被修饰的转铁蛋白融合蛋白的制作方法

专利名称：被修饰的转铁蛋白融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及血清稳定性或体内循环半衰期被提高的治疗性蛋白或肽以及可溶的毒素受体片段，它们被融合或插入到被修饰以减少或抑制糖基化、铁结合和/或转铁蛋白受体结合的转铁蛋白分子上。特别地，本发明包括被融合到或插入到转铁蛋白分子或被修饰的转铁蛋白分子上的IFN-β、GLP-1、EMP1和T-20。本发明还包括抗毒素融合蛋白，其包含被融合到或插入到转铁蛋白分子或被修饰的转铁蛋白分子上的突触结合蛋白1的片段。
背景技术：
天然状态下的或者重组制备的治疗性蛋白和肽通常是不稳定的分子，具有短的血清稳定性周期或者短的体内循环半衰期。此外，当这些分子被配制特别是在水溶液中用于诊断和治疗目的时，通常是非常不稳定的。
只有极少数实用办法可以被用于延长或提高蛋白的治疗性分子的体内或体外稳定性。聚乙二醇(PEG)是可以结合到蛋白质上的物质，从而使该蛋白质具有长期、持续的活性。如果蛋白质活性通过结合到PEG上被延长，那么就可以降低施用该蛋白质的频率。但是，PEG结合常常降低或破坏蛋白质的治疗活性。在有些情况下，PEG结合会降低蛋白质的免疫原性，而在其它情况下可能提高其免疫原性。
还可以通过融合到能够延长治疗性蛋白质的体内循环半衰期的蛋白质上来稳定治疗性蛋白质或肽。例如，与处于未被融合状态下的治疗性蛋白质相比，被融合到白蛋白或抗体片段上的治疗性蛋白质的体内循环半衰期被延长，参见美国专利5,876,969和5,766,883。
另一种血清蛋白，糖基化的人转铁蛋白(Tf)也已经被用于与治疗性蛋白质一起融合，来靶向递送到细胞内部或用于携带试剂跨越血脑屏障。通过将全长Tf融合到因子上，这些包含被糖基化的人Tf的融合蛋白已经被用于引导神经生长因子(NGF)或睫状神经营养因子(CNTF)跨越血脑屏障，参见美国专利5,672,683和5977,307。在这些融合蛋白中，该分子的Tf部分被糖基化并结合两个铁原子，铁原子是Tf结合到细胞上的受体所需的，并且如这些专利的发明人所述，Tf引导递送NGF或CNTF跨越血脑屏障。已经通过将HIV-1蛋白酶靶向序列插入到糖基化转铁蛋白的外露表面环上，研究制备通过Tf受体靶向递送到细胞内部的另一种形式的Tf融合物的可能性，已经制备了转铁蛋白融合蛋白(Ali等(1999)J.Biol.Chem.274(34)24066-24073)。
血清转铁蛋白(Tf)是分子量为80,000道尔顿的单聚体糖蛋白，其在循环中结合铁，并通过转铁蛋白受体(TfR)将铁转运到各种组织中(Aisen等(1980)Ann.Rev.Biochem.49357-393；MacGillivray等(1981)J.Biol.Chem.2583543-3553，美国专利5,026,651)。Tf是最常见的血清分子之一，包含多达约5-10％的总血清蛋白。在酗酒个体的血液中，存在高水平的缺乏糖的转铁蛋白，并且这种转铁蛋白的半衰期(约14-17天)比被糖基化的转铁蛋白(约7-10天)更长。参见van Eijk等(1983)Clin.Chim.Acta 132167-171，Stibler(1991)Clin.Chem.372029-2037(1991)，Arndt(2001)Clin.Chem.47(1)13-27和Stibler等″Carbohydrate-deficient consumption″，Advances in the Biosciences，(Nordmann等编辑)，Pergamon，1988，71，353-357)。
Tf的结构已经被充分表征，受体结合、铁结合及释放以及碳酸铁的结合的机制已经被阐述(美国专利5,026,651、5,986,067和MacGillivray等(1983)J.Biol.Chem.258(6)3543-3546)。
转铁蛋白和结合转铁蛋白受体的抗体也已经被用于递送或携带毒性试剂到肿瘤细胞中，作为癌症治疗的方法(Baselga和Mendelsohn，1994)，而且转铁蛋白也被用作非病毒性基因治疗载体，将DNA递送到细胞中(Frank等1994；Wagner等1992)。使用转铁蛋白作为进入点来将蛋白质递送到中枢神经系统(CNS)中的能力也已经用数种蛋白质和肽证明，包括CD4(Walus等1996)、脑源神经营养因子(Pardridge等，1994)、神经胶质来源的神经营养因子(Albeck等)、肠道血管(vasointestinal)肽类似物(Bickel等，1993)、β-淀粉状蛋白肽(Saito等，1995)，以及反义寡核苷酸(Pardridge等1995)。
但是，还没有修饰或遗传工程化转铁蛋白融合蛋白来延长治疗性蛋白或肽的体内循环半衰期，或者通过减少或抑制Tf部分的糖基化或者减少或防止铁和/或Tf受体的结合来提高生物利用度。
发明概述如下文的更加详细的描述，本发明包括包含至少一种治疗性蛋白质、多肽或肽单位(peptide entity)的被修饰的Tf融合蛋白，其中Tf部分被遗传工程化来提高该分子的体内循环半衰期或生物利用度。本发明还包括包含该融合蛋白的药物制剂和组合物，通过融合到被修饰的转铁蛋白上来延长治疗性蛋白质的体内循环半衰期和生物利用度的方法，编码被修饰的Tf融合蛋白的核酸分子等。本发明的另一个方面涉及用被修饰的Tf融合蛋白治疗患者的方法。
优选地，被修饰的Tf融合蛋白包含人转铁蛋白Tf部分，该部分已被修饰以减少或防止糖基化和/或铁的结合和受体的结合。
本发明提供包含被融合到或插入到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白分子上的治疗性蛋白质的融合蛋白。优选地，本发明的治疗性蛋白包括β-干扰素(β-IFN)、胰高血糖素样肽(GLP-1)、EPO(促红细胞生成素)模拟肽(EMP1)和T-20。
本发明还提供包含结合毒素的可溶的毒素受体片段的融合蛋白，该片段被融合到或插入到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白分子上。可溶的毒素受体可以是突触结合蛋白1，而可溶片段是氨基酸1-53(SEQ ID NO4)。
附图简介附

图1显示人(Hu)转铁蛋白(Tf)(SEQ ID NO3)的N-结构域和C-结构域的比对，相似和相同部分突出显示。
附图2A-2B显示来自不同物种的转铁蛋白序列之间的比对。淡阴影相似；浓阴影相同(SEQ ID NO84-90)。
附图3显示治疗性蛋白、多肽或肽的大量Tf表面暴露的插入位点的位置。
附图4显示mTf-T20在两只兔子中的药物代谢动力学。
详细描述总体描述本发明部分地基于发明人发现可以通过将治疗性蛋白质基因融合到转铁蛋白、被修饰的转铁蛋白，或其足以延长治疗性蛋白质在血清中的半衰期的部分上来稳定治疗性蛋白质，以提高治疗性蛋白质的体内血清半衰期和/或活性。被修饰的转铁蛋白融合蛋白包括被共价连接到治疗性蛋白质或肽上的转铁蛋白或者结构域，其中与野生型转铁蛋白序列相比，转铁蛋白部分被修饰以含有一个或多个氨基酸取代、插入或删除。在一个实施方案中，Tf融合蛋白被工程化来减少或防止Tf或Tf结构域中的糖基化。在另一个实施方案中，Tf蛋白或Tf结构域被修饰以减少或不结合铁或碳酸铁，或者对Tf受体(TfR)的亲合力降低或不结合Tf受体。
本发明包括的治疗性蛋白质包括，但是不限于多肽、抗体、肽、或片段或其变体。优选地，本发明的治疗性蛋白包括β-干扰素(β-IFN)、胰高血糖素样肽(GLP-1)、EPO(促红细胞生成素)模拟肽(EMP1)和T-20。
本发明还包括包含被融合到或插入到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白中的可溶的毒素受体片段的抗毒素融合蛋白。优选地，可溶的毒素受体的片段结合特定毒素。在一个实施方案中，可溶的毒素受体的片段是突触结合蛋白1的氨基酸1-53(SEQ ID NO4)。
