专利名称：副猪嗜血杆菌实时荧光定量pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及荧光定量PCR检测，尤其是一种副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法。
背景技术：
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)属于巴氏德菌科嗜血杆菌属。HPS通常定植在猪上呼吸道，正常条件下不引起猪发病，但是当机体处于应激状态或免疫功能下降时可以突破上呼吸道的防御机制，侵入机体多个器官，引起多发性浆膜炎、关节炎，严重者导致体温升高、呼吸困难甚至死亡，给养猪业带来巨大的经济损失。目前对HPS的诊断主要是细菌分离培养和常规PCR方法。HPS的培养条件要求高，需要NAD、马血清和5% CO2环境，培养时间需M 48h，在分离培养过程中常常出现杂菌污染。普遍使用的Oliverira等建立的PCR方法(0LIVEIRA S, GALINA L, PIJOAN C.Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections[J]. J Vet Diagn Invest, 2001,13 :1495-1501)虽然可以直接对病料进行检测，但检测费时且不能准确定量和存在假阳性的可能。实时荧光PCR是一种对DNA数量进行检测分析的PCR技术，具有操作简便、敏感性和特异性强、重复性好等优点，而且结果具有实时性，更准确直观，已广泛应用于基因的表达检测和定量研究中。于江等人指出16SrRNA基因序列不宜用作荧光定量PCR检测，并建立了以infB基因作为靶基因的HPS荧光定量PCR检测技术(于江，吴家强等.副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术的建立与应用.家畜生态学报.2010,31 ) :77-81)。但是，该研究仅限于HPS血清5型，对其它血清型的通用性未作有效验证，而且其方法只能区分副猪嗜血杆菌和链球菌及巴氏杆菌，抗相关菌干扰能力有限。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、准确、通用性好、抗干扰能力强的副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法。为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案副猪嗜血杆菌实时荧光定量 PCR检测方法，即通过荧光染料嵌合PCR反应中所发出的荧光信号进行检测，以登录号 AB004028的副猪嗜血杆菌的16S rRNA基因序列为参考，其引物序列和扩增序列分别为引物序列 1 5，-GAC GGG AAA CTG TCG CTA-3，引物序歹Ij 2 5，-CTA GAG ATC GTC GGC TTG-3，扩增序列为序列表SEQ. ID. No. 3的碱基序列。上述方法包括如下步骤<1>制备DNA样本取待检样本进行总DNA的提取纯化；<2>实时荧光定量PCR反应取步骤<1>所得DNA样本作为模板进行荧光PCR扩增，并同时分别以标准品DNA和去离子水为阳性对照样本和阴性对照样本进行荧光PCR扩增；<3>建立标准曲线取已知浓度的标准品DNA按10倍稀释法稀释成5X IO7 5 X 10°拷贝/ μ L 8个浓度梯度，按步骤<2>的PCR反应体系和反应程序进行扩增，反应结束后，根据得到的各浓度梯度的循环阈值Ct绘制荧光定量PCR标准曲线；将DNA样本的循环阈值Ct与标准曲线对照，得到待检DNA样本中的16S rRNA基因片段拷贝浓度，据此得到样本中的副猪嗜血杆菌的细菌数量。荧光定量PCR反应的反应体系、扩增程序和测定扩增片段的熔解程序分别为反应体系:PCR混合液20μ L，其中STOR GreenI Mix 9 μ L、5pmol/μ L的上下游引物各0. 3 μ L、DNA模板2. 5 μ L以及去离子水7. 9 μ L ；扩增程序95°C 5min，随后进行40个循环，每个循环包括95°C 20s,62°C 20s, 68°C 20s ；测定扩增片段的熔解程序按每0. 5°C /IOs的升温速率从55°C升至95°C进行熔解曲线分析验证。