专利名称：：一种检测土拉菌的基因液相芯片及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测土4立菌(Fra"c^/Za加/a""&,F/)的基因液相芯片及其制备方法。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行斥企测的方法。
背景技术：
：液相芯片检测是近几年发展起来的新兴技术，具有快速、特异、敏感的特点。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为IOO种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.5pm,可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。土4立菌(Fm"c!w〃a似/amm、/^)为需氧J求才干4犬小^干菌(0.2|xmx0.2~0.7nm),细胞单生，极其多形态，无芽孢，无动力；革兰氏染色阴性，染色时不易着色。本菌在普通培养基上不生长，在适当的固体培养基(如含1%血红蛋白的胱氨酸血琼脂培养基)上培养2-4d可形成光滑、凸起的灰白色菌落。血褪色并可以变成绿色。在石蕊牛奶中弱生长，可产弱酸。最适生长温度37。C,致死温度56。C10分钟。在^f氐温下能很好的存活。菌培养是诊断土拉弗氏菌病的金标准，根据该菌37。C生长緩慢、28。C几乎不生长的特性可与28。C较快生长的鼠疫杆菌、新凶手弗氏菌区别开来，但因其容易引起实验室感染，无法作为常M4喿作。而试管凝集法的敏感性和特异性都很高。分子生物学方法主要有PCR、实时荧光PCR等。
发明内容本发明涉及一种改进的基因液相芯片及其制备方法，该基因液相芯片可以用于病原体土拉菌的检测。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行4企测的方法。4经过深入和大量的研究和实验，本发明以土拉菌/o;^基因特异性序列为靶序列，建立了土拉菌液相芯片和检测方法，为该菌的检测提供一条可行的途径。本发明所述的基因液相芯片包括微球、捕获探针、引物、PCPL^应体系、链亲和素一藻红蛋白，该基因液相芯片可检测土拉菌。本发明还涉及上述可检测土拉菌的基因液相芯片，该芯片包括荧光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链亲和素一藻红蛋白，其中本发明的PCR^应体系包括10xPCR纟爰沖液、dNTPs、TaqDNA聚合酶。本发明的引物包括:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>其中，下游引物是5'生物素标记的Ft-R。具体例如是Ft-R:5，-生物素-GCTGTAGTCGCACCATTATCCT本发明的捕获探针，所述的捕获探针具有特异性:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上面所述探针在合成时在5'端进行M修饰，并且连接15-20个T或连接C12作为间隔链，然后将探针与所选的编码微球进行偶联。本发明的微球，一般选择荧光编码的微球，例如来源于Luminex或其他代理公司的任何编号的微球，特异性:探针与荧光编码微球偶联形成检测微球，由此构成检测芯片。本发明的链亲和素-藻红蛋白(Str印tavidin-R-phycoerythrin，SA-PE)为一种焚光蛋白，能被液相芯片检测系统中的绿色激光激发发光，由此可以进行定性或定量检测。本发明涉及上述基因液相芯片的制备方法，该方法包括1.选取编码微球，取适量如约1.25乂106个于离心管内，离心弃上清后，加入0.1mol/L的2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液使之重悬；2.用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针(即捕获探针Ft)稀释，加至微球悬浮液中，振荡混匀；3.加入10mg/mL的EDC(l-乙基-3-[3-二曱基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)溶液至微球与探针混和液中，振荡混匀，室温孵育例如30分钟；4.用例如0.02。/。PBST洗涤，14000g下离心；移弃上清液，将上述孩吏J求重悬于例如lml的0.1。/。SDS(即十二烷基磺酸钠)中，洗涤，离心；5.移弃上清液，微球重悬于例如100nlpH8.0TE中，振荡悬起混匀，得到偶联好的检测微球，即本发明的基因液相芯片。4"C避光保存。另一方面，本发明还涉及上述土拉菌检测基因液相芯片的检测方法，该方法包括样^^亥酸的提取，PCR扩增，检测病原体。本发明对上述三个步骤的操作和条件进行了改进和优化。本发明的样本核酸的提取方法采用采用Nal裂解-玻璃粉吸附法提取样本的核酸。例如，具体步骤如下1)向每管样本中加入6mol/LNal，振荡混匀，煮沸；2)离心，转上清液至另一含20%玻璃#^液的离心管中；3)充分混匀，室温放置10分钟，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上；8000r/分钟离心，小心倾去上清液；4)向玻璃粉-DNA沉淀中加入75o/。乙醇lml，充分混匀，离心，小心倾去上清液；5)重复步骤(4)，然后置于37。C恒温箱内干燥；6)向上述干燥的玻璃粉-DNA沉淀中加20nlTE，充分混匀，65°C加热，离心，回收上清液备用。