因此，本发明包括转铁蛋白融合蛋白，包含融合蛋白的治疗性组合物，和通过施用融合蛋白来治疗、预防或缓解疾病或紊乱的方法。本发明的转铁蛋白融合蛋白包括至少治疗性蛋白质的片段或变体和至少被修饰的转铁蛋白的片段或变体，它们相互结合在一起，优选通过基因融合(即，通过核酸翻译来生成转铁蛋白融合蛋白，其中编码治疗性蛋白质的全部或部分的多核苷酸在读框内与编码被修饰的转铁蛋白的全部或部分的多核苷酸相连接)或者相互化学偶联。一旦治疗性蛋白质和转铁蛋白是转铁蛋白融合蛋白的一部分时，可以被称作转铁蛋白融合蛋白的“部分”、“区域”或“半分子”(例如“治疗性蛋白部分”或者“转铁蛋白部分”)。
在一个实施方案中，本发明提供一种转铁蛋白融合蛋白，其包含或者可选择地由治疗性蛋白质和被修饰的血清转铁蛋白组成。在其它实施方案中，本发明提供一种转铁蛋白融合蛋白，其包含或者可选择地由治疗性蛋白质和被修饰的转铁蛋白的生物活性和/或治疗活性片段组成。在其它实施方案中，本发明提供一种转铁蛋白融合蛋白，其包含或者可选择地由治疗性蛋白质和被修饰的转铁蛋白的生物活性和/或治疗活性变体组成。在另一个实施方案中，本发明提供一种包含治疗性蛋白质以及被修饰的转铁蛋白的生物活性和/或治疗活性片段的转铁蛋白融合蛋白。
除非另外定义，在此所用的所有科学技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。虽然任何类似或等同于在此所描述的那些方法和材料的方法和材料可以被用于实施和验证本发明，优选的方法和材料被描述。
定义如在此所用，转铁蛋白序列中的“相应氨基酸”或“等价氨基酸”是通过比对来最大化第一条转铁蛋白序列和至少第二条转铁蛋白序列之间的相同性和相似性而确定的。用于确定第二条转铁蛋白序列中的等价氨基酸的编号是基于用于确定第一条转铁蛋白序列中的相应氨基酸的编号。在某些情况下，这些短语被用于描述与兔血清转铁蛋白中的特定氨基酸相对的人转铁蛋白中的氨基酸残基。
如在此所用，术语“生物活性”是指治疗性分子、蛋白或肽在生物学范围内(context)(在生物体中或其体外模拟物中)执行的功能或一整套的活性。生物活性可以包括但是不限于要求保护的融合蛋白的治疗性分子部分的功能，例如，但是不限于，诱导从相应细胞系中分泌到细胞外基质，诱导激素分泌，诱导化学向性，诱导有丝分裂，诱导分化，或抑制相应细胞的细胞分裂。如果本发明的融合蛋白或肽具有其治疗性蛋白的天然配对物的一种或多种生物学活性，则融合蛋白或肽被视为具有生物学活性。
如在此所用，“粘合剂”是用于给粉末状物质赋予粘着性质的试剂。粘合剂，或者有时称作“成粒剂”，赋予片剂粘着性，确保片剂在被压缩之后仍保持完整，并且配制具有期望硬度和大小的颗粒来提高流动性。通常被用作结合剂的物质包括淀粉；明胶；糖，例如蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、糖密和乳糖；天然和合成的树胶(gum)，例如阿拉伯树胶、藻酸钠、爱尔兰苔藓提取物、panwar胶、ghatti胶、isapol husks胶、羟甲基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、Veegum、微晶纤维素、微晶葡聚糖、直链淀粉和落叶松阿拉伯树胶等。
如在此所用，术语“载体”是指与组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或者媒介物。这种药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的，例如，花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。
如在此所用，“着色剂”是赋予片剂更令人喜欢的外观，以及在加工过程中帮助生产商控制生产和帮助使用者确定产品的试剂。被批准认证的水溶性FD&C染料的任何一种或其混合物，或者它们的相应色淀可以被用于染色片剂。染色色淀(color lake)是通过将水溶性染料吸附到含水的重金属氧化物上的组合物，产生不溶形式的染料。
如在此所用，“稀释剂”是被添加来提高制剂的体积的惰性物质，使得片剂具有用于压缩的大小。通常所用的稀释剂包括磷酸钙、硫酸钙、乳糖、高岭土、甘露醇、氯化钠、干燥淀粉、糖粉、硅石等。
如在此所用，“分解剂”或“分解质”是便于片剂在被施用后崩解或瓦解的物质。在化学上，作为分解质的物质已经被划分成淀粉、粘土、纤维素或树胶。其它分解剂包括Veegum HV、甲基纤维素、琼脂、斑脱土、纤维素、和木材制品、天然海绵、阳离子交换树脂、褐藻酸、guar胶、柑桔果肉、交联聚乙烯吡咯烷酮、羟甲基纤维素等。
术语“可分散性”或“可分散的”是指干燥粉末的水分含量小于约10％(重量百分比)重量的水分，通常低于约5％重量和优选低于约3％重量；约1.0-5.0pm的块状平均直径(MMD)的颗粒大小，通常1.0-4.0μm MMD和优选1.0-3.0μm MMD；递送剂量约＞30％，通常＞40％，优选＞50％和最优选＞60％；以及气雾剂颗粒大小分布为1.0-5.0μm的块状平均空气动力学直径(MMAD)，通常为1.5-4.5μm MMAD和优选1.5-4.0pm MMAD。
术语“干燥”是指组合物具有使颗粒容易分散在吸入装置中以形成气雾剂的水分含量。这种水分含量通常低于约10％重量(％w)的水分，通常低于约5％w和优选低于约3％w。
如在此所用，“有效量”是指药物或药学活性和试剂的含量，其足以在任何药物治疗中以合理的有益/危险比例(benfit/risk ratio)产生期望的局部或系统性效果和性能。
如在此所用，“调味剂”在化学结构上变化很大，从简单的酯、醇和醛到碳水化合物和复杂的挥发性油脂。几乎可以获得任何类型的合成调味剂。
如在此所用，术语“Tf蛋白片段”或“Tf蛋白”或“Tf蛋白部分”是指包含天然Tf蛋白或其突变体的至少约5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的氨基酸序列。
如在此所用，术语“基因”是指与生物学功能相关的DNA的任何区段。因此，基因包括，但是不限于，编码序列和/或其表达所需的调控序列。基因还可以包括未被表达的DNA片段，例如，构成其它蛋白的识别序列的DNA片段。基因可以从各种来源中获得，包括从目标来源中克隆得到，或从已知的或预测的序列信息中合成，而且包括具有期望参数的被设计的序列。
如在此所用，“异源多核苷酸”或“异源核酸”或“异源基因”或“异源序列”或“外源的DNA区段”是指从特定宿主之外的来源获得的多核苷酸、核酸或DNA区段，或者，如果来自相同来源，则被修饰以区别于其原始形式。宿主细胞中的异源基因包括特定宿主细胞的内在的、但是被修饰的基因。因此，该术语是指细胞的外源或异源的、或者与细胞同源但是存在于该宿主细胞的核酸中的该元件通常不存在的位置上的DNA区段。作为例子，被连接到人Tf序列上的酵母细胞天然信号序列是异源的。
如在此所用，“被分离的”核酸序列是指基本上不含有其它核酸序列的核酸序列，例如通过琼脂糖凝胶电泳确定至少约20％纯度，优选至少约40％纯度，更加优选至少约60％纯度，甚至更加优选约80％纯度，最优选约90％纯度，和甚至最优选约95％纯度。例如，可以通过在遗传工程化中将核酸序列从其天然位置重新定位到其将被复制的不同位置上的标准克隆操作来获得被分离的核酸序列。克隆操作可以包括切除和分离包含编码多肽的核酸序列的期望核酸片段，将该片段插入到载体分子上，和将重组载体插入到宿主细胞中，在宿主细胞中，核酸序列的多个拷贝或克隆被复制。核酸序列可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成来源的或它们的任何组合。
如在此所用，当DNA编码序列被翻译成多肽时，由于DNA编码序列之间的读框内融合，两条或多条编码序列被认为“被连接”或“被融合”。当涉及Tf融合时，术语“融合”包括，但是不限于，至少一种治疗性蛋白、多肽或肽被连接到Tf的N末端，被连接到Tf的C末端和/或被插入到Tf中的任何两个氨基酸之间。