本发明根据HPS血清型较多的特点，选取具有高度保守性和特异性且是细菌分类鉴定主要靶基因的16S rRNA基因(GENBANK登录号AB004028)作为扩增靶基因，以该基因属内高度保守区域作为扩增区域设计特异性引物，建立了荧光染料SYBR Green I与DNA嵌合的副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法。由于荧光信号强度与扩增片段的数量成正比，通过已知标准品的标准曲线可对猪嗜血杆菌16S rRNA基因初始模板的DNA进行准确定量，而该基因系细菌染色体上的一段DNA序列，细菌染色体为单倍体，因此16S rRNA基因的拷贝数可以等同于细菌的数量。另外，与常规PCR相比，实时荧光PCR的核酸扩增和检测都在同一管内进行，通过荧光信号判断扩增片段是否扩增，无需电泳检测，解决了 PCR假阳性和核酸染料溴化乙锭对环境的污染问题。最后，本方法通用性强、特异性高，能够检测多种 HPS血清型，而又不受猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5a和猪伤寒沙门氏菌等相关菌的影响。综上所述，本发明可用于快速准确地对严重危害养猪业发展的副猪嗜血杆菌进行定量检测。
图1是本发明所用引物的定性PCR电泳图，图中1为分子量标记DNA Marker 1 (600bp) ；2为HPS血清4型；3为HPS血清5型；4为HPS血清9型；5为HPS血清14型。图2是本发明的熔解曲线分析图。图3是本发明的PCR扩增动力曲线，图中1为5 X IO7拷贝/ μ L ；2为5 X IO6拷贝 /^1^3为5父105拷贝/^1^4为5父104拷贝/ μ L ;5为5X IO3拷贝/ yL;6为5Χ102拷贝/yL;7 为 5X101 拷贝/yL。图4是本发明的标准曲线图。图5是本发明的特异性试验图，图中1为HPS血清5型；2为HPS血清9型；3为 HPS血清14型；4为HPS血清4型；5为其它细菌猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5a、猪伤寒沙门氏菌。图6是本发明的重复性试验图，图中1为IO7拷贝/μ L ；2为IO5拷贝/μ L ；3为 IO3 拷贝 / μ L。
图7是本发明副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法的流程图。图8是本发明实时荧光PCR的临床检测结果图，图中1为心包液1，2为心包液2， 3为心包液3，4为心包液4，5为心包液5，6为关节液1，7为关节液2，8为关节液3，9为关节液4，10为关节液5。
具体实施例方式副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法的研究1材料与方法1. 1主要仪器和试剂iCycler iQ5荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；常规PCR仪购自日本TaKaRa 公司；凝胶成像系统购自美国Alpha Inotech公司；ND-1000微量紫外分光光度计购自美国 Thermo公司。RealMasterMix荧光定量PCR试剂盒(STOR)、细菌基因组DNA提取试剂盒、 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司； PCR Taq Mix, DNA Marker 1购自广东东盛生物科技有限公司；PMD-18T载体购自宝生物工程(大连)有限公司；TSA琼脂培养基购自北京陆桥技术责任有限公司；马血清购自美国 Hylone公司；NAD购自北京索莱宝科技有限公司。1. 2 菌株HPS血清4型、5型、9型和14型；猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5a、 猪伤寒沙门氏菌由本实验室保存。1.3引物设计以HPS的16S rRNA基因序列(AB004028)为参考，应用引物设计软件DNA STAR和 01igo6.0对多种细菌的16S rRNA基因进行分析，选择HPS的16S rRNA基因属内保守区作为扩增区域，设计一对引物，扩增片段(见序列表SEQ. ID. No. 3)长度为136bp。引物序列为 5，-GAC GGG AAA CTG TCG CTA-3’ (见序列表 SEQ. ID. No. 1)和 5’ -CTA GAG ATC GTCGGC TTG-3’ (见序列表SEQ. ID. No. 2)，引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物具体参数如表1。表1引物参数表