本发明的PCR扩增方法包括以上述核酸提取步骤中制备的上清液作为PCR反应的模板，采用PCR反应体系以及反应条件本发明的PCR体系10xpCR緩沖液3jalTaqDNA聚合酶0羊dNTPs:0.3pi上游引物0.3^1下游引物0.3pl模板DNA:2^1双蒸水ddH20:补足30pl反应条件预变性94-96。C10分钟35个循环94-96。C30國40秒55-58°C30-40秒72。C30-40秒延伸72。C4-7分钟同时，PCR空白对照品为如下10xPCR緩沖液3^1Taq酶0.3|uldNTPs:0.3|til上游引物0.3|nl下游引物0.3^1双蒸水ddH20:补足30ial反应结束后以1%的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况。本发明的检测方法，优选是1)取上述两种偶联微球混合，装于PCR管中，根据微球计数结果计算相应加入量，使每种微球的量相同，每次反应每种3000-5000个；2)向各管中加5-17pl上面的PCR扩增得到的产物，混匀；3)95。C变性10分钟；随后45~60。C反应10-30分钟；4)离心或抽滤去掉未结合的PCR产物；5)再向各孔加SA-PE，室温避光孵育，抽滤去掉未结合的SA-PE;6)再向各孔加入75inlTE悬浮液，振荡使微球重悬；7)反应结束后上LUMINEX检测仪器进行检测。例如使用Bio-plex检测设备，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发微球基质的染料从而对微球编号进行识别，绿色激光对结合体的荧光蛋白进行识别，实现捕获揮:针捕获的PCR产物的定量分析。附图为用探针Ft检测土拉茵核酸的剂量-反应曲线，即模板DNA的量与发生反应的荧光信号值MFI之间的对应关系；横轴代表PCR反应体系中模板DNA的浓度(fg/test)，纵轴代表荧光信号值MFI。具体实施例方式实施例l、基因液相芯片的制备1.选取编码微球，如027号，取约1.25xl()6个置于离心管，14000g下离心，例如离心3-5分钟，小心吸出上清液；2.加入50piO.lmol/L的2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液，振荡混匀。3.用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释到0.1mmol/L;将l(il稀释的探针Ft加于027号微球悬浮液中，振荡混匀。4.加入2.5|il新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液至孩U求与4笨针混和液中，振荡，室温孵育30分钟。5.用0.02%PBSTlml洗涤1次，离心14000g3-5分钟。6.移弃上清液，微球重悬于1ml0.1%SDS中，洗涤，离心。7.移弃上清液，微球重悬于lOOplpH8.0TE中，振荡悬起混匀，即得到偶联好的检测微球。8.用血球计数器计数微球的数量，换算出每种微球的单位浓度。9.把偶联好的检测微球放在4。C避光保存，一般每种探针偶联的微球单独保存，使用时，根据检测项目选择要混合的微球种类。实施例2、样本核酸的提取采用Nal裂解-玻璃粉吸附法提取样本的核酸。具体如下1)向每管样本中加入6mol/LNal100|il，振荡混匀，煮沸30分钟。2)将上述煮沸处理的样本于10000r/分钟离心5分钟，将上清液转8至另一含20%玻璃粉液的离心管中。3)充分混匀，置室温10分钟，8000r/分钟离心2分钟，小心倾去上清液。4)向玻璃粉DNA沉淀中加入75。/。乙醇1ml，充分混匀，洗涤玻璃粉，8000r/分钟离心2分钟，小心倾去上清液。5)重复清洗一次后，放置于37。C恒温箱使彻底干燥。6)向上述晾干的玻璃粉-DNA沉淀中加20plTE，充分混匀，65°C加热15分钟。8000r/分钟离心2分钟，回收上清液备用。实施例3、PCR扩增以回收的上清液作为PCR反应的模板，PCR反应体系以及反应条件:PCR体系10xPCR緩沖液Taq酶dNTPs:上游引物下游引物模板DNA:双蒸水ddH20:反应条件预变性94°C35个循环94°C58°C72。C延伸72°C3pl0.3^il0.3|xlO羊补足30pl10分钟30秒30秒40秒7分钟同时设置PCR空白对照，如下10xPCR緩冲液3jilTaq酶0.3|iildNTPs:上游引物下游引物双蒸水ddH20:0羊0.3|iil补足30|11反应结束后以1%的琼脂糖凝"交电泳;险查扩增情况。实施例4、检测1.取偶联微球027号各5000个混合，分装于PCR管中(根据微球计数结果计算相应加入量)2.向各管中加5~17^1上面的PCR产物4吏其终体积为50|li1。3.95。C变性IO分钟。4.45~60。C反应10-30分钟。5.转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物。6.再向各孔加75fi14ng4dSA-PE,室温避光孵育IO分钟，抽滤去掉未结合的SA-PE。7.再向各孔加入75pl悬浮液，振荡使孩"求重悬。8.反应结束后上枳4企测。9.Bio-plex检测系统，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发微球基质的染料从而对微球编号进行识别，绿色^:球对表面结合的焚光染料进行识别，实现捕获探针捕获的PCR产物的定量分析。在检测时，同时以PCR阴性对照进行检测做为检测本底。