如在此所用，“滑润剂”在片剂加工中具有多种功能的物质，例如提高片剂颗粒的流动率，防止片剂物质附着到冲模和冲床的表面上、减少颗粒间的摩擦和便于片剂从冲模腔内喷射出来。常用的滑润剂包括滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钠、硬脂酸和氢化植物油。滑润剂的典型含量的范围在约0.1％重量到约5％重量。
如在此所用，“被修饰的转铁蛋白”用于此来指与野生型转铁蛋白相比，氨基酸序列具有至少一种修饰的转铁蛋白分子。
如在此所用，“被修饰的转铁蛋白融合蛋白”被用于此是指通过将至少一个被修饰的转铁蛋白分子(或其片段或变体)融合到至少一个治疗性蛋白分子(或其片段或变体)上形成的蛋白质。
如在此所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸及其聚合物。除非特别限定，该术语包括含有与参比核酸具有类似结合特性的天然核苷酸的类似物的核酸，并且以与天然核苷酸相似的方式被代谢。除非另外指出，特定核酸序列还暗指包括其保守性修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及被明确指定的序列。特别地，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个所选择(或全部的)密码子的第三个位置用混合碱基和/或脱氧次黄苷残基取代的序列(Batzer等(1991)NucleicAcid Res.195081；Ohtsuka等(1985)J.Biol.Chem.2602605-2608；Cassol等(1992)；Rossolini等(1994)Mol.Cell.Probes 891-98)。术语核酸与基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。
如在此所用，当DNA区段与另一种DNA区段处于功能性联系中，则被称作是“被可操作地连接的”。例如，信号序列的DNA以参与融合蛋白分泌的前蛋白(preprotein)被表达时，则其被可操作地连接到编码本发明的融合蛋白的DNA上；如果启动子或增强子刺激序列的转录，则被可操作地连接到编码序列上。一般地，被可操作地连接的DNA序列是相邻的，并且在为信号序列或融合蛋白的情况下，为相邻的并在读框内。但是，增强子与转录被其所控制的编码序列可以不必是相邻的。在本文中，连接是通过在便利的限制性位点连接或在被插入到该位置上的连接物或接头上进行连接来完成。
如在此所用，“药学上可接受”是指生理学上耐受的物质和组合物，并且通常在被施用给人时不会产生过敏的或类似不适的反应例如反胃、头昏眼花等。一般地，如在此所用，术语“药学上可接受的”是指被联邦管理机构或政府部门认可的或被列举在美国药典或其它用于动物特别是人的被公认的药典中的。
如在此所用，“药学上的有效量”是被递送给个体来产生期望缓解或治疗作用的含量。该含量特定于各种药物，是其最终的被认可的剂量水平。
如在此所用，术语“粉末”是指由极细的分散固体颗粒组成的组合物，这些颗粒是流动的并且容易分散在吸入装置中，随即被个体吸入，使得颗粒到达肺部以渗透进入肺泡中。因此，该粉末被认为是“可吸入的”。优选平均颗粒大小为直径小于约10微米(μm)，具有相对一致的半球形分布。更加优选地，直径小于约7.5μm和最优选小于约5.0μm。通常，颗粒大小分布在直径约0.1μm和约5pm之间，特别在约0.3μm到约5μm之间。
如在此所用，术语“启动子”是指涉及结合RNA聚合酶来起始转录的DNA区域。
如在此所用，术语“重组体”是指已经用基因或DNA的新组合转化的细胞、组织或生物体。
如在此所用，术语“个体”可以是人、哺乳动物或动物。被治疗的个体是需要治疗的患者。
如在此所用，靶向单位、蛋白质、多肽或肽是指特异地结合到特定细胞类型上[正常(例如，淋巴细胞)或异常例如(癌细胞)]的分子，因而可以被用于将Tf融合蛋白或化合物(药物或细胞毒性剂)特异地靶向该细胞。
如在此所用，“片剂”是含有药物固体药学制剂形式，有或没有合适的稀释剂，通过本领域知晓的压缩或模铸方法来制备。片剂从19世纪后期开始被广泛地使用，随后继续被普及。由于片剂给生产商(例如，生产简单而经济，稳定，包装、运输和分发方便)和患者(例如用量精确、简洁、可携带、味觉柔和，以及容易施用)都带来好处，仍然是一种流行的制剂形式。虽然，片剂最通常为铁饼状的，也可以是圆形的、卵形的、长方形的、圆柱形的或三角形的。它们可以在大小和重量上显著区别，取决于所含药物的含量和特定的施用方法。它们被划分成两种常规类型，(1)压缩片剂和(2)模铸片剂或片剂粉末。除了活性或治疗性成分，片剂含有大量惰性材料或添加剂。第一组这种添加剂包括那些有助于赋予制剂令人满意的压缩特性的材料，包括稀释剂、结合剂和滑润剂。第二组这种添加剂有助于赋予已经制备的片剂其它期望物理特性，例如分解剂、着色剂、调味剂和甜味剂。
如在此所用，术语“治疗有效量”是指包含治疗性分子的转铁蛋白融合蛋白的含量，当被施用给需要此的个体时，足以达到治疗目的。构成“治疗有效量”的转铁蛋白融合蛋白的含量将会随着所用的治疗性蛋白质、病症或疾病的严重性、被治疗个体的年龄和体重而变化，这可通过本领域普通技术人员根据自己的知识和本公开常规地确定。
如在此所用，“治疗性蛋白质”是指蛋白质、多肽、肽或片段或其变体，具有一种或多种治疗性和/或生物学活性。包含在本发明的治疗性蛋白质包括但是不限于蛋白质、多肽、肽和抗体以及生物制剂。术语肽、蛋白质和多肽在此被相互交换使用。此外，术语“治疗性蛋白质”是指治疗性蛋白质的内在的或天然的相关物(correlate)。“治疗活性”的多肽或具有“治疗活性的”蛋白质是指具有一种或多种已知的与治疗性蛋白质相关的生物学的和/或治疗性活性的多肽，治疗性蛋白质例如在此公开或本领域另外知晓的一种或多种治疗性蛋白质。作为非限制性例子，“治疗性蛋白质”是用于治疗、预防或缓解疾病、病症或紊乱的蛋白质。这种疾病、病症或紊乱可以是人或非人类动物患有的，例如兽医用途。
在此所用，术语“毒素”是指生物学来源的毒性物质。
如在此所用，术语“转化”是指核酸(即核酸聚合物)转移到细胞中。如在此所用，术语“遗传转化”是指DNA特别是重组DNA转移和结合到细胞中。
如在此所用，术语“转化体”是指已经转化的细胞、组织或生物体。
如在此所用，术语“转基因”是指以确保其功能的方式被插入到生物体、宿主细胞或载体中的核酸。
如在此所用，术语“转基因的”是指细胞、细胞培养物、生物体、细菌、真菌、动物、植物，它们的任何一种的后代，通过各种转化方法之一接受外源的或被修饰的基因，特别是编码被修饰的Tf融合蛋白质的基因，其中外源的或被修饰的基因来自与接受外源的或被修饰的基因的生物体种类相同或不同的种类。
“变体”是指不同于参比核酸或多肽但保留其基本特性的多核苷酸或核酸。一般地，变体大体上是非常相似的，并且在许多区域与参比核酸或多肽相同。如在此所用，“变体”是指本发明的转铁蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分，其序列区别于天然治疗性蛋白质，但是保留至少其一种本文别处或本领域另外知晓的功能的和/或治疗的特性。
如在此所用，术语“载体”泛指任何编码外源核酸的质粒、噬菌粒或病毒。该术语还被解释为包括非质粒、非噬菌粒和非病毒的化合物，其方便将核酸转移到病毒子或细胞中，例如，多溶素(polylysine)化合物等。载体可以是适合作为将核酸或其突变体递送给细胞的递送媒介的病毒载体，或者该载体可以是适用于相同目的的非病毒载体。用于将DNA递送给细胞和组织的病毒和非病毒载体的例子在本领域是熟知的，并且被描述在，例如Ma等(1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9412744-12746)中。病毒载体的例子包括，但是不限于，重组痘病毒载体、重组腺病毒、重组逆转录病毒、重组腺伴随病毒、重组鸟痘病毒等(Cranage等1986，EMBO J.53057-3063；1994年8月18日公开的国际专利申请WO 94/17810；1994年10月27日公开的国际专利申请WO 94/23744)。非病毒载体的例子包括，但是不限于，脂质体、DNA的多胺衍生物等。
