一种转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药，特别是一种转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒 的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 光热治疗技术是一种新兴的微创技术，是利用光热转换材料把近红外激光的能量 转换成热能，实现局部高温，从而杀死癌细胞，而对正常组织细胞基本上没有影响，因此在 肿瘤治疗上具有良好的应用前景。CuS纳米作为一种新的光热转换材料，具有很强的近红 外吸收和高的光热转换效率，并且CuS纳米粒子能够被生物体所降解，无明显生物毒性，因 此作为光热转换材料在肿瘤治疗方面获得了广泛的关注。硫化铜纳米粒在近红外光下可以 进行光催化效应产生活性氧进行光动力学治疗；利用硫化铜纳米粒子在近红区域的吸收特 性，将该粒子作为成像造影剂应用于光声成像以及X光成像对肿瘤部位进行诊断治疗。通 过将光热治疗、光动力学治疗、化疗、光声成像结合起来可有效降低副作用，并增强肿瘤治 疗效果。
[0003] 青蒿琥酯（Artesunate，AS)是从天然植物青蒿中提取的一种含内过氧化基团的 倍半萜内酯化合物，是目前常用的抗疟特效药之一。20世纪90年代以来，科学家发现除良 好抗疟性之外，青蒿琥酯对多种肿瘤细胞的生长具有显著的抑制作用，而对正常组织细胞 的毒性较低，同时与传统化学治疗药物有协同增效作用且无交叉耐药性。青蒿琥酯抗肿瘤 作用的机理包括抑制或杀伤肿瘤细胞、阻滞细胞周期、抑制血管生成、Fe2+诱导的细胞凋亡 等，其中Fe2+诱导的细胞凋亡机理被广泛接受，即Fe 3+与Tf形成的全铁转铁蛋白（holo - Tf)进入细胞的胞吞体后Tf的构象发生改变形成脱铁转铁蛋白（apo - Tf)，并释放出Fe' 释放的Fe3+在铁还原酶STEAP3的作用下生成Fe2+，使AS内的过氧键断裂，产生大量自由基， 破坏细胞膜和生物大分子，引起DNA断裂，从而诱导细胞凋亡。由此可见，如果将光热治疗 和化疗纳米平台修饰革G向基团转铁蛋白，可以革El向将抗癌药物青蒿琥酯和光热试剂硫化铜 传输到癌症部分，从而进一步提高治疗效果，减小对正常组织和细胞的毒副作用。但至今未 见有此技术的公开报导。
【发明内容】
[0004] 针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种转铁蛋白修 饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的制备方法及其应用，可有效解决同时具有靶向、 光热治疗、光动力学治疗、光声成像、药物治疗和产生DMR效应，实现诊断和治疗一体化的 问题。
[0005] 本发明解决的技术方案是，首先合成中空介孔硫化铜纳米颗粒，在中空介孔结构 的硫化铜内部负载药物青蒿琥酯，再通过静电吸附修饰上转铁蛋白，制得转铁蛋白修饰的 中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒，具体步骤如下：
[0006] (I)、将 0· 8-0. 9g 的 CuSO4 ·5Η20 溶解于 180-220ml 水中，搅拌加入 4· 5-5. 5g 聚乙 烯吡咯烷酮，室温反应10~20min，加入l-2g氢氧化钠，搅拌均匀，滴加10-20ml水合肼， 搅拌10~15min，再加入I. 2-1. 4g硫酸铵，搅拌lh，用超纯水离心水洗至中性，冷冻干燥 46-50h，得到中空介孔硫化铜纳米颗粒；
[0007] (2)、将中空介孔硫化铜纳米颗粒25-35mg分散于pH7~9的磷酸盐缓冲液 25-30ml中，搅拌下加入110-130mg青蒿琥酯，继续搅拌24h，得负载药物青蒿琥酯的硫化铜 纳米粒（AS/CuS);
[0008] (3)、将10_20mg转铁蛋白加入pH7~9的磷酸盐缓冲液8-12ml中，搅拌溶解，随后 加入到上述的负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒（AS/CuS)中，搅拌24h，用质量浓度20% 乙醇透析12h，除去游离的青蒿琥酯，即得转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米 粒（AS/Tf-CuS)。
[0009] 所述的转铁蛋白为单链糖蛋白，分子量为7. 5~7. 9万，铁含量为300~600ppm ;
[0010] 所述的转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒粒径为190-200nm ;
