检测大肠杆菌h血清型中3种血清型的基因液相芯片及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检大肠杆菌Η血清型中3种血清型的基因液相芯片及其制备方法。 本发明还设计利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。
【背景技术】
[0002] 液相芯片是基于美国Luminex公司xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling)技 术开发的多功能芯片平台。它是在不同编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体 的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定 性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应，是继基因芯片、蛋 白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。与传统检测方法相比，液相芯片技术具有 高通量、灵活性好、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点。基于上述诸多优点，液相芯 片技术有着不可估量的应用潜力。
[0003] 液相芯片的整个体系基质由直径为5 μπι的聚苯乙烯微球组成，每种微球在制作过 程中按不同的比例掺入红色和橙色两种荧光染料，以此来对微球进行编号，可将微球分为 100种。每种微球由于荧光染料比例的不同，具有不同的光谱特征，检测过程中可以被激光 特异性识别。利用液相芯片检测时，微球排成单列，逐个经过检测通道，检测仪器同时发出 红色和绿色两束激光。红色激光通过激发微球基质中的颜色，识别微球的编号，从而确定目 标分子的种类，对目标分子进行定性。绿色激光可识别报告分子，经过数字信号处理器，以 数字的形式生成荧光值，由于报告分子偶连着微球，因此根据荧光值的大小就可对要检测 的目标分子进行定量。因此，通过红绿双色激光的同时检测，完成对反应的实时、定性和定 量分析。
[0004] 大肠埃希氏菌，又称大肠杆菌，属于肠杆菌科，埃希氏菌属，在1885年被发现。在很 长一段时间内被当作肠道正常菌群之一，但在20世纪中期，人们才认识到某些大肠杆菌具 有致病性，能引发腹泻和菌血症。
[0005] 鞭毛丝是由直径4.5nm的鞭毛蛋白亚单位沿着直径20nm的中央孔道螺旋状排列而 成，每周8-10个亚基。鞭毛蛋白亚单位决定了 H-抗原的特异性。fliC基因负责编码鞭毛单位 亚单位，其两端为保守区，中间为特异区。大多数大肠杆菌只有一个负责编码鞭毛蛋白的基 因，fliC基因在不同血清型之间高度特异，在相同血清型内保守，大小在500-1000bp，因此 可用来设计引物和探针，来检测不同的H-抗原血清型。
[0006] 目前，检测大肠杆菌Η抗原血清型的方法主要是传统的玻片凝集实验即抗血清实 验，但缺点也比较明显容易出现交叉凝集和假阳性。近年来也陆续出现一些分子生物学分 型方法如PCR检测技术，且由PCR检测技术衍生出来的实时荧光定量PCR和多重PCR技术也被 应用于大肠杆菌鞭毛蛋白分型。虽然实时荧光定量PCR的方法特异性高，方便准确，便于操 作，但是仪器昂贵，荧光探针合成困难，极大限制了它的应用。多重PCR技术可以对多个病原 同时检测，但是容易形成非特异性扩增和交叉反应。本发明建立的检测大肠杆菌Η抗原中3 种鞭毛蛋白的液相芯片检测系统，操作简便，灵敏度高，特异性强，准确性好。填补了以往分 型检测技术的不足。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的就是提供一种检测大肠杆菌Η抗原中3种血清型的基因液相芯 片方法，该芯片包括:荧光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链霉亲和素-藻红蛋 白，其主要特征在于所述的捕获探针包含从以下序列中选取的一种或多种序列： (1) 从大肠杆菌Η15抗原血清型的特异基因序列中所选取的核酸序列;见SEQ ID NO: 1; (2) 从大肠杆菌H28抗原血清型的特异基因序列中所选取的核酸序列;见SEQ ID N0:2; (3) 从大肠杆菌H37抗原血清型的特异基因序列中所选取的核酸序列;见SEQ ID N0:3。
