Pgⅱ与mbp融合蛋白的可溶性分泌表达及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组PGII的融合蛋白可溶性分泌 表达及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 胃蛋白酶原（Pepsinogen，PG)是胃液中胃蛋白酶的酶前体，在pH1-5的酸性条件 下转化成有活性的胃蛋白酶。根据其生化特性和免疫原性可将其分为2个亚群，组分1-5的 免疫原性相同，称为PGI(又称PGA)，主要由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；组分6和7 被称PGII(又称为PGC)，除了由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌外，贲门腺和胃窦的幽 门腺的黏液颈细胞以及十二指肠上段也能产生PGII。
[0003] 正常情况下，胃粘膜产生的胃蛋白酶原大部分进入胃腔，酸化后活化成胃蛋白酶， 对蛋白质进行消化，约有1%的PG透过胃黏膜毛细血管进入血液循环。血清PGI和PGII 反映胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映胃黏膜不同部位的分泌功能。当胃黏膜发生病 理变化时，血清PG含量也随之改变。因此，监测血清中PG的浓度可以作为监测胃黏膜状态 的手段。
[0004] 血清PG水平反映了不同部位胃粘膜的形态和功能：PGI是检测胃泌酸腺细胞功能 的指针，胃酸分泌增多PGI升高，分泌减少或胃粘膜腺体萎缩PGI降低；PGII与胃底粘膜 病变的相关性较大（相对于胃窦粘膜），其升高与胃底腺管萎缩、胃上皮化生或假幽门腺化 生、异型增值有关；PGI/II比值进行性降低与胃粘膜萎缩性进展相关。因此联合测定PGI和 PGII比值可起到胃底腺粘膜"血清学活枪"的作用。
[0005] 胃蛋白酶原是分子量为42KDa的单链多肽，含有3个连续的二硫键，在原核表达系 统中胞内表达很难正确折叠，蛋白以无活性的包涵体形式存在，复性后活性很低。本发明利 用malE天然信号肽将PGII引导至大肠杆菌周至，实现了PGII蛋白的可溶性分泌表达， 重组表达的PGII蛋白具有很好的免疫原性，本发明中的PGII蛋白的N端融合了MBP蛋 白，其在提高PGII融合蛋白表达量的同时还改善了PGII蛋白不稳定容易降解的特性。
[0006] 目前，人胃蛋白酶原主要从人胃组织中提取，来源有限，成本高昂，很难实现产业 化，所以重组表达高活性的胃蛋白酶原具有很好的市场前景。
【发明内容】
[0007] 本发明公开一种利用大肠杆菌表达系统分泌表达重组人PG II融合蛋白的方法； 同时还提供了该融合蛋白的制备方法。
[0008] 本发明还公开了使用上述方法获得的PGII融合蛋白在制备PGII的单克隆抗体 中作为免疫原，以及在胃蛋白酶原诊断试剂中的应用。
【附图说明】
[0009] 图1.本发明的包含PGII基因的重组质粒载体构建图；
[0010] 图2.本发明的重组表达PGII融合蛋白的表达及纯化SDS-PAGE电泳图；
[0011] 图3.本发明纯化获得的融合蛋白经FactorXa酶切的SDS-PAGE电泳图；
[0012] 图4.本发明制备的融合蛋白作为免疫原所制备的PGII单抗的效价；
[0013] 图5.本发明制备的融合蛋白的PGII活性检测。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1:PGII编码序列的扩增
[0015] 使用PCR方法从质粒PET32a-PGII(本公司构建）扩增出PGII的编码序列，所 用的引物PGC5的5'端添加了BamHI的酶切位点，引物PGC3的5'端添加了Hindlll的酶 切位点。
[0016] PGC5 :5'-aagggatccggtagcggctctggctcgggttctggcgcagttgtcaaggttcctttga ag-3'
[0017] PGC3 ： 5? -aagaagcttttagtggtggtggtggtggtggtggtgagcagcggtagcaaatccgac-3?
