一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及黄杆菌遗传操作系统，具体涉及一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒及 应用，特别涉及一种遗传操作系统在功能基因敲除和基因缺失弱毒疫苗构建过程中的具体 应用。
【背景技术】
[0002] 柱状黄杆菌（Flavobacteriumcolumnare)是一种革兰氏阴性细菌。该菌能够感 染包括人工养殖或野生鱼类在内的几乎所有不同生长阶段的淡水鱼类。该菌感染鱼体后， 在感染部位呈柱状生长，并导致鱼体产生严重的鳃部溃烂、背部溃疡和鳍条坏死等一系列 症状，最终引起大量死亡。由该菌所引发的疾病在在我国称为细菌性烂鳃病，在国际上统 称为柱形病。每年春末至秋初为该病的流行盛期。我国人工养殖的重要经济鱼类如草鱼 (Ctenopharyngodonidellus)和繼鱼（Sinipercachuatsi)每年由该病引发的死亡率 可高达100% (湖北省水生生物研宄所鱼病研宄室，1975;陈昌福等，1995)。在美国，每年 由该病引起人工养殖斑点叉尾鮰（letaluruspunctatus)的死亡率高达90%(Shotts& Starliper, 1999；ffagneretal. , 2002)〇
[0003] 对于该病病原柱状黄杆菌的早期研宄主要集中在诊断（Bernardetetal. , 1996 ; Baderetal., 2003)、病理和流行病学（Foott, 2002 ;Stringer_Rothetal., 2002)和 可能的防治（.Dunhametal., 2002 ;Thomas_Jinu&Goodwin, 2004)等方面。近年来， 又有学者开展了该菌的遗传多样性的研宄，现已证明该菌有三个基因组型Oarwish& Ismaiel，2005;Schneck&Caslake，2006;Wangetal.，2010)。近年来，尽管柱状黄杆菌 的基因组序列已经公布，研宄人员也尝试开展可能的毒力因子和致病机理的研宄，但是尚 未取得突破性进展。这主要归因于在该研宄领域缺乏一套适合柱状黄杆菌的遗传操作系 统。
[0004] 目前，在许多致病菌如致病性大肠杆菌、沙门氏菌、爱德华氏菌中，均有一套完善 的可用于毒力因子和致病机理研宄的遗传操作系统。可通过缺失突变的手段对目的基因进 行敲除和功能互补，从而深入开展对目的基因的功能研宄并阐明其在细菌致病过程中所发 挥的作用。而在柱状黄杆菌的研宄过程中，由于缺乏合适的遗传操作系统，目前只能实现对 目的基因进行同源重组和插入失活（Starosciketal，2008;Zhangetal.，2012)，对于目 的基因进行定向敲除和功能互补一直未能取得成功。因此，也限制和阻碍了对该菌在毒力 因子、致病机理和制备毒力基因缺失弱毒疫苗的研宄。
[0005] 本发明的目的在于构建一个能够用于黄杆菌尤其是柱状黄杆菌目的基因的开放 阅读框内突变、真正实现目的基因的定向敲除和非极性缺失突变的质粒，并优化一种使用 该质粒开展研宄的方法。从而为深入开展对该菌功能基因的研宄、阐明致病机理和制备毒 力基因缺失弱毒疫苗提供一个有利的工具。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒pMS75(本发明或称自杀 质粒）。该质粒共由7715个碱基对组成（SEQIDNO. 1所示），其中包含了在大肠杆菌中复 制所需的复制区域和能够正常表达的抗性基因；在柱状黄杆菌中能够正常表达的抗生素抗 性基因和负选择标记基因（SEQIDN0. 2所不序列包含所述的负选择标记基因）。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒的应用。运用本 发明所获得的质粒，通过将待缺失基因的上下游序列克隆至载体并导入柱状黄杆菌，可在 该菌中发生两次同源重组，最终实现对目的基因的框内缺失突变和功能敲除。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：
[0009] -种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒，制备方法包括：
[0010] (1)穿梭质粒pCP23(Agaral et al，1997)改造为线性载体