[0008] 本发明所述的从大肠杆菌11抗原血清型H15、H28、H37这3种菌株的鞭毛蛋白特异基 因序列中所选取的核酸序列分别对应SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:3所示的DNA序列中的一种 DNA序列； 本发明所述的引物序列分别对应SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:6所示的一条引物顺序。
[0009] 本发明所述的基因液相芯片，其中的引物序列的DNA片段或其互补的DNA片段。
[0010] 本发明所述的基因液相芯片的制备方法，包括核酸提取、微球偶联、PCR扩增及上 机检测。
[0011] 本发明进一步公开了液相芯片在用于大肠杆菌!1抗原鞭毛蛋白血清型检测方面的 应用。所应用的检测探针包括SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:3所示的DNA序列中的至少一种。
[0012] 由上述的技术方案可见，本发明首次将液相芯片技术引入大肠杆菌Η抗原鞭毛蛋 白血清型的检测领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的液相芯片及其检测方 法，由于操作简便，准确性高，重复性强，该液相芯片在医学检验领域具有重要的应用价值。
【附图说明】
[0013] 图1 3种鞭毛蛋白类型特异基因探针特异性比较； 图2包括:图2Α大肠杆菌Η15血清型的灵敏度检测； 图2Β大肠杆菌Η28血清型的灵敏度检测； 图2C大肠杆菌Η37血清型的灵敏度检测； 图3实际样品检测图；图中出现的数字代表微球编号，例如(45)等。
[0014] 本发明所用到的大肠杆菌菌种来源如下表1所示： 表1本实验所用到的菌种
实施例1 引物、探针的设计与制备 1、探针的筛选 特异性探针是整个液相芯片技术核心部分，一般采用先设计特异性探针，然后再根据 探针位置来设计相应的引物。
[0015] 由于后期多重PCR的要求，因此在前期设计探针时，应注重保证所有探针Tm值在一 定范围内，本研究选取Tm值范围在55土2°C。设计探针时将探针的长度控制在18-25bp之间， GC含量控制在30-60%。前期设计时针对每一个靶基因设计了多条特异探针这样不仅保证可 以筛选出即保守又特异的探针，还能更加确保检测结果的可靠性。
[0016] 要想得到既保守又特异的探针如果仅仅靠生物信息学分析是远远不够的，有时候 很符合上述条件的探针在实际杂交过程中却得不到稳定的阳性信号。因此设计好的探针必 须经过实际芯片上机检测进行反复的筛选，才能保证真正有效地探针。
[0017] 本研究经过反复多次的实验筛选，最终获得了每种菌特异的探针序列，如表1所 示： 表2本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的鞭毛蛋白血清型
2、引物的设计 通过阅读大量文献，本研究最终确定以大肠杆菌田允原fliC基因为靶基因。利用Primer Premier 5.0设计引物，设定好引物的长度、引物类型、碱基数目等参数后运行软件，从输出 结果中找出Tm值=62°C±2 °C、碱基数在18-30bp之间、引物间无二聚体、引物内部无二级结 构且扩增片段包含探针序列的引物。并且最终要保证所有引物PCR扩增出来的目的片段在 小于300bp。利用设计好的引物多重PCR，最终得到的引物如表2所示： 表3芯片所用到的引物
实施例2、基因液相芯片的制备 1、 选取编码微球(bio-rad或Luminex公司），每一条探针对应一个微球编号，3种鞭毛蛋 白血清型就需要3个不同的微球编号，如045号微球偶联H37的探针，取约1.25X 106个置于 离心管，12000 rpm/min，离心3-5分钟，小心移去上清； 2、 加入10 uL 0.1M的MES(2-(n-吗啉代）乙磺酸溶液），充分震荡混匀，稍微离心； 3、 用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释至O.lmmol/L;加入4uL稀释的H37探针于045号 微球悬浮液中，振荡混勾； 4、 加入2.5 uL新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液至微球与探针混合液中，振荡，室温避光 孵育30分钟，此步要求快速操作； 5、 重复步骤4; 6、 用 1 mL 0.02% Tween20洗涤一次，12000rpm/min离心3-5分钟； 7、 小心弃上清，微球重悬于1 mL 0.1%SDS中，