对于每个检测体系和检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球群的焚光强度中位值(MedianFluorescenceIntensity,MFI)，亦即读取的这种编号的微球群(100个或以上)的每个微球信号强度的统计平均值。结果判断当待检测样本孔的MFI值为本次检测背景信号强度三倍以上时即判为阳性。实施例5、定量检测提取土拉菌的基因组DNA，利用核酸蛋白分析仪测定其浓度，进行系列稀释，PCR扩增后，同上面检测步骤进行检测，Bio-PlexVersion4.010分析，拟合出剂量-反应曲线和曲线方程。样本^r测值代入方程实现定量检测。结果针对土拉菌的检测，本发明设计了位于染色体/o/W基因的探针进行检测。提取土拉菌基因组DNA测定浓度后进行10倍系列稀释，3fg-3xl07fg,按上述确定的方法进行PCR扩增和检测，拟合曲线，得出曲线方程探针Ft的曲线方程FI=-2.56466+(2725.31+2.56466)/((l+(Cone/260493)-2厕))o.33"45从标准曲线推算检出限，本体系的检出限为0.95pg/test。从上述结果可以得出，本发明的悬浮芯片和;^测方法具有以下优越性1.灵敏较之于普通的多重PCR反应，本发明的灵敏度提高从以下两个方面体现1)检测仪器存在信号的放大系统；2)PCR产物带上的生物素与荧光染料藻红蛋白连接的亲和素结合的放大作用。2.特异釆用核酸4笨针:忮术对标记上生物素的PCR产物进行特异性的识别，而非传统的电泳方法通过PCR产物片^a大小进行识别。3.准确高效整合核酸体外扩增、核酸分子杂交、编码微球、生物素标记、焚光检测和流式细胞技术于一体，同时实现核酸样品的检测、鉴定，使结果准确，工作高效。4、芯片制作方便只用设计好待检目标菌的引物，优化PCR条件，标记对应的探针于编码微球，即可组装成检测体系。5、本发明涉及的方法同样适用于其他病原体或目标物的核酸检测。6、可实现多重检测，待检目标灵活可调可根据不同检测目标，选择对应的引物和微球，组成不同目标组合的检测体系。权利要求1.一种检测土拉菌(Francisellatularensis，F.t)的基因液相芯片，该芯片包括荧光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链亲和素-藻红蛋白。2.权利要求l所述的基因液相芯片，其中所述引物包括Ft-FGGGCAAATCTAGCAGGTCAAGFt-RGCTGTAGTCGCACCATTATCCT下游引物5，端经生物素标记Ft-R:5，-生物素-GCTGTAGTCGCACCATTATCCT，3.权利要求i所述的基因液相芯片，其中所述捕获^:针选自探针名称探针序列(5，-3，)FtTGCTGGTTTAACATGGTTCTTTGG上面所述探针在合成时在5'端进行氨基^^饰，并且连接15-20个T或连接C12作为间隔链，然后将探针与所选的编码」微球进行偶联。4.一种制备权利要求1任一项所述的基因液相芯片的方法，该方法包括1)选取编码微球，取适量于离心管内，离心弃上清后，加入2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液使之重悬；2)用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针，即捕获探针Ft稀释，加至微球悬浮液中，振荡混匀；3)加入EDC溶液至微球与探针混和液中，振荡混匀，室温孵育；4)用0.02%PBST洗涤，14000g下离心；移弃上清液，将上述孩t球重悬于0.1。/。SDS中，洗涤，离心；5)移弃上清液，微球重悬于pH8.0TE中，振荡悬起混匀，得到偶联好的检测微球，得到所述的基因液相芯片。5.权利要求1-4任一项所述的土拉菌检测基因液相芯片的检测方法，该方法包括样本核酸的提取，PCR扩增，检测病原体核酸。6.权利要求5所述的方法，其中所述样本核酸的提:f又包括以下步骤1)向每管样本中加入Nal,振荡混匀，煮沸；2)离心，转上清液至另一含20%玻璃粉液的离心管中；3)充分混匀，室温放置，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上；离心，小心倾去上清液；4)向玻璃粉-DNA沉淀中加入75。/。乙醇，充分混匀，离心，小心倾去上清液；5)重复步骤4),然后置于37。C恒温箱内干燥；6)向上述干燥的玻璃4分-DNA沉淀中加20nlTE，充分混匀，65。C加热，离心，回收上清液备用。7.权利要求4-6任一项所述的方法，其中所述^r测步骤包括1)取上述偶联微球，装于PCR管中，根据微球计数结果计算相应加入量；2)向各管中加5~17|11上面的PCR扩增得到的产物，混匀；3)95。C变性10分钟；随后45~60。C反应10~30分钟；4)离心或抽滤去掉未结合的PCR产物；5)再向各孔加SA-PE，室温避光孵育，抽滤去掉未结合的SA-PE;6)再向各孔加入75filTE悬浮液，振荡使微球重悬；上检测仪器进行检观'J。全文摘要本发明涉及一种检测土拉菌的基因液相芯片及其制备方法。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。本发明以fopA特异基因为靶序列，建立了土拉菌液相芯片和检测方法，为土拉菌的检测提供一条可行的途径。文档编号G01N21/64GK101560562SQ20091008026公开日2009年10月21日申请日期2009年3月17日优先权日2009年3月17日发明者刘衡川,孙肖红,宋亚军,文海燕,宇杨,静王,胡孔新申请人:中国检验检疫科学研究院