[0018] 100y1的PCR反应体系中加入1y1的LaTaqDNA聚合酶（TaKaRa)，10yM的 PGC5和PGC3各4y1，2. 5mM的dNTP加入8y1，10XPCR反应缓冲液加入10y1。PCR的反 应条件为：94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，57 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟30秒，然后 回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的 目的条带，然后将目的条带切下，溶胶回收。
[0019] 实施例2 :MBP-PGII融合蛋白表达载体的构建
[0020] 取2yg实施例1中PCR扩增得到的PGII编码序列，建立50yl的双酶切体 系，具体如下：2yg的PGII编码序列，5yl的10XK酶切反应缓冲液，1. 5ylBamHI和 1. 5y1的HindIII，加双蒸水至总体积50y1，37°C水浴中反应6小时。使用凝胶回收试剂 盒（OMEGABI0-TEK)纯化PGII编码序列的双酶切产物。
[0021] 取600ng的pMAL-p2X(NEB公司）载体，建立50y1的双酶切体系，具体如下：600ng 的pMAL-p2X载体，5y1的10XK酶切反应缓冲液，1. 5y1BamHI的和1. 5y1的Hindlll， 加双蒸水至总体积50y1，37°C水浴中反应6小时。使用凝胶回收试剂盒（OMEGABIO-TEK) 纯化pMAL-p2X载体双酶切产物。
[0022] 连接反应：取4y1经过纯化的pMAL-p2X的BamHI和Hindlll双酶切产物，加入 6y1经过纯化的PGII的双酶切产物，1y1的T4DNA连接酶（TaKaRa)和1y1的10XT4 DNA连接酶反应缓冲液，16°C水浴中连接过夜。
[0023] 连接产物转化大肠杆菌DH5a，然后挑取克隆，送公司测序（感受态DH5a的制备 方法及转化方法依照"分子克隆实验指南"第二版所述。J.萨姆布鲁克著）。所得重组质 粒命名为pMAL-PGII。
[0024] 实施例3 :MBP_PGII融合蛋白的表达
[0025] 将所获得的pMAL-PGII质粒转化E.coliBL21 (DE3) (Novagen公司）感受态细胞。 细菌的诱导表达：挑取克隆接种于l〇〇ml含100yg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，在 37°C、250rpm条件下培养过夜，制备种子液。
[0026] 取10ml种子液接种入装有1LLB-Amp培养基的3L锥形瓶，37°C培养至0D_为 0. 5左右，然后加入终浓度为0. 5mM的IPTG，将温度降为28°C诱导8h后，12000g离心获得 菌体。制备全菌电泳样品，蛋白电泳分析目的蛋白表达情况。SDS-PAGE电泳的样品制备方 法、电泳电压、凝胶染色和脱色的方法见"分子克隆实验指南"第二版所述。J.萨姆布鲁克 著。
[0027] 实施例4 :含有MBP-PG II基因的大肠杆菌的周至蛋白抽提
[0028] 高渗溶液处理菌体：加入1/10菌液体积高渗液（20mMTris、20% (W/V)鹿糖、ImM EDTA，pH8. 0)，重悬菌体，冰上放置10分钟，12000g离心15分钟，收集上清；
[0029]低渗浓液处理菌体：加入1/10菌液体积低渗液（0.ImMMgCl2)，重悬菌体，冰上放 置10分钟，12000g离心15分钟，收集上清。
[0030] 实施例5 :MBP-PGII融合蛋白的纯化
[0031] 1)QFF纯化蛋白：高、低渗处理液混合后上样，用5-10个柱体积的Elution Buffer(20mMTris、lMNaCl)洗脱蛋白；
[0032] 2)HiTrapChelatingHP(镍离子螯合亲和柱，GE)纯化蛋白：上样后，先用Wash Buffer(20mMTris，0.5MNaCl、80mMimidazole，pH8.0)冲洗掉杂蛋白，然后用Elution Buffer(20mMTris，0.5MNaCl、300mMimidazole，pH8.0)洗脱目的蛋白。
[0033] 实施例6 :MBP_PG II融合蛋白酶切鉴定
[0034] 制备的MBP-PGII融合蛋白具有FactorXa的酶切位点，用FactorXa对获得的融 合蛋白进行酶切鉴定，具体酶切方法：MBP-PGII融合蛋白与FactorXa质量比为50 : 1， 酶切缓冲液（20mMTris，100mMNaCl、2mMCaCl2,pH8. 0)，23°C，酶切 6h。用上述方法可以 去除BMP标签蛋白，制备天然大小的PGII重组蛋白。
