专利名称：液相芯片检测大肠杆菌o157的方法
技术领域：
本发明属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。
背景技术：
大肠杆菌0157 :H7是肠出血性大肠埃希氏菌的主要血清型，是重要的人类致病菌，可引起出血性肠炎(HC)、溶血性尿毒综合症(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜( TTP)及死亡等。由于肠出血性大肠埃希菌(enterohemorrhagic万.co/i, EHEC)0157:H7 对人的致病力强，近年来世界范围内由该菌引起的不同规模、不同区域的爆发流行不断发生，发病呈明显上升趋势，已引起世界各国的高度重视。该菌主要通过食物、水以及直接接触感染，动物是其主要的宿主，因此今年来加强对进口冷冻肉类、禽类及其制品的检验力度。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用液相芯片技术用于检测大肠杆菌0157的方法，以便实现对大肠杆菌0157的快速检测。本发明由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成，其中微球是羧基化的21号微球、捕获抗体是大肠杆菌0157单克隆抗体、检测抗体是大肠杆菌0157的多克隆抗体、生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔 IgG，捕获抗体和检测抗体均能特异与大肠杆菌0157结合，以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合大肠杆菌0157的数量；
液相芯片的制备捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声lOmin，漩涡震荡30s，使微球均勻分布，用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul的微球原液置于1. 5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min，取出后弃上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化缓冲液，混勻后，用铝箔纸包好，置于37°C摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心 5min,小心移去上清，加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体，重悬混勻，置于37°C摇床120 rpm,孵育池，取出后离心弃上清，用500ul的PBS进行洗涤，洗涤后加入500ul 1 % BSA的 PBS溶液，重悬微球，37°C水浴摇床孵育两个小时进行封闭，封闭后4°C保存； 液相芯片检测大肠杆菌0157的方法
将已偶联的微球混合液室温恢复lOmin，漩涡振荡器震荡约3min，取约5000个微球， 加入IO8 CFU/ml的大肠杆菌015710ul，用PBS-TBN补足体积到lOOul，置于37 °C摇床 120rpm，lh，取出后离心弃上清，用200ul PBS-TBN洗两次，加入已稀释的检测抗体IOul，用 PBS-TBN补足体积到lOOul，置于37°C摇床120rpm，lh，取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次，然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG IOul，用PBS-TBN补足体积到lOOul，置于37°C摇床反应lh，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次，再加入SA-PE，用PBS-TBN补足体积到IOOul，置于37°C摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次，重悬于IOOul PBS-TBN中，上机进行检测。本发明运用液相芯片技术，提供一种用于检测大肠杆菌0157 (.Escherichia coli 0157)的方法，以便实现对大肠杆菌0157的快速检测，为食品安全做出贡献。液相芯片是集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术，其最大的特点是高通量，灵活性好，灵敏度高。
图1是本法明捕获抗体最佳工作浓度； 图2是本发明灵敏度检测结果；
图3是本发明特异性的检测结果； 图4是本发明重复性检测。
具体实施例方式本发明所采用的技术方案是通过大肠杆菌0157的特异抗体，与微球进行偶联后，制备出可以对大肠杆菌0157进行检测的液相芯片，在应用时，加入样品增菌液，使增菌液中的大肠杆菌0157被微球上的捕获抗体所捕获，检测抗体也与大肠杆菌0157结合后， 再与生物素标记的抗抗体共同孵育，然后通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白反应，应用 LuminexlOO检测系统实现对大肠杆菌0157的特异检测。本发明涉及的检测大肠杆菌0157液相芯片主要由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)组成。其特征是，所述微球为羧基化的21号微球；所述捕获抗体是大肠杆菌0157的单克隆抗体mAb)，所述检测抗体是大肠杆菌0157的多克隆抗体pAb)，生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG(biotin-羊抗兔IgG)；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与大肠杆菌 0157结合。以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合大肠杆菌0157的数量。上述的检测抗体是用于识别大肠杆菌0157的另一类抗体，其作用是将与液相芯片上捕获抗体结合的大肠杆菌0157与抗抗体结合，而抗抗体能与检测荧光偶联，间接将结合的大肠杆菌0157浓度与检测荧光的强度结合起来，从而实现对大肠杆菌0157的浓度进行定量测定。生物素标记的抗抗体通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白结合，最后通过 LuminexlOO检测系统对大肠杆菌0157进行定性定量检测。本发明所述的大肠杆菌0157液相检测芯片的制备方法，其步骤是 (1)捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声lOmin，漩涡震荡30s，使微球均勻分布。