引物名称位点长度GC%Tm值序列产物长度HPS-2F1491855.665.8GACGGG AAACTGTCGCTA136 bpHPS-2R2671855. 663.0CTAGAG ATCGTCGGCTTG1. 4模板DNA的制备挑取HPS单个菌落在含5 %马血清和0. 4mg/mL NAD的TSA琼脂培养基上划线，置于5% CO2环境中37°C培养36h，生理盐水洗脱细菌，用细菌基因组DNA提取试剂盒抽提细菌DNA，提取方法按说明书进行。1.5定性PCR扩增 采用设计的HPS弓丨物对抽提的DNA模板进行PCR扩增，PCR反应体系为50 μ L，包括PCR Taq Mix 12 μ L、上下游引物 Q5pmol/yL)各 lyL，模板 DNA 5 μ L，超纯水 31 μ L。反应条件为95°C预变性5min ；35个循环的95°C 20S，60°C 20S，72°C 20S，最后72°C延伸5min。1. 6标准阳性质粒的制备PCR产物于2 %的琼脂糖凝胶电泳后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。PCR产物与PMD-18T载体过夜连接后转化大肠杆菌DH5a。用小量质粒提取试剂盒提取转化长出的菌落质粒，阳性质粒经PCR和双酶切鉴定后送上海英骏生物技术有限公司测序。将测序正确的阳性质粒用紫外分光光度计测定纯度后，按公式拷贝数=(质粒浓度/质粒分子质量)X阿佛德罗常数(6.02X 1023)计算质粒的拷贝数。将5X109拷贝/ μ L的质粒进行10倍梯度稀释，分别以5 X IO7 5 X 10°拷贝/ μ L的质粒作为标准品用于实时荧光PCR。1. 7实时荧光PCR方法的建立采用棋盘法筛选引物浓度(2. 5 25pmol/ μ L)和PCR退火温度(58 62°C )，以在最小的循环阈值(Ct)内得到最大的荧光信号来优化实时荧光PCR最佳的反应条件。实时荧光PCR结束后，从55 95°C按每0. 5°C /IOs测定吸光值进行熔解曲线分析，确定PCR 是否为特异性扩增。1.8标准曲线的建立分别以浓度为5X IO7 5X 10°拷贝/ μ L的质粒标准品为模板，采用优化的反应条件进行实时荧光PCR。Ct阈值设定原则为超过阴性对照扩增曲线(无规则噪音线)的最高点，Ct值> 35为阴性，Ct值< 35为阳性。荧光定量PCR仪会根据每个浓度标准品测得的Ct值，以标准品拷贝数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。1. 9实时荧光PCR方法的特异性和重复性试验分别提取HPS血清4型、5型、9型和14型，猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5a、猪伤寒沙门氏菌的DNA进行实时荧光PCR，以评价方法的特异性。 用建立的方法分别对ΙΟ3、105、IO7拷贝/ μ L的质粒进行检测，每个浓度样品重复3 次，根据每个浓度的Ct进行变异系数的计算，以评价方法的重复性。2 结果2. 1目的片段的克隆和鉴定如图1所示，用设计的HPS弓丨物分别对HPS血清4型、5型、9型和14型的DNA进行PCR扩增，PCR产物电泳后出现与预期扩增长度相同的片段。PCR产物经琼脂糖凝胶回收后，与PMD-18T载体过夜连接并转化大肠杆菌DH5a。获得的阳性质粒经PCR和双酶切鉴定后送上海英骏生物技术有限公司测序，测序结果与参考序列完全一致。2. 2实时荧光PCR方法的建立采用棋盘法对PCR退火温度和引物浓度进行优化，获得了实时荧光PCR最佳反应体系和条件。总反应体系为20 μ L，其中RealMasterMix 9yL、上下游引物(5pmol/yL)各 0. 3 μ L、DNA模板2. 5 μ L以及超纯水7. 9 μ L。反应条件为95°C预变性5min ；随后进行40 个 95°C 20s, 62°C 20s, 68°C 20s 的循环。如图2所示，实时荧光PCR后进行熔解曲线分析以确定反应是否为特异性扩增。 熔解曲线只形成一个特异峰，Tm为84. 5°C，表明没有非特异性产物的扩增和引物二聚体形成，PCR反应条件得到了很好的优化，数据可以用于定量换算。2. 3标准曲线的建立抽提阳性质粒，测其OD26tZOD28tl值为1.93。计算阳性质粒拷贝数，将5 X IO9拷贝 /μ L的质粒进行10倍梯度稀释作为标准品，采用优化的反应条件进行实时荧光PCR扩增， 荧光定量PCR仪根据各个标准品测得的Ct值自动生成实时荧光PCR的扩增动力曲线(见图3)和标准曲线(见图4)。