[0035] 实施例7 :MBP_PG II融合蛋白免疫小鼠，制备单克隆抗体
[0036] 1)免疫小鼠：制备的重组MBP-PGII融合蛋白按每只小鼠100yg蛋白量与弗氏 完全佐剂等体积混匀乳化，皮下免疫；3周后，二次免疫，50yg蛋白量与弗氏不完全佐剂等 体积混匀，乳化后，腹腔注射免疫；2周后，三次免疫，方法同二次免疫；7天后，采尾静脉血 检测，效价大于24W。
[0037] 2)单克隆抗体制备：取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，进行HAT 选择性培养，利用ELISA方法筛选出阳性细胞株，进行三次单克隆化培养，得到稳定分泌抗 体的单克隆细胞株，将每株单克隆抗体杂交瘤细胞株进行扩大培养后，制备腹水。
[0038] 3)抗体纯化及效价检测：采集的腹水经过proteinA柱纯化，获得高纯的小鼠单 抗蛋白。分别包被5ug/mlMBP-PG11融合蛋白和MBP蛋白，利用ELISA检测制备的腹水抗 体效价。
[0039] 实施例8 :MBP_PG II融合蛋白免疫原性检测
[0040]MBP-PGII融合蛋白340ng/ml为起始检测浓度，连续对半稀释，用PGII免疫比浊 试剂（九强生物公司）定量不同浓度融合蛋白的PGII含量。
【主权项】
1. 一种人PG II融合蛋白的原核表达质粒的构建，其特征是将PG II的基因通过表达 质粒pMAL-p2X或pMAL-p5X导入大肠杆菌表达菌株，IPTG诱导PG II融合蛋白分泌至大肠 杆菌的周至内从而获得可溶性表达。2. 权利要求1所述的表达质粒，其特征是质粒包含Ptac启动子-maleE信号肽-malE 基因-FactorXa酶切位点-PG II基因_8XHis Tag的序列。3. -种利用权利要求1-2所述的重组质粒表达大肠杆菌周至腔来源的MBP-PG II的 融合蛋白，其特征在于PG II的genebank号为J04443. 1，融合蛋白具有序列表中SEQ ID No 1氨基酸序列；或者是将融合蛋白的氨基酸残基在不改变融合蛋白特性的前提下，进行 部分氨基酸的取代、缺失或添加所得到重组蛋白。4. 根据权利要求1-3所述的表达载体中含有maleE蛋白天然信号肽，用于MBP-PG II 的分泌表达，其特征在于信号肽具有序列表中SEQ ID No 2氨基酸序列。5. 根据权利要求1-4所述的重组表达的PG II融合蛋白，其N端融合BMP蛋白，用以提 尚融合蛋白表达量及稳定融合蛋白。6. -种利用权利要求1-5任一项所述的表达质粒导入表达的宿主菌包括以下大肠杆 菌工程菌株：DH5a、T0P10、TB1 和 BL21。7. -种权利要求1-6所述重组可溶性表达PG II的融合蛋白的制备方法，其特征在于， 包括以下步骤： (1) 筛选高效表达MBP-PG II融合蛋白的菌株； (2) 将阳性菌株用LB培养基培养，IPTG诱导获得含有MBP-PG II融合蛋白的菌液； (3) 离心收集菌体，高低渗溶液处理菌体，抽提周至蛋白； (4) 阴离子交换层析柱和金属离子螯合亲和层析柱纯化融合蛋白。8. -种权利要求1-7制备得到的PG II融合蛋白在制备PG II的单克隆抗体中作为免 疫原，以及在胃蛋白酶原诊断试剂中的应用。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种人胃蛋白酶原II(PG II)与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性分泌表达；提供了该融合蛋白的制备方法。本发明还公开了上述重组BMP-PG II融合蛋白在制备单克隆抗体，胃蛋白酶原II试剂盒校准品中的应用。本发明利用了Ptac启动子、malE信号肽、麦芽糖结合蛋白等元件实现了PG II在大肠杆菌周至内的可溶性分泌表达，不仅大大提高了来自原核表达系统的重组人PG II蛋白的免疫原活性，并且有效的降低了重组PG II的制备成本。
【IPC分类】G01N33/573, C07K16/40, C07K19/00, G01N33/577, C12N15/70, C12R1/19
【公开号】CN104962573
【申请号】CN201510399896
【发明人】孔毅荣, 于海双, 李小红
【申请人】北京嘉万生物技术有限公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月8日