释放垫内包被有带HP抗体的标记物，在所述印迹膜上设置有测试线和质控线，在所述测试线内包被有特异性的HP抗体，在所述质控线内包被有羊抗鼠抗体。所述标记物为聚苯乙烯彩色微球。所述印迹膜为硝酸纤维膜。所述样品垫和所述结合释放垫均为玻璃纤维膜。所述特异性HP抗体为IgG抗体。
本发明利用所述无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒来对胃幽门螺旋杆菌进行检测的方法所采用的技术方案是，该方法包括以下步骤
将标本提取液滴在所述样品垫上，过10 15min后，用肉眼观察所述测试线(31 )，此
时，
1)若在所述测试线内出现一条红色条带，则说明标本提取液呈阳性；
2)若在所述测试线内没有出现红色条带，则说明标本提取液呈阴性。所述HP抗体用HP抗原免疫小鼠制得。所述标本提取液由纯化水、氯化钠、乙二胺四乙酸、叠氮钠构成。本发明的有益效果是由于本发明中的胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒包括盒体、样品垫、印迹膜、吸水垫，本发明还包括结合释放垫，所述结合释放垫的一端与所述样品垫相接触，另一端与所述印迹膜的一端相接触，所述吸水垫设置在所述印迹膜的另一端并与所述印迹膜保持接触，所述结合释放垫内包被有带HP抗体的标记物，在所述印迹膜上设置有测试线和质控线，在所述测试线内包被有特异性的HP抗体，在所述质控线内包被有羊抗鼠抗体，所以，本发明利用带HP抗体的标记物无需借助任何设备，用肉眼即可清晰判断标本中是否含有HP抗原，且该试剂盒结构简单，在短时间内即可得出检测结果，其测试快速可靠，且检测成本低。采用聚苯乙烯彩色微球作为标记物，使得检测线条更加鲜亮，便于结果的观察；采用幽门螺旋杆菌的复合抗体，使得检测的特异性更好；本发明可以不依赖于检验科进行操作，可以使得螺旋杆菌感染的检测实现家庭化。由于本发明胃幽门螺旋杆菌的检测方法利用免疫反应和薄膜层析的原理，所以， 在极短时间内，即可无创伤一步地准确快速地检测出标本中是否含有HP抗原，作为是否感染幽门螺旋杆菌的一种辅助诊断工具，仅需于体外诊断，即可实现检测。利用这种方法进行检测，不会对患者造成任何创伤和痛苦；在检测螺旋杆菌的过程中，只要把标本提取液滴在所述样品垫上，在短时间内即可获得检测结果，实现快速测试。
图1是本发明无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒的结构示意图。
具体实施例方式在本实施例中，既提供了一种无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒，也提供了利用该试剂盒对标本中的胃幽门螺旋杆菌进行无创伤一步检测的方法。如图1所示，本发明无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒包括盒体1、样品垫 2、印迹膜3、吸水垫4。本发明还包括结合释放垫5，所述结合释放垫5的一端与所述样品垫 2相接触，另一端与所述印迹膜3的一端相接触，所述吸水垫4设置在所述印迹膜3的另一端并与所述印迹膜3保持接触。所述结合释放垫5内包被有带HP抗体的标记物，在所述印迹膜3上设置有测试线31和质控线32，在所述测试线31内包被有特异性的HP抗体，在所述质控线32内包被有羊抗鼠抗体。所述样品垫2的一端粘附在所述盒体1上，另一端跨接到所述结合释放垫5上，所述结合释放垫5与所述印迹膜3相接触。所述印迹膜3采用硝酸纤维膜。所述样品垫2和所述结合释放垫5均采用玻璃纤维膜。所述特异性HP抗体为IgG抗体，IgG抗体能够与标本中的HP抗原发生特异性免疫反应。所述吸水垫4的应用是为了标本提取液的层析能顺利地进行。所述标记物采用聚苯乙烯彩色微球，也可以采用其他标记物代替，但是在本发明中，采用聚苯乙烯彩色微球作为标记物的检测效果最好，检测最后显示的条带清晰鲜亮，更易于用肉眼观察，有助于检测结果的判读。所述HP抗体用HP抗原按常规方法免疫小鼠制得，用HP抗原分多次向小鼠注射HP 抗原，培养一段时间以后，采集小鼠的血清，使用亲和层析的方法对血清进行纯化，获得HP 抗体。在选定了标记物以及制得HP抗体以后，进行带HP抗体的微球标记物的制取。在本实施例中，将IOOul微球原液加入到900ul的四硼酸钠溶液中，500w超声2次，13000转离心10 min，倒去上清液再补加四硼酸钠溶液到1ml，重复2次，移去上清液后加15ul的10% 的水溶性碳二亚胺(EDC)，IOOul浓度为4. 3mg/ml的HP抗体，补加四硼酸钠溶液至1ml， 500w超声2次，13000转离心10 min,重复2次，摇荡8小时，8小时后加30ul乙醇胺，摇荡 30min后13000转离心10 min，去上清液后用追加pH为8的三羟甲基氨基甲烷酪蛋白溶液 (tris-casein溶液)保存备用，即到带HP抗体的微球标记物。在制作测试线和质控线时，将带HP抗体的微球标记物包被在结合释放垫上，将特异性的HP抗体及羊抗鼠抗体包被在硝酸纤维素膜上，分别作为测试线和质控线，在38°C烘箱干燥。因为标记时使用的HP抗体源于小鼠，这里质控线位置使用羊抗鼠抗体的作用就是为了与标记的HP抗体结合，使质控线呈现出标记所用的彩色微球的颜色。这样设计的目的是为了使标记用的HP抗体与质控线结合，可以使质控线呈现颜色，能够让质控线起到作为试剂盒内部质控的作用。在组装好所述试剂盒以后，即利用它来对采集到的标本进行检测，判定其是否包含有HP抗原，从而进一步诊断患者是否携带幽门螺旋杆菌。检测方法包括以下步骤