用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS。然后取200ul的微球原液置于1. 5ml 的离心管中，14000 rpm，离心5min。取出后弃上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul 的活化缓冲液。混勻后，用铝箔纸包好，置于37°C摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清。加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体，重悬混勻，置于37°C摇床120 rpm，孵育池。取出后离心弃上清，用500ul的PBS进行洗涤，洗涤后加入500ul 1% BSA的PBS溶液，重悬微球，37°C水浴摇床孵育两个小时进行封闭。封闭后4°C保存。(2)应用液相芯片检测大肠杆菌0157的方法
将已偶联的微球混合液室温恢复lOmin，漩涡振荡器震荡约;3min。取约5000个微球， 加入IO8 CFU/ml的大肠杆菌015710ul，用PBS-TBN补足体积到lOOul。置于37°C摇床 120rpm, Ih。取出后离心弃上清，用200ul PBS-TBN洗两次。加入已稀释的检测抗体IOul，用 PBS-TBN补足体积到lOOul。置于37°C摇床120rpm，lh。取出后离心，弃上清，用PBS-TBN 洗两次。然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG IOul，用PBS-TBN补足体积到lOOul。 置于37°C摇床反应lh。取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次。再加入SA-PE，用PBS-TBN 补足体积到lOOul，置于37°C摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次。重悬于 IOOul PBS-TBN中，上机进行检测。1.捕获抗体最佳工作浓度的确定
图ι所示当单抗浓度为250ug/ml时，其MFI值达到最大，故单抗最佳的工作浓度为 250ug/mlo2.偶联是否成功的检测
权利要求
1. 一种液相芯片检测大肠杆菌0157的方法，其特征在于由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成，其中微球是羧基化的21号微球、捕获抗体是大肠杆菌0157单克隆抗体、检测抗体是大肠杆菌0157的多克隆抗体、生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG，捕获抗体和检测抗体均能特异与大肠杆菌 0157结合，以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合大肠杆菌0157的数量；液相芯片的制备捕获抗体与微球偶联形成偶联体取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声lOmin，漩涡震荡30s，使微球均勻分布，用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul的微球原液置于1. 5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min，取出后弃上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化缓冲液，混勻后，用铝箔纸包好，置于37°C摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心 5min,小心移去上清，加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体，重悬混勻，置于37°C摇床120 rpm,孵育池，取出后离心弃上清，用500ul的PBS进行洗涤，洗涤后加入500ul 1 % BSA的 PBS溶液，重悬微球，37°C水浴摇床孵育两个小时进行封闭，封闭后4°C保存； 液相芯片检测大肠杆菌0157的方法将已偶联的微球混合液室温恢复lOmin，漩涡振荡器震荡约3min，取约5000个微球， 加入IO8 CFU/ml的大肠杆菌015710ul，用PBS-TBN补足体积到lOOul，置于37 °C摇床 120rpm，lh，取出后离心弃上清，用200ul PBS-TBN洗两次，加入已稀释的检测抗体IOul，用 PBS-TBN补足体积到lOOul，置于37°C摇床120rpm，lh,取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次，然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG IOul，用PBS-TBN补足体积到lOOul，置于37°C摇床反应lh，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次，再加入SA-PE，用PBS-TBN补足体积到lOOul，置于37°C摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次，重悬于IOOul PBS-TBN中，上机进行检测。
全文摘要
一种液相芯片检测大肠杆菌O157的方法，属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。本发明的目的是提供一种采用液相芯片技术用于检测大肠杆菌O157的方法，以便实现对大肠杆菌O157的快速检测。本发明首先制备液相芯片，捕获抗体与微球偶联形成偶联体，然后应用液相芯片检测大肠杆菌O157。本发明运用液相芯片技术，提供一种用于检测大肠杆菌O157(EscherichiacoliO157)的方法，以便实现对大肠杆菌O157的快速检测，为食品安全做出贡献。液相芯片是集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术，其最大的特点是高通量，灵活性好，灵敏度高。
文档编号G01N33/569GK102520167SQ201110360550
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者刘金华, 王亚丽, 王振国, 罗雁非, 蔡阳 申请人:吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心