如在此所用，术语“野生型”是指天然存在的多核苷酸或多肽序列。
转铁蛋白和转铁蛋白修饰本发明提供包含治疗性蛋白质或可溶的毒素受体片段的融合蛋白和转铁蛋白，或被修饰的转铁蛋白。优选地，本发明提供的治疗性蛋白质包括β-IFN、GLP-1、EMP1和T-20。优选地，可溶的毒素受体片段是突触结合蛋白1的氨基酸1-53(SEQ ID NO4)。任何转铁蛋白可以被用于制备本发明的被修饰Tf融合蛋白。
任何转铁蛋白可以被用于制备本发明的被修饰Tf融合蛋白。作为例子，野生型人Tf(Tf)是约75kDa的679个氨基酸的蛋白质(未考虑糖基化)，具有两个主要的结构域，N(约330个氨基酸)和C(约340个氨基酸)，其似乎来源于基因复制。参见GenBank登录号NM_001063、XM_002793、M12530、XM_039845、XM_039847和S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，所有这些以及SEQ ID NO1、2和3在此完全引入作为参考。这两个结构域持续背离(diverge)，但是保持较高程度的同一性/相似性(附图1)。
各个N-结构域和C-结构域进一步被分成两个亚结构域，N1和N2，Cl和C2。Tf的功能是将铁转运到机体细胞内。该过程受Tf受体(TfR)的调节，Tf受体在所有细胞上被表达，特别是在活跃生长的细胞上。TfR识别铁结合形式的Tf(每个受体结合两分子Tf)，当TfR/Tf复合物被转运到内涵体中时，发生内吞作用，此时局部的pH下降导致被结合的铁的释放，以及TfR/Tf复合物再循环到细胞表面并释放Tf(未结合铁的形式称作为apoTf)。受体结合是通过Tf的C-结构域实现。由于未糖基化的铁结合Tf不结合受体，C-结构域的两个糖基化位点似乎不参与受体结合。
每个Tf分子能够携带两个铁离子(Fe3+)。它们在N1和N2，C1和C2亚结构域之间的空间内发生复合，导致分子的构象发生变化。Tf通过Tf受体跨越血脑屏障(BBB)。
在人的转铁蛋白中，铁结合位点包含至少SEQ ID NO3的氨基酸Asp63(包括天然Tf信号序列的SEQ ID NO2中的Asp 82)，Asp 392(SEQ ID NO2的Asp 411)，Tyr 95(SEQ ID NO2的Tyr 114)，Tyr 426(SEQ ID NO2的Tyr445)，Tyr 188(SEQ ID NO2的Tyr 207)，Tyr 514或517(SEQ ID NO2的Tyr533或Tyr 536)，His 249(SEQ ID NO2的His 268)和His 585(SEQ ID NO2的His 604)。铰链区包含至少SEQ ID NO3的N结构域氨基酸残基94-96，245-247和/或316-318以及C结构域氨基酸残基425-427，581-582和/或652-658。碳酸盐结合位点包含至少SEQ ID NO3的氨基酸Thr 120(SEQID NO2的Thr 139)，Thr 452(SEQ ID NO2的Thr 471)，Arg 124(SEQ ID NO2的Arg 143)，Arg 456(SEQ ID NO2的Arg 475)，Ala 126(SEQ ID NO2的Ala 145)，Ala 458(SEQ ID NO2的Ala 477)，Gly 127(SEQ ID NO2的Gly 146)和Gly 459(SEQ ID NO2的Gly 478)。
在本发明的实施方案中，被修饰的转铁蛋白融合蛋白包括被修饰的人转铁蛋白，尽管任何动物的Tf分子可以被用于制备本发明的融合蛋白，包括人Tf变体，奶牛、猪、绵羊、狗、兔、大鼠、小鼠、仓鼠、echnida、鸭嘴兽、鸡、青蛙、天蛾幼虫、猴以及其它种类的牛、犬和鸟类。所有这些Tf序列很容易从GenBank和其它公共数据库中获得。人Tf核苷酸序列是可获得的(参见SEQ ID NO1，2和3以及上面描述的登录号，并且可以从www.ncbi.nlm.nih.gov/获得)，并用于制备Tf或Tf结构域与所选的治疗性分子的基因融合物。还可以从相关分子例如乳铁传递蛋白(乳铁蛋白)GenBankAccNM002343)或者黑素转铁蛋白(melanotransferrin)(GenBankAcc.NM_013900，小鼠黑素转铁蛋白)。
黑素转铁蛋白是以高含量存在于恶性黑素瘤细胞中的糖基化蛋白质，最早被命名为人黑素瘤抗原p97(Brown等1982，Nature，296171-173)。其与人血清转铁蛋白、人乳铁蛋白和鸡转铁蛋白具有很高的序列同一性(Brown等1982，Nature，296171-173；Rose等Proe.Natl.Acad.Sci.USA，1986，831261-1265)。但是，与这些受体不同，还没有确定黑素转铁蛋白的细胞受体。黑素转铁蛋白可逆地(reversibly)结合铁，并且以两种形式存在，其中之一是通过糖基磷脂酰肌糖锚结合到细胞表面上，而另一种形式是可溶的，并且被活跃地分泌(Baker等，1992，FEBS Lett，298215-218；Alemany等，1993，J.Cell Sci.，1041155-1162；Food等，1994，J.Biol.Chem.2747011-7017)。
乳铁蛋白(Lf)是天然防御的铁结合蛋白，已经被发现具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤和抗炎症的活性。这些蛋白质以通常暴露于正常菌群中的外分泌物存在乳汁、眼泪、鼻腔分泌物、唾液、支气管粘液、胃肠道液、子宫颈-阴道粘液和精液。此外，Lf是循环多形核粒细胞(PMNs)的次级特定颗粒的主要成分。脱辅基蛋白在腐烂区在PMNs脱颗粒时被释放。Lf的基本功能是清除液体和发炎区域的游离铁，抑制游离自由基介导的破坏，并降低金属侵入微生物和赘生性细胞的可获得性。在成人中的检测125ILf的转化率的试验中，结果表明Lf迅速被肝脏和脾脏吸收，肝脏和脾脏中持续存在数周放射性(Bennett等(1979)，Clin.Sci.(Lond.)57453-460)。
在一个实施方案中，本发明的转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括转铁蛋白剪切变体。在一个实施方案中，转铁蛋白剪切变体可以是人转铁蛋白的剪切变体。在一个特定实施方案中，人转铁蛋白剪切变体可以是Genbank登录号AAA61140的蛋白。
在另一个实施方案中，本发明的转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括乳铁蛋白的剪切变体。在一个实施方案中，人血清乳铁蛋白剪切变体可以是嗜中性粒细胞乳铁蛋白的新剪切变体。在一个特定实施方案中，嗜中性粒细胞乳铁蛋白剪切变体可以是Genbank登录号AAA59479的蛋白。在另一个特定实施方案中，嗜中性粒细胞乳铁蛋白剪切变体可以包含如下氨基酸序列EDCIALKGEADA(SEQ ID NO8)，其包括新的剪切变异区域。
在另一个实施方案中，本发明的转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括黑素转铁蛋白变体。