将标本提取液滴在所述样品垫2上，所述标本提取液随后向所述结合释放垫5层析，过10 15min后用肉眼观察所述测试线31。经过试验，在IOmin后观察所述测试线上的变化，效果最佳。此时，
1)若呈阳性，即所述标本提取液中包含有HP抗原，则HP抗原与预包被在所述结合释放垫5上的带HP抗体的微球标记物反应，HP抗原与HP抗体结合形成结合物，随后结合物继续向所述印迹膜3层析，并与被包被在所述印迹膜3上的特异性HP抗体结合，结合物中的 HP抗原与所述特异性HP抗体发生特异性免疫反应，此时在所述测试线31内出现一条红色条带；
2)若呈阴性，即标本提取液中不包含有HP抗原，则在所述测试线31内不会出现红色条
带；
无论标本提取液中是否包含有HP抗原，所述质控线32内都会出现一条红色的质控条
市ο标本提取液由纯化水、氯化钠、乙二胺四乙酸、叠氮钠构成。本发明可广泛应用于幽门螺旋杆菌诊断领域。需要注意的是，上述仅以优选实施例对本发明进行了说明，并不能就此局限本发明的权利范围，因此在不脱离本发明思想的情况下，凡运用本发明说明书和附图部分的内容所进行的等效变化，均理同包含在本发明的权利要求范围内。
权利要求
1.一种无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒，包括盒体(1)、样品垫(2)、印迹膜 (3)、吸水垫(4)，其特征在于所述无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒还包括结合释放垫(5)，所述结合释放垫(5)的一端与所述样品垫(2)相接触，另一端与所述印迹膜(3) 的一端相接触，所述吸水垫(4)设置在所述印迹膜(3)的另一端并与所述印迹膜(3)保持接触，所述结合释放垫(5)内包被有带HP抗体的标记物，所述印迹膜(3)上设置有测试线(31) 和质控线(32)，在所述测试线(31)内包被有特异性的HP抗体，在所述质控线(32)内包被有羊抗鼠抗体。
2.根据权利要求1所述的无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒，其特征在于所述标记物为聚苯乙烯彩色微球。
3.根据权利要求1所述的无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒，其特征在于所述印迹膜(3)为硝酸纤维膜。
4.根据权利要求1所述的无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒，其特征在于所述样品垫(2)和所述结合释放垫(5)均为玻璃纤维膜。
5.根据权利要求1所述的无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒，其特征在于所述特异性的HP抗体为IgG抗体。
6.一种利用权利要求1所述的无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒来对胃幽门螺旋杆菌进行检测的方法，其特征在于，它包括以下步骤将标本提取液滴在所述样品垫(2)上，过10 15min，用肉眼观察所述测试线(31)，此时，1)若在所述测试线(31)内出现一条红色条带，则说明标本提取液呈阳性；2 )若在所述测试线(31)内没有出现红色条带，则说明标本提取液呈阴性。
7.根据权利要求6所述的无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述HP抗体用HP抗原免疫小鼠制得。
8.根据权利要求6所述的无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述标本提取液由纯化水、氯化钠、乙二胺四乙酸、叠氮钠构成。
全文摘要
本发明公开了一种无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒以及利用该试剂盒对胃幽门螺旋杆菌进行检测的方法。所述无创伤一步法胃幽门螺旋杆菌检测试剂盒包括盒体(1)、样品垫(2)、印迹膜(3)、吸水垫(4)、结合释放垫(5)，所述结合释放垫(5)内包被有带HP抗体的标记物。使用该试剂盒来对幽门螺旋杆菌进行检测时，利用免疫反应和薄膜层析的原理，将标本提取液滴在所述样品垫(2)上，所述标本提取液随后向所述结合释放垫(5)层析，在印迹膜上的测试线内，最终会显示测试结果，若标本提取液呈阳性，则在测试线内出现一条红色条带，若呈阴性，则在测试线内不会出现红色条带。本发明可广泛应用于幽门螺旋杆菌检测和诊断领域。
文档编号G01N33/571GK102288757SQ201110194390
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月12日 优先权日2011年7月12日
发明者孙宜峰, 曹喜成, 高海洲 申请人:珠海市银科医学工程有限公司