扩增动力曲线显示，当模板浓度为5X IO1拷贝/ μ L时，有荧光扩增曲线；而模板浓度为5 X 10°拷贝/ μ L时，没有扩增曲线，表明该方法检测最低极限为5 X IO1拷贝/ μ L。 标准曲线公式为Ct = -3.410Xlog拷贝数+25. 346，标准曲线的斜率为-3. 410，截距为 25. 346，相关系数(R2)为0.998。通过从仪器读取待测样本的Ct值，代入标准曲线公式可以换算出其初始细菌拷贝数。2. 4特异性试验以HPS血清4型、5型、9型和14型，猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 DH5a、猪伤寒沙门氏菌的DNA为模板进行实时荧光PCR，如图5所示，扩增曲线图显示只有 HPS血清4型、5型、9型和14型的检测达到Ct阈值，其它细菌无扩增曲线，表明建立的实时荧光PCR有较高的特异性。2. 5重复性试验用建立的方法分别对ΙΟ3、105、IO7拷贝/ μ L的质粒进行检测，每个浓度样品重复3 次。如图6所示，扩增曲线图显示每个浓度样品的扩增曲线几乎重叠，误差很小，经计算每个浓度样品重复性的变异系数均小于2%，表明建立的实时定量PCR具有较好的重复性和稳定性。实施例临床样品的检测用建立的副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法(方法Α)对临床采集的10份疑似HPS感染的心包液、关节液进行检测，并与细菌分离培养(方法B)和常规PCR(方法C) 进行比较。如图7所示，副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法具体步骤如下<1>制备DNA样本取待检样本进行总DNA的提取纯化；心包液处理吸取10微升心包液加入到装有100微升超纯水的EP管中，煮沸 IOmin, 12000rpm离心5min，取上清3微升作为DNA模板。关节液处理吸取10微升关节液加入到装有100微升超纯水的EP管中，煮沸 IOmin, 12000rpm离心5min，取上清3微升作为DNA模板。<2>实时荧光定量PCR反应取步骤<1>所得DNA样本作为模板在实时荧光定量 PCR仪上进行荧光PCR扩增，并同时分别以标准品DNA和去离子水为阳性对照样本和阴性对照样本进行荧光PCR扩增，其中荧光定量PCR反应的反应体系、扩增程序和测定扩增片段的熔解程序分别为反应体系PCR混合液20 μ L，其中STOR Green I Mix 9 μ L、5pmol/ μ L的上下游引物各0. 3 μ L、DNA模板2. 5 μ L以及去离子水7. 9 μ L ；扩增程序95°C 5min,随后进行40个循环，每个循环包括95°C 20s,62°C 20s, 68°C 20s ；
测定扩增片段的熔解程序按每0. 5°C /IOs的升温速率从55°C升至95°C进行熔解曲线分析验证。<3>建立标准曲线取已知浓度的标准品DNA按10倍稀释法稀释成5X IO7 5X 10°拷贝/ μ L 8个浓度梯度，按步骤<2>的PCR反应体系和反应程序在实时荧光定量 PCR仪上进行扩增，反应结束后，根据得到的各浓度梯度的循环阈值Ct采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线(如图4)；将DNA样本的循环阈值Ct (如图8)与标准曲线对照，得到待检DNA样本中的16S rRNA基因片段拷贝浓度，据此得到样本中的副猪嗜血杆菌的细菌数量。采用三种方法的临床样品检测结果如表2 表2三种HPS检测方法比较
方法方法A方法B方法C临床样^^^细菌数量细菌数量阴性/阳性心包液11.66 X IO71. 71 X IO7阳性心包液21.77 X IO81. 64 X IO8阳性心包液31.88 X IO81.84X108阳性心包液41.99 X IO71. 96 X IO7阳性心包液51.27X1071. 31 X IO7阳性关节液11.89 X IO91.85X109阳性关节液25.4X1085. 67 X IO8阳性关节液31.54X IO71.41 X IO7阳性关节液42.41 X IO72. 33 X IO7阳性关节液51.57 X IO81. 61 X IO8阳性吉果显示，三种检测方法检测结果--致，即所有临床样i品都为HPS阳性。荧光定量