被修饰的Tf融合体可以用任何Tf蛋白、片段、结构域或遗传工程化结构域来制备。例如，融合蛋白可以用全长Tf序列来制备，含有或不含天然Tf信号序列。Tf融合蛋白还可以用单一的Tf结构域来制备，例如各个N或C结构域或者包含2N或2C结构域的被修饰形式的Tf(参见2002年8月30日申请的美国在先专利申请60/406,977，在此全文引入作为参考)。在一些实施方案中，可以制备治疗性蛋白质融合单一的C-结构域上的融合物，其中C-结构域被改变来减少、抑制或防止糖基化。在其它实施方案中，由于Tf糖基化位点存在于其本身的C-结构域和N-结构域上，采用单一的N-结构域是有利的。优选实施方案是具有单一N-结构域的Tf融合蛋白，以高水平被表达。
如在此所用，C-结构域或被修饰来作为N-样结构域的圆形突出部分(lobe)被修饰，具有实质上类似于天然的或野生型的N-结构域或圆形突出部分的糖基化模式或铁结合特性。在优选实施方案中，C-结构域或圆形突出部分被修饰，使得其不被糖基化，并且通过相关C-结构域或氨基酸取代存在于天然的或野生型的N-结构域的相应区域或位点上的那些氨基酸，而不结合铁。
如在此所用，包含“两个N-结构域或圆形突出部分的Tf部分包括Tf分子，Tf分子被修饰来用天然或野生型的N-结构域或圆形突出部分或被修饰的N结构域或圆形突出部分来替换天然的C-结构域或圆形突出部分，或者含有已被修饰从而实质上类似于野生型或被修饰的N结构域起作用的C-结构域。
通过重叠两个结构域(Swiss PDB Viewer 3.7b2，Iterative Magic Fit)或者通过直接氨基酸比对(ClustalW multiple alignment)来分析两个结构域，结果表明这两个结构域相互背离。氨基酸比对表明两个结构域之间具有42％同一性和59％相似性。但是，由于结构相当，约80％的N-结构域与C-结构域匹配。与N-结构域相比，C-结构域还具有几个额外的二硫键。
N末端和C-结构域的分子模型比对显示如下结构等同物。

两个结构域的二硫键的排列如下

黑体排列的二硫键斜体桥连肽在一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括至少两个转铁蛋白的N末端圆形突出部分。在还有一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括至少两个转铁蛋白的N末端圆形突出部分，该转铁蛋白来源于人血清转铁蛋白。
在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分至少包括、包含或至少由两个转铁蛋白的N末端圆形突出部分组成，其在至少一个选自SEQ ID NO3上的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188和His249的氨基酸残基上具有突变。
在另一个实施方案中，被修饰的转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括在SEQ ID NO3的Lys206或His207上具有突变的重组人血清转铁蛋白N末端圆形突出部分突变体。
在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分至少包括、包含或至少由两个转铁蛋白的C末端圆形突出部分组成。在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括至少两个来源于人血清转铁蛋白的C末端圆形突出部分。
在另一个实施方案中，C末端圆形突出部分的突变体在至少SEQ ID NO3的Asn413和Asn611之一上还包括一个突变，使得不能糖基化。
在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括至少两个转铁蛋白的C末端圆形突出部分，该转铁蛋白在至少一个选自SEQ ID NO3上的Asp392、Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的氨基酸残基上具有突变，其中该突变体保留结合金属的能力。在一个可选择的实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括至少两个转铁蛋白的C末端圆形突出部分，其在至少一个选自SEQ ID NO3上的Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的氨基酸残基上具有突变，其中该突变体保留结合金属的能力。在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括至少两个转铁蛋白的C末端圆形突出部分，该转铁蛋白在至少一个选自SEQ ID NO3上的Asp392、Tyr426、Tyr517和His585的氨基酸残基上具有突变，其中该突变体不具有结合金属的能力，并且实质上如同N-结构域那样起作用。
在一些实施方案中，Tf或Tf部分将具有足够的长度，以相对于处于未被融合状态下的治疗性蛋白质或肽或可溶的毒素受体的体内循环半衰期、血清稳定性、体外溶解稳定性或生物利用度，提高治疗性蛋白质或肽或可溶的毒素受体的体内循环半衰期、血清稳定性、体外溶解稳定性或生物利用度。稳定性、血清半衰期或生物利用度方面的提高可以比未被融合的治疗性蛋白质或肽或可溶的毒素受体约高30％、50％、70％、80％、90％或更高。在某些情况下，包含被修饰的转铁蛋白的转铁蛋白融合蛋白具有约10-20天或更长，约12-18天或约14-17天的血清半衰期。
当Tf的C-结构域是融合蛋白的一部分时，两个对应于SEQ ID NO3的N413和N611的氨基酸残基的N联糖基化位点被突变，在酵母系统中表达，以防止糖基化或超甘露糖基化，并延长融合蛋白和/或治疗性蛋白质(用于制备唾液酸(sialo)-Tf，或有时为单唾液酸(monosialo)-Tf或双唾液酸(disialo)-Tf)的血清半衰期。除了对应于N413和N611的Tf氨基酸，突变可以在N-X-S/T糖基化位点内的邻近残基上，以防止或实质上减少糖基化。参见Funk等的美国专利5,986,067。已经报导，在Pichia pastoris中表达的Tf的N-结构域与单一的己糖在S32上发生O-联糖基化，也在S32上进行突变或修饰来防止这种糖基化。
因而，在本发明的一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白包括被修饰的转铁蛋白分子，其中该转铁蛋白的糖基化减少，包括但是不限于唾液酸-、单唾液酸-和双唾液酸-形式的Tf。在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括重组的转铁蛋白突变体，其被突变来防止糖基化。在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括完全被糖基化的重组转铁蛋白突变体。在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括被突变来防止糖基化的重组人血清转铁蛋白，其中至少SEQ ID NO3的Asn413和Asn611之一被突变成不能进行糖基化的氨基酸。在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括被突变来防止或实质上减少糖基化的重组人血清转铁蛋白，其中在N-X-S/T糖基化位点中的邻近残基进行突变。而且，可以通过突变丝氨酸或苏氨酸残基来减少或防止糖基化。此外，已知将X改变为脯氨酸可以抑制糖基化。
如下文更加详细的讨论，本发明的被修饰的Tf融合蛋白还可以被工程化，以不结合铁和/或不结合Tf受体。在本发明的其它实施方案中，保留铁结合的能力，并且Tf结合铁的能力被用于将治疗性蛋白质或肽递送到细胞的内部，跨越上皮或内皮细胞膜和/或跨越BBB。这些结合铁和/或Tf受体的融合蛋白通常被工程化来减少或防止糖基化，以延长治疗性蛋白质的血清半衰期。当携带铁时，单独的N-结构域不会结合到TfR上，并且结合铁的C-结构域将结合TfR，但是与完整分子的亲合性不同。