[0011] 所述的青蒿琥酯的载药量为23 %~27 %，转铁蛋白与硫化铜的质量比为1:2~4。
[0012] 本发明方法制备的转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒可用于 红外光热治疗，同时还可以进行光动力学治疗、光声成像，光热治疗-光动力学治疗-化 疗-肿瘤诊断综合治疗一体化治疗，实现在制备肿瘤光热治疗-光动力学治疗-化疗-诊 断综合一体化药物中的应用。
[0013] 本发明合成工艺简单，通过癌周注射后，产生了 DMR效应（Diffusion Molecular Retention)，即经历缓慢的血管摄取和广泛的间隙扩散，通过在癌细胞膜表面大量表达的 转铁蛋白受体识别后保留在肿瘤部位，将抗癌药物青蒿琥酯传送到癌症部位，利用转铁蛋 白与青蒿琥酯的协同增效实现靶向抗肿瘤作用，从而进一步提高治疗效果，减小对正常组 织和细胞的毒副作用，不仅具有红外光热治疗作用，同时还可以进行光动力学治疗、光声成 像，实现光热治疗-光动力学治疗-化疗-肿瘤诊断综合治疗一体化，是治疗肿瘤药物上的 一大创新，经济和社会效益巨大。
【具体实施方式】
[0014] 以下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0015] 实施例1
[0016] 本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：
[0017] (1)、将0· 85g的CuSO4 ·5Η20溶解于200ml水中，搅拌加入5. Og聚乙烯吡咯烷酮， 室温反应10~20min，加入I. 5g氢氧化钠，搅拌均勾，用注射器滴加15ml水合肼，搅拌10~ 15min，再加入I. 38g硫酸铵，搅拌lh，用超纯水离心水洗至中性，冷冻干燥48h，得中空介孔 硫化铜纳米颗粒；
[0018] (2)、将中空介孔硫化铜纳米颗粒30mg探头超声分散于pH7~9的磷酸盐缓冲液 28ml中，搅拌下加入120mg青蒿琥酯，搅拌24h，得负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒（AS/ CuS)；
[0019] (3)、将15mg转铁蛋白加入pH7~9的磷酸盐缓冲液IOml中，搅拌溶解，随后加 入到上述的负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒（AS/CuS)中，搅拌24h，用质量浓度20%乙 醇透析12h，除去游离的青蒿琥酯，即得转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒 (AS/Tf-CuS)。
[0020] 实施例2
[0021] 本发明在具体实施中，也可由以下步骤实现：
[0022] (1)、将0· 8g的CuSO4 · 5H20溶解于180ml水中，搅拌加入4. 5g聚乙烯吡咯烷酮， 室温反应10~20min，加入Ig氢氧化钠，搅拌均匀，用注射器滴加 IOml水合肼，搅拌10~ 15min，再加入I. 2g硫酸铵，搅拌lh，用超纯水离心水洗至中性，冷冻干燥46-50h，得到中空 介孔硫化铜纳米颗粒；
[0023] (2)、将中空介孔硫化铜纳米颗粒25mg探头超声分散于pH7~9的磷酸盐缓冲液 25ml中，搅拌下加入IlOmg青蒿琥酯，继续搅拌24h，得负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒 (AS/CuS)；
[0024] (3)、将IOmg转铁蛋白加入pH7~9的磷酸盐缓冲液8ml中，搅拌溶解，随后加入到 上述的负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒（AS/CuS)中，搅拌24h，用质量浓度20%乙醇透 析12h，除去游离的青蒿琥酯，即得转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒（AS/ Tf-CuS)〇
[0025] 实施例3
[0026] 本发明在具体实施中，还可由以下步骤实现：
[0027] (1)、将0. 9g的CuSO4 · 5H20溶解于220ml水中，搅拌加入5. 5g聚乙烯吡咯烷酮， 室温反应10~20min，加入2g氢氧化钠，搅拌均匀，用注射器滴加20ml水合肼，搅拌10~ 15min，再加入I. 4g硫酸铵，搅拌lh，用超纯水离心洗至中性，冷冻干燥46-50h，得到中空介 孔硫化铜纳米颗粒；
[0028] (2)、将中空介孔硫化铜纳米颗粒35mg探头超声分散于pH7~9的磷酸盐缓冲液 30ml中，搅拌下加入130mg