一种葡萄糖酸杆菌属基因无痕敲除体系及应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种葡萄糖酸杆菌属Gluconobacter基因无痕操作的体系，尤其是适用于基因无痕敲除或者无痕整合的体系，属于基因工程
技术领域：
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背景技术：
】[0002]葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter)为一群极生鞭毛、可运动或无运动性的细菌种群，在分类学地位上属于变形菌门（Proteobacteria)、α-变形菌纲(Alpha-proteobacteria)、红螺菌目（Rhodospirillales)、醋酸菌科（Acetobacteraceae)。其是一种专性好氧的革兰氏阴性菌，对人和动物无病原性，但可引起水果的细菌性腐烂和褐变，因此其常在含糖丰富的环境，如鲜花、水果等。该菌种含有多种膜结合脱氢酶，如D-葡萄糖脱氢酶（glucosedehydrgenase)、甘油脱氢酶（glyceroldehydrogenase)、D-山梨醇脱氢酶（sorbitoldehydrogenase)等，使得大部分底物能在细胞质膜上被快速氧化并分泌到胞外，这种氧化称为不完全氧化。因此，该菌种广泛应用于维生素C、5_脱氧野尻霉素、D-葡萄糖酸、酮基葡萄糖酸、2-羟丙酮和醋酸等工业化生产，如CN103484418A、CN102041264A、W02004029262、CN103484417A等，特别的是生物合成维生素前体2-酮基-L-古龙酸（2-keto-L-gulonicacid，2-KLG)的关键菌株，具有非常高的工业应用价值。[0003]2005年Gluconobacteroxydans62IH的基因组序列公布NatBiotechnol，23(2)，195-200,这为基因组学、蛋白组学及代谢组学研究提供了便利，然而目前，针对Gluconobacter的基因工程操作技术还不够成熟。传统的手段都是通过插入抗生素抗性基因，使目的基因失活达到敲除的目的（ApplMicrobiolBiotechnol2005,66:668-674；JBacteriol2006,188:7668-7676；ApplEnvironMicrobiol2010,76:4369-4376；ApplEnvironMicrobiol2009,75:4240-4247；ApplEnvironMicrobiol2008,74:5250-5253),该方法存在明显的不足之处，外源抗性基因的插入不仅会对上下游基因引起极化作用（ProgBiochemBiophys2009,36:556-565)，更甚的是影响重组宿主菌的生物安全性。另外，现有可用的抗生素基因相对有限，一旦抗性基因整合进基因组，则该抗性基因就无法再次使用，这就限制了该方法的连续使用，特别的是在代谢工程研究中的应用，其常常涉及多功能基因的操作。[0004]目前，有研究报道了一种用于葡萄糖酸杆菌的无抗性基因的敲除的方法，如ApplMicrobiolBiotechnol2013,97:8341_8349;ApplEnvironMicrobiol2012,78:6975-6986JBacteriol2013,195:4210-4220及CN103805545A，其依赖于upp基因，一种编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶，能将5-氟尿嘧啶转化为5-氟尿苷一磷酸，进一步转化为5-氟脱氧尿苷单磷酸，而5-氟脱氧尿苷单磷酸是胸苷酸合成酶的不可逆抑制剂，从而导致DNA合成受阻，起到致死作用。具体方法是：首先敲除掉宿主菌的upp基因，得到upp基因缺陷型菌株，使其能在含有5-氟尿嘧啶的培养基上生长；同时构建一个含条件致死功能的upp基因的重组整合质粒，通过质粒与基因组的整合，先后经抗生素抗性和抗5-氟尿嘧啶筛选，获取目的基因缺陷型突变株。该方法的局限性在于首先要获得upp基因缺陷型菌株，缺乏普遍性；而反向筛选物5-氟尿嘧啶本身属于有毒物质，危险等级为Xn，半数致死量（大鼠，经口）230mg/kg，且具有腐蚀性，不适合广泛应用。【
发明内容】[0005]本发明提供一种葡萄糖酸杆菌属基因无痕操作体系及应用，适用性广、操作安全。[0006]-种葡萄糖酸杆菌属的基因无痕敲除体系，包括一株野生型葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter)菌株和一个带有SacB基因、抗生素标记和多克隆位点的重组整合型自杀质粒。[0007]优选地，所述SacB基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示。[0008]优选地，所述抗生素标记为卡那霉素抗性基因标记。[0009]优选地，葡萄糖酸杆菌属可以是野生型氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans)〇[0010]优选地，重组整合型自杀质粒的制备方法如下：[0011](1)构建含SacB基因的克隆质粒PEASY-Blunt-SacB;[0012](2)取测序正确的克隆质粒pEASY-Blunt-SacB，通过SspI单酶切克隆质粒pEASY-Blunt-SacB和自杀质粒pK18mobGII，回收并连接、转化进E.coliDH5α，筛选获取SacB连接方向正确的阳性克隆，并培养Ε.coliDH5a，提取整合型质粒pJKM，即得所述重组整合型自杀质粒。