在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括具有一个突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体未保留结合金属离子的能力。在一个可替代实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括具有一个突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体对金属离子的结合亲合力比野生型血清转铁蛋白的低。在一个可替代的实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括具有突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体具有比野生型血清转铁蛋白更强的对金属离子的结合亲合力。
在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括具有突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体未保留结合转铁蛋白受体的能力。在一个可替代实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括具有突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体对转铁蛋白受体的结合亲合力比野生型血清转铁蛋白的低。在一个可替代的实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括具有突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体具有比野生型血清转铁蛋白更强的对转铁蛋白受体的结合亲合力。
在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括具有一个突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体未保留结合碳酸盐离子的能力。在一个可替代实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括具有突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体对碳酸盐离子的结合亲合力比野生型血清转铁蛋白的低。在一个可替代的实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括具有突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体具有比野生型血清转铁蛋白更强的对碳酸盐离子的结合亲合力。
在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括重组人血清转铁蛋白突变体，该突变体在选自SEQ ID NO3的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188、His249、Asp392、Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的至少一个氨基酸残基上具有一个突变，其中该突变体保留结合金属离子的能力。在一个可替代实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括重组人血清转铁蛋白突变体，该突变体在选自SEQ ID NO3的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188、His249、Asp392、Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的至少一个氨基酸残基上具有突变，其中该突变体结合金属离子的能力降低。在另一个实施方案中，重组人血清转铁蛋白突变体在选自SEQ ID NO3的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188、His249、Asp392、Tyr426、Tyr517和His585的至少一个氨基酸残基上具有突变，其中该突变体未保留结合金属离子的能力。
在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括在SEQID NO3的Lys206或His207上具有突变的重组人血清转铁蛋白突变体，其中该突变体对金属离子具有比野生型人血清转铁蛋白(参见美国专利5,986,067，其在此被全文引入作为参考)更强的结合亲合性。在可选择的实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括在SEQ ID NO3的Lys206或His207上具有突变的重组人血清转铁蛋白突变体，其中该突变体对金属离子具有比野生型人血清转铁蛋白更弱的结合亲合性。在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括在SEQ ID NO3的Lys206或His207上具有突变的重组人血清转铁蛋白突变体，其中该突变体不结合金属离子。
任何可获得的技术可以被用于制备本发明的转铁蛋白融合蛋白，包括但是不限于通常可以获得的分子技术，例如，那些公开在Sambrook等分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，冷泉巷实验室出版社，1989中的技术。当采用本领域熟知的用于位点特异性诱变的技术进行核苷酸取代时，所编码的氨基酸的变化优选为次要性质(minornature)，也就是说，保守性氨基酸取代，虽然也包括非保守性取代，特别是在制备Tf融合蛋白的被修饰的转铁蛋白部分时，例如具有糖基化减少、铁结合下降等的被修饰的Tf蛋白质。特别可以预期的是氨基酸取代、小片段缺失或插入，通常为1-约30个氨基酸；转铁蛋白结构域之间的插入；小的氨基或羧基末端的延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基，或者在转铁蛋白结构域之间的或者连接转铁蛋白与治疗性蛋白或肽或可溶的毒素受体的少于50，40，30，20或10个残基的小接头肽，或者便于纯化的小延伸片段，例如多聚组氨酸序列、抗原性表位或结合结构域。
保守性氨基酸取代的例子为在相同组内进行的取代，例如在碱性氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)，酸性氨基酸(例如谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(例如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(例如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)，芳香氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组内进行的取代。
非保守性取代包括用一组氨基酸取代另一组氨基酸。例如，非保守性氨基酸取代将包括用极性氨基酸取代疏水性氨基酸。对于核苷酸取代的一般描述参见，例如Ford等(1991)，Prot.Exp.Pur.295-107。非保守性取代、删除和插入对于制备本发明的Tf融合蛋白是特别有用的，该Tf融合蛋白不或减少与铁的结合，不或减少与Tf受体的结合和/或不或减少糖基化。