PCR方法和细菌平板计数所测细菌数量基本一致，而传统PCR方法不能定量。
上述研究表明，本方法对HPS强毒力(5型和14型)、中等毒力G型)和低毒力 (9型)菌株的检测结果都为阳性，证实了方法在HPS血清型检测上的通用性。此外，本方法还具有较高的特异性，只能检测HPS，而不能检测猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 DH5a和猪伤寒沙门氏菌。同时，本研究根据16S rRNA基因质粒建立的标准曲线，线性范围广，在5X IO7 5X IO1拷贝/ μ L时呈现良好的线性关系，相关系数(R2)为0. 998，最小检测极限达5X IO1拷贝/μ L。重复性试验证实方法具有较高的重复性和稳定性，变异系数均小于2%。本方法检测临床样品与细菌分离培养和常规PCR鉴定结果相一致，但操作更简单和快速，在1. 内即可得到检测结果。因此，本发明的HPS实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏、准确和稳定的特点，可用于HPS感染的临床快速检测。
权利要求
1.一种副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法，通过荧光染料嵌合PCR反应中所发出的荧光信号进行检测，其特征在于以登录号AB004(^8的副猪嗜血杆菌的16S rRNA基因序列为参考，其引物序列和扩增序列分别为引物序列 1 5’ -GAC GGG AAA CTG TCG CTA-3’引物序列 2 5’ -CTA GAG ATC GTC GGC TTG-3’扩增序列为序列表SEQ. ID. No. 3的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述方法包括如下步骤<1>制备DNA样本取待检样本进行总DNA的提取纯化；<2>实时荧光定量PCR反应取步骤<1>所得DNA样本作为模板进行荧光PCR扩增，并同时分别以标准品DNA和去离子水为阳性对照样本和阴性对照样本进行荧光PCR扩增；<3>建立标准曲线取已知浓度的标准品DNA按10倍稀释法稀释成5X IO7 5X 10° 拷贝/ μ L 8个浓度梯度，按步骤<2>的PCR反应体系和反应程序进行扩增，反应结束后，根据得到的各浓度梯度的循环阈值Ct绘制荧光定量PCR标准曲线；将DNA样本的循环阈值Ct与标准曲线对照，得到待检DNA样本中的16S rRNA基因片段拷贝浓度，据此得到样本中的副猪嗜血杆菌的细菌数量。
3.根据权利要求2所述的副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述荧光定量PCR反应的反应体系、扩增程序和测定扩增片段的熔解程序分别为反应体系PCR混合液20μ L，其中STOR Green I Mix 9 μ L、5pmol/μ L的上下游引物各0. 3 μ L、DNA模板2. 5 μ L以及去离子水7. 9 μ L ；扩增程序95 V 5min,随后进行40个循环，每个循环包括95 °C 20s, 62 V 20s, 68°C 20s 测定扩增片段的熔解程序按每0. 5°C /IOs的升温速率从55°C升至95°C进行熔解曲线分析验证。
全文摘要
本发明公开了一种副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法，选取具有高度保守性和特异性且是细菌分类鉴定主要靶基因的16S rRNA基因(AB004028)作为扩增靶基因，以该基因属内高度保守区域作为扩增区域设计特异性引物，建立了荧光染料SYBR GreenI与DNA嵌合的副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法，通过已知标准品的标准曲线可对猪嗜血杆菌16S rRNA基因初始模板的DNA进行准确定量，并等同于细菌的数量。本发明的方法通用性强、特异性高，能够检测多种HPS血清型，而又不受相关菌的影响，可用于快速准确地对严重危害养猪业发展的副猪嗜血杆菌进行定量检测。
文档编号C12Q1/68GK102174653SQ20111004871
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月1日 优先权日2011年3月1日
发明者彭昊, 李军, 杨威, 潘艳, 禤雄标, 胡帅, 许力干, 谢宇舟, 谢永平, 陈泽祥, 马春霞 申请人:广西壮族自治区兽医研究所