[0013]构建含SacB基因的重组质粒pEASY-Blunt-SacB的方法如下：[0014](1)以如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的碱基序列为引物扩增SacB基因；[0015]上游引物：5'-AATATTcacatatacctgccgttcactat-3'（SEQIDNO.2)[0016]下游引物：5'-AATATTccatcggcattttcttttgcg-3'（SEQIDNO.3)[0017](2)通过平末端克隆试剂盒（pEASY-BluntSimpleCloningKit,全式金，北京）进行平末端无缝克隆，得到含有SacB基因的重组质粒pEASY-Blunt-SacB。[0018]本发明还提供一种利用所述基因无痕敲除体系进行葡萄糖酸杆菌属中基因敲除的方法，包括如下步骤：[0019](1)将待敲除目的基因的上、下游片段引入重组整合型自杀质粒的多克隆位点，得到自杀型敲除质粒；[0020](2)将所得自杀型敲除质粒转化进宿主菌，即野生型葡萄糖酸杆菌中，依次进行抗生素抗性筛选和蔗糖筛选，最后采用菌落PCR验证得到目的基因敲除的基因缺陷型菌株。[0021]所述宿主菌可以为野生型氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans)，更可以为利用所述基因无痕体系敲除GluconobacteroxydansDSM2343中的基因后得到的重组菌，如敲除葡萄糖酸-2-脱氢酶基因后的G.oxydansΔG0X1231重组菌。[0022]优选地，目的基因的上、下游片段大小为500_1200bp。[0023]进一步优选地，目的基因的上、下游片段大小为800-1000bp。[0024]更进一步优选地，当用于敲除GluconobacteroxydansDSM2343中葡萄糖酸-2-脱氢酶基因（GA2DH)时，GA2DH基因上、下游基因片段各1000bp;当用于敲除G.oxydansAG0X1231中丙酮酸脱羧酶基因（TOC)时，PDC基因上、下游片段各800bp。[0025]优选地，所述自杀型敲除质粒通过电转化进入宿主菌中。[0026]优选地，所述抗生素抗性筛选是将转化子涂布于50μg/mL的卡那霉素和50μg/mL的头孢西丁的甘露醇培养基平板，得到基因组整合型转化子。[0027]优选地，所述蔗糖筛选是抗生素基因整合转化子经甘露醇培养基试管培养后，划线于含有5~10%蔗糖和头孢西丁的甘露醇培养基平板，得到脱离自杀质粒的突变型菌株。[0028]所述甘露醇培养基的组成为（g/L):甘露醇25;Yeastextract5;tryptone3;琼脂15(固体培养基）；pH5.5-6.0;121°(：灭菌2〇1^11，头孢西丁终浓度5(^8/111匕[0029]第一轮筛选是得到单交换的转化子，即自杀敲除质粒通过上、下游同源臂基因重组，整合进Gluconobacter基因组，得到卡那霉素抗性表型；第二轮筛选是在条件致死因素存在的情况下，发生双交换，使自杀质粒脱离基因组，从而得到回复突变型和目的基因敲除的突变型。[0030]本发明所采用的自杀质粒pK18mobGII构建方法可参见文献NewmobilizablevectorsuitableforgenereplacementinGram-negativebacteriaandtheiruseinmappingofthe3'endoftheXanthomonascampestrispv.Campestrisgumoperon.ApplEnvironMicrobiol1999,65:278-282,本发明中由该质粒的构建者（IELPI，L.Institute)deInvestigacionesBioqut'micasFundacio'nCampomar,FacultaddeCienciasExactasyNaturales,UBA,andC0NICET,1405BuenosAires,Argentina,Phone:54(l)863-4011/19.Fax:54(l)865-2246.E-mail:LIELPI@iib.uba.ar.)提供。从自杀质粒pK18mobGII出发，构建新型含有SacB基因的整合型自杀质粒pJKM，应用于葡萄糖酸杆菌的基因无痕操作。SacB基因编码一个可以分泌的果聚糖蔗糖酶，其能水解蔗糖形成高分子量的果聚糖，使得革兰氏阴性菌在含有5-10%(优选10%)的蔗糖培养基上出现致死表型，以此作为反向筛选标记，操作安全，无毒。[0031]本发明采用SacB基因作为筛选标记，在Gluconobacter中进行基因的无痕操作，是对以upp基因作为筛选标记的一种改良，并且宿主菌无需任何操作，野生型即可，适用范围广，操作安全。[0032]与现有方法相比，本发明具有如下有益效果：[0033](1)本发明的有益之处是以5%-10%蔗糖替代5-氟尿嘧啶作为反向筛选标记，降低了操作的有害风险；宿主菌无需u当前第1页1 2