可以通过突变来减少或破坏铁结合和/或受体结合，包括删除、取代或插入对应于Tf的N-结构域残基Asp63、Tyr95、Tyrl188、His249和/或C-结构域残基Asp392、Tyr426、Tyr514和/或SEQ ID NO3的His585的一个或多个的氨基酸残基。铁结合还受到对SEQ ID NO3的氨基酸Lys206、His207或Arg632进行突变的影响。碳酸盐结合可能通过突变而被减少或破坏，包括删除、取代或插入对应于Tf的N-结构域残基Thr120、Arg124、Ala126、Gly127和/或C-结构域残基Thr452、Arg456、Ala458和/或SEQ ID NO3的Gly459的一个或多个的氨基酸残基。碳酸盐结合的减少或破坏不利地影响铁和/或受体的结合。
与Tf受体的结合可能通过突变被降低或破坏，包括删除、取代或插入对应于上述对于铁结合的Tf的N-结构域残基的一个或多个的氨基酸残基。
如上所讨论，可以通过突变来减少或防止糖基化，包括对对应于围绕对应于C-结构域残基N413和/或N611的N-X-S/T位点的Tf的C-结构域残基的一个或多个的氨基酸残基(参见美国专利5,986,067)进行删除、取代或插入。例如，N413和/或N611被突变为Glu残基。
在本发明的Tf融合蛋白未被修饰来防止糖基化、铁结合、碳酸盐结合和/或受体结合的情况下，糖基化、铁和/或碳酸盐离子可能从融合蛋白上被剥离或裂解。例如，可获得的去糖基化酶被用于从融合蛋白上断裂糖基化残基，特别是附着到Tf部分上的糖残基，缺乏糖基化酶的酵母可以被用于防止糖基化和/或在存在能够防止糖基化的试剂例如衣霉素下培养重组细胞。
通过使用去糖基化酶处理融合蛋白，酶促减少或完全去除融合蛋白上的糖类。去糖基化酶在本领域是熟知的。去糖基化酶的例子包括但是不限于半乳糖苷酶、PNGase A、PNGase F、葡萄糖苷酶、甘露糖苷酶、岩藻糖苷酶和Endo H去糖基化酶。
然而，在某些情况下，融合蛋白的Tf部分是完全糖基化的，优选用于口服施用。
可以对Tf进行其它突变来改变Tf的三维结构，例如修饰铰链区以防止铁结合和Tf受体识别所需的构象变化。例如，可以在N-结构域的氨基酸残基94-96、245-247和/或316-318以及C-结构域的氨基酸残基425-427、581-582和/或652-658上或者其周围进行突变。此外，可以在这些位点的侧翼区或其周围进行突变来改变Tf结构和功能。
在本发明的一个方面，转铁蛋白融合蛋白可以作为载体蛋白，以延长治疗性蛋白质的半衰期或生物利用度，以及在有些情况下，将治疗性蛋白质递送到细胞内部和/或跨过血脑屏障。在一个可替代的实施方案中，转铁蛋白融合蛋白包括被修饰的转铁蛋白分子，其中转铁蛋白未保留跨过血脑屏障的能力。
在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白包括被修饰的转铁蛋白分子，其中转铁蛋白分子保留结合转铁蛋白受体和将治疗性肽转运到细胞内部的能力。在可替代的实施方案中，转铁蛋白融合蛋白包括被修饰的转铁蛋白分子，其中转铁蛋白分子未保留结合转铁蛋白受体和将治疗性肽转运到细胞内部的能力。
在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白包括被修饰的转铁蛋白分子，其中该转铁蛋白分子保留结合转铁蛋白受体和将治疗性肽转运到细胞内部的能力，并且保留跨过血脑屏障的能力。在可替代的实施方案中，转铁蛋白融合蛋白包括被修饰的转铁蛋白分子，其中该转铁蛋白分子保留跨过血脑屏障的能力，但是未保留结合转铁蛋白受体和将治疗性肽转运到细胞内部的能力。
被修饰的转铁蛋白融合蛋白本发明的蛋白质融合物含有被连接到Tf蛋白质的N末端和/或C末端的一个或多个拷贝的治疗性蛋白质或多肽或可溶的毒素受体。在一些实施方案中，治疗性蛋白质或多肽或可溶的毒素受体被连接到Tf蛋白质的N末端和C末端，而且该融合蛋白可以在Tf的一端或两端含有治疗性蛋白质或多肽的一个或多个等价物。在其它实施方案中，治疗性蛋白质或多肽被插入到已知的Tf蛋白质结构域中，例如，插入到Tf的一个或多个环中(参见Ali等(1999)J.Biol.Chem.274(34)24066-24073)。实际上，治疗性蛋白质或多肽可以被插入到转铁蛋白的所有五个环中，生成对抗原、受体或靶向分子的亲合力提高的五价分子，治疗性蛋白结合该分子。在其它实施方案中，治疗性蛋白或多肽被插入到Tf的N末端和C-结构域之间。可替代地，治疗性蛋白质或多肽被插入到转铁蛋白分子的任何位置上。
一般地，本发明的转铁蛋白融合蛋白可以具有一个被修饰的转铁蛋白来源的区域和一个治疗性蛋白区域。但是，各个蛋白的多个区域可以被用于制备本发明的转铁蛋白融合蛋白。类似地，一种以上的治疗性蛋白质被用于制备本发明的转铁蛋白融合蛋白，从而生成多功能的被修饰Tf融合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的转铁蛋白融合蛋白含有被融合到转铁蛋白分子或其部分上的治疗性蛋白或多肽或其部分或可溶的毒素受体。在另一个实施方案中，本发明的转铁蛋白融合蛋白含有被融合到转铁蛋白分子的N末端上的治疗性蛋白质或多肽。在可替代的实施方案中，本发明的转铁蛋白融合蛋白含有被融合到转铁蛋白分子C末端上的治疗性蛋白质或多肽。在另一个实施方案中，本发明的转铁蛋白融合蛋白含有被融合到治疗性蛋白质或多肽的N末端上的转铁蛋白分子。在可替代的实施方案中，本发明的转铁蛋白融合蛋白含有被融合到治疗性蛋白质或多肽的C末端上的转铁蛋白分子在其它实施方案中，本发明的转铁蛋白融合蛋白含有被融合到被修饰的转铁蛋白的N末端和C末端上的治疗性蛋白质。在另一个实施方案中，被融合在N末端和C末端上的治疗性蛋白质结合相同的治疗性蛋白质。在可替代实施方案中，被融合在N末端和C末端上的治疗性蛋白质是不同的治疗性蛋白质。在另一个可替代的实施方案中，被融合在N末端和C末端上的治疗性蛋白质结合不同的治疗性蛋白质，这些治疗性蛋白质可以被用于治疗或预防相同的疾病、紊乱或病症。在另一个实施方案中，被融合在N和C末端上的治疗性蛋白质是不同的治疗性蛋白质，这些治疗性蛋白质可以被用于治疗或预防本领域已知的通常在患者中同时发生的疾病、紊乱或病症。
除了本发明的其中被修饰的转铁蛋白部分被融合到治疗性蛋白部分的上N末端和/或C-末端上的被修饰的转铁蛋白融合蛋白，还可以通过将治疗性蛋白质或目标肽(例如在此公开的治疗性蛋白质或肽，或其片段或变体)插入到被修饰的转铁蛋白的内部区域中来制备本发明的转铁蛋白融合蛋白。被修饰的转铁蛋白的内部区域包括，但是不限于，铁结合位点、铰链区、碳酸氢盐结合位点或受体结合结构域。
在被修饰的转铁蛋白分子的蛋白质序列中存在大量环或转角，它们通过二硫键来固定。这些环对于特别是那些需要二级结构来起作用的治疗活性肽的插入或内部融合是有用的，或者用于生成具有特定生物学活性的被修饰的转铁蛋白分子的治疗性蛋白质。
当治疗性蛋白质被插入或置换Tf分子的至少一个环时，除了Tf的其它区域，可以在任何一个外露表面环区域内进行插入。例如，可以在包含Tf氨基酸32-33、74-75、256-257、279-280和288-289的环内进行插入(Ali等，同上文)(参见附图3)。如先前所描述，还可以在Tf的其它区域进行插入，例如铁和碳酸氢盐结合的位点、铰链区和下文更详细描述的受体结合结构域。适合于修饰/替换来插入蛋白质或肽的Tf蛋白质序列中的环还可以被用于开发随机肽插入物的筛选库。在被克隆到Tf结构域和/或融合到Tf末端之前，任何方法可以被用于制备生成肽文库的核酸插入物，包括可以获得的噬菌体和细菌展示系统。
Tf的N-末端是游离的，并且朝向分子本体的外方。因此，蛋白质或肽在N末端融合是优选的实施方案。这种融合可能包括一个接头区，例如但是不限于多聚甘氨酸序列，将Tf与治疗性蛋白质分开。注意接头序列之间的连接、选择先导序列以及通过密码子加工/优化mRNA结构(主要的茎环不会抑制核糖体前进)，将会提高分泌，并且容易采用标准的重组蛋白质技术来实现。
Tf的C末端似乎被C末端的6个氨基酸的二硫键隐藏和保护。在人Tf中，C末端氨基酸是脯氨酸，按照其朝向方式，可以是朝向融合物之外或者朝向分子本体内。C末端的接头或间隔部分可以被用于本发明的一些实施方案中。N末端附近也有脯氨酸。在本发明的一个方面，N和/或C末端的脯氨酸可以被替换掉。在本发明的另一个方面，C末端的二硫键可以被去除来解放(untether)C末端。