[0011] 可通过两种方法进行：一是将分离纯化的穿梭质粒PCP23用SacI和Kpnl进行双 酶切，电泳结束后将大小为6103bp的片段切下，回收后即为pCP23线性载体。二是用引物 扩增穿梭质粒PCP23的除黄杆菌复制区域以外的序列。该载体置4°C保存备用。
[0012] (2)含负选择标记的自杀质粒的构建
[0013] 将SEQIDN0. 2所示核苷酸序列（含有负选择标记基因片段）与pCP23线性载体 定向连接。取连接产物转化大肠杆菌，用氨苄青霉素的LB平板筛选目的菌落。挑取目的 菌落在氨苄青霉素的液体培养基中进行扩增培养，即得一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒 PMS75,本发明或称为自杀质粒，其序列为SEQIDNO. 1所示。
[0014] 一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒的应用，包括利用该质粒定向敲除柱状黄杆菌 的目的基因构建基因缺失株；或构建柱状黄杆菌基因缺失弱毒疫苗。
[0015] 具体操作过程包括：
[0016] (1)确定待缺失DNA序列
[0017] 通过生物信息学分析以确定待缺失的基因的功能结构域，并初步确定待缺失的 DNA片段长度。
[0018] (2)待缺失DNA序列的上游序列选择（本发明或称为A片段）
[0019] 用于同源重组的待缺失DNA的上游序列需大于或等于1.8kb且小于或等于2.5kb， 其中目的基因开放阅读框的第一个碱基至待缺失DNA序列之前的最后一个碱基应为3的倍 数。
[0020] (3)待缺失DNA序列的下游序列选择（本发明或称为B片段）
[0021] 用于同源重组的待缺失DNA的下游序列需大于或等于1.8kb且小于或等于2.5kb， 其中待缺失DNA序列之后的第一个碱基至目的基因开放阅读框的最后一个碱基应为3的倍 数。
[0022] (4)将待缺失DNA区域的上下游序列克隆至含负选择标记的自杀质粒
[0023] 通过酶切连接法将待缺失DNA序列的上下游序列（A、B片段）克隆至自杀质粒。
[0024] 具体的，将A、B片段克隆至自杀质粒的方法包括：PCR方法扩增A片段时，在A片段 的正反向引物上各引入一个酶切位点，这两个酶切位点应不相同；在扩增B片段时，在B片 段的正反向引物上也分别引入一个酶切位点，其中B片段的正向引物的酶切位点应与A片 段反向引物的酶切位点相同。通过酶切连接的方法将A或B片段通过酶切、连接的方法连 入自杀质粒，并转化大肠杆菌。将筛选得到的阳性克隆提取质粒后，同法将B或A片段连入 该质粒。将连接产物转化大肠杆菌后，通过氨苄青霉素平板筛选和PCR检测确定含A、B片 段的自杀质粒的大肠杆菌阳性菌株。将该大肠杆菌菌株大量培养后，提取质粒即可得到含 待缺失DNA上下游同源序列的自杀质粒。
[0025] (5)将含待缺失DNA序列上下游同源序列的自杀质粒转入柱状黄杆菌
[0026] 将上一步提取到的质粒转化到能够进行接合转移的大肠杆菌（Escherichia coli)菌株如SM10或S17-1A中。将该含该质粒的大肠杆菌菌株与柱状黄杆菌等体积培养 至对数生长早期，离心收集菌体。用Shieh培养基将两种菌体分别洗涤两次后混合重悬，悬 液滴至预先铺有灭菌NC膜的Shieh平板上。将该平板在28°C静置培养20-24h。
[0027] (6)筛选在柱状黄杆菌中发生第一次同源重组的菌株
[0028] 将完成接合转移的细菌混合物从NC膜上刮下来，并用不含抗生素的Shieh培养基 重悬。悬液涂布含抗生素的Shieh平板，28°C静置培养至有菌落长出。此时长出的菌落即 为发生第一次同源重组后的菌株。
[0029] (7)筛选在柱状黄杆菌中发生第二次同源重组的菌株
[0030] 将发生第一次同源重组的菌株在无抗生素的Shieh液体培养基中培养至对数生 长期，用该菌液涂布含10%蔗糖的Shieh平板。待菌落长出后，挑选单菌落培养至对数生长 期。将该培养物分别在含四环素和不含四环素的平板上划线培养。在两种平板上都能生长 的菌株丢弃；将只能在不含四环素的Shieh平板上生长的该菌株保留供进一步筛选。
[0031] (8)缺失突变株筛选和确认
[0032] 用待缺失DNA区域的序列为模板设计引物，菌液PCR方法扩增发生同源重组的菌 株，如果扩增到目的条带，表明该菌株回复野生型，应丢弃；如果未能扩增到目的条带，表明 该菌株可能已发生缺失突变，保留该菌株供进一步检测和确认。
[0033] 用待缺失DN