在还有其它的实施方案中，小分子的治疗剂与铁复合，并装载到被修饰的Tf蛋白质融合物，被递送到细胞内以及跨过BBB。添加引导肽或者例如单链抗体(SCA)，用于将有效负载(payload)靶向特定细胞类型，例如癌细胞。
治疗性蛋白质和肽按照本发明的方法和组合物，任何治疗性分子可以被用作Tf的融合配偶体。如在此所用，治疗性分子通常是在体外或体内产生有益的生物学作用的蛋白质或肽，包括产生与正常的稳态、生理学或疾病状态相关的有益作用的蛋白质和肽。治疗性分子不包括通常被用作标记或蛋白质纯化辅助物的融合配偶体，例如细菌性半乳糖苷酶(参见例如，美国专利5,986,067和Aldred等(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.122960-965)。例如，与疾病状态相关的有益作用包括对被治疗个体有利的任何作用，包括疾病预防、稳定病情、减轻或缓解疾病病症，或调节、缓解或治疗潜在缺陷来产生对被治疗的个体有利的作用。
本发明的被修饰的转铁蛋白融合蛋白包括至少治疗性蛋白质的片段或变体，以及至少被修饰的血清转铁蛋白的片段或变体，它们相互结合在一起，优选通过基因融合。
在一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白包括被连接到神经药物试剂上的被修饰的转铁蛋白分子。在另一个实施方案中，被修饰的转铁蛋白融合蛋白包括转铁蛋白的羧基末端被连接到神经药物试剂的氨基末端。在可替代实施方案中，被修饰的转铁蛋白融合蛋白包括转铁蛋白的氨基末端被连接到神经药物试剂的羧基末端。在特定的实施方案中，神经药物试剂是神经生长因子或睫状神经营养因子。
在另一个实施方案中，本发明的被修饰的转铁蛋白融合蛋白可以含有至少治疗性蛋白质的片段或变体。在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白可以含有蛋白质或抗体的肽片段或肽变体，其中该变体或片段保留至少一种生物学或治疗性的活性。转铁蛋白融合蛋白可以含有治疗性蛋白质，治疗性蛋白质可以是长度为至少约4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个或至少约40个、至少约50个、至少约55个、至少约60个或至少约70个或更多个氨基酸的肽片段或肽变体，被融合到被修饰的转铁蛋白的N和/或C末端，被插入到被修饰的转铁蛋白的环中。
本发明的被修饰的转铁蛋白融合蛋白可以含有一种或多种肽。增加肽的数量会提高被融合到转铁蛋白的肽的功能以及整个转铁蛋白融合蛋白的功能。通过包含具有多种功能的肽或蛋白质结构域，肽可以被用于制备两种或多种功能的融合蛋白。例如，可以使用治疗性蛋白质以及将该融合蛋白靶向特定靶点的第二种蛋白质来制备多功能融合蛋白。其它肽可以被用于诱导细胞系统的免疫反应，或者诱导抗病毒、抗细菌和抗病原的反应。
在另一个实施方案中，被修饰的转铁蛋白融合分子含有治疗性蛋白质，治疗性蛋白质包括全长蛋白质以及在氨基酸序列的氨基末端删除了一个或多个残基的多肽。
在另一个实施方案中，被修饰的转铁蛋白融合分子含有治疗性蛋白质部分，该部分可以是包括全长蛋白质以及在氨基酸序列的羧基末端删除了一个或多个残基的多肽的治疗性蛋白质的片段。
在另一个实施方案中，被修饰的转铁蛋白融合分子含有在氨基末端和羧基末端都删除了一个或多个氨基酸的治疗性蛋白质的部分。
在另一个实施方案中，被修饰的转铁蛋白融合分子含有与在此列举的参比治疗性蛋白质或其片段至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的治疗性蛋白质的部分。在另一个实施方案中，转铁蛋白融合分子含有与上述具有N末端和C末端删除的氨基酸序列的参比多肽至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的治疗性蛋白质的部分。
在另一个实施方案中，被修饰的转铁蛋白融合分子含有与例如天然的或野生型治疗性蛋白质的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的治疗性蛋白质的部分。还提供了这些多肽的片段。
对应于本发明的被修饰的转铁蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白质，例如细胞表面和分泌蛋白质，可以通过连接一种或多种寡糖基团来修饰。被称作糖基化的修饰显著地影响蛋白质的物理特性，对于蛋白质稳定性、分泌和定位来说是重要的。糖基化发生在多肽主链的特定区域。通常有两种主要类型的糖基化特征为O-联寡糖的糖基化，O-联寡糖被连接到丝氨酸或苏氨酸残基上；和特征为N-联寡糖的糖基化，N-联寡糖被连接到Asn-X-Ser/Thr序列中的天冬酰胺残基上，其中X可以是除了脯氨酸外的氨基酸。变量如蛋白质结构和细胞类型影响不同糖基化位点上链内的糖单位的数量和性质。在特定细胞类型中，相同位点上的糖基化异构体也是相同的。例如，多种类型的人干扰素被糖基化。
对应于本发明的转铁蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白质及其类似物和变体可以被修饰，使得一个或多个位点上的糖基化由于它们的核酸序列被表达核酸的宿主细胞加工或者由于其它表达条件而发生改变。例如，可以通过去除或插入糖基化位点来制备糖基化异构体，例如，通过氨基酸残基的取代和删除，例如用谷氨酰胺取代天冬酰胺，或者通过在使该蛋白质糖基化的宿主细胞中表达该蛋白质来制备未被糖基化的重组蛋白质，例如在糖基化缺陷的酵母中。这些方法在本领域是已知的。
治疗性蛋白质及其核酸序列在本领域是已知的，可以从公共数据库中获得，例如Chemical Abstracts Services Databases(例如，CAS Registry)、GenBank和GenSeq。登录号及其下所指的序列在此全部引入作为参考。
在另一个实施方案中，本发明的转铁蛋白融合蛋白具有治疗活性和/或生物学活性，与在本申请别处描述的治疗性蛋白质的治疗活性和/或生物学活性相对应。在另一个实施方案中，本发明的转铁蛋白融合蛋白的治疗活性蛋白质部分是在此引用的参比序列的片段或变体。
本发明还涉及包含在此描述的治疗性蛋白质的片段的被修饰的Tf融合蛋白。即使从蛋白质的N末端删除一个或多个氨基酸，导致该治疗性蛋白质部分的一种或多种生物学功能被改变或缺失，其它治疗活性和/或功能活性(例如生物学活性，聚合化能力，结合配体能力)仍然被保留。例如从N末端去除不超过完整多肽的残基的大部分，该N末端删除的多肽通常保留诱导和/或结合识别完整或成熟形式的多肽的抗体的能力。缺乏完整多肽的N末端残基的特定多肽是否保留这种免疫活性，可以通过在此描述的和本领域知晓的其它常规方法来分析。具有大多数N末端氨基酸残基被删除的突变体保留某些生物学的或免疫学的活性也是有可能的。实际上，由少至6个氨基酸残基组成的肽常常能够引起免疫反应。
另外如上提及，既便从治疗性蛋白质的N末端或C末端删除一个或多个氨基酸残基导致该蛋白质的一种或多种生物学功能被改变或缺失，其它功能活性(例如生物学活性，聚合化能力，结合配体能力)和/或治疗活性仍然被保留。例如从C末端去除不超过完整或成熟多肽的残基的大部分，该C末端删除的多肽将通常保留诱导和/或结合识别完整或成熟形式的多肽的抗体的能力。缺乏参比多肽的N末端和/或C末端的残基的特定多肽是否保留治疗活性，可以容易地通过在此描述的和本领域知晓的其它常规方法来确定。
治疗性蛋白质的肽片段可以是包含或者可替代地由治疗性蛋白质的多肽序列的具有治疗活性和/或功能活性(例如生物学活性)的氨基酸序列组成的片段，该氨基酸序列是治疗性蛋白质的一个片段。
治疗性蛋白质的肽片段可以仅包含该蛋白质的N末端和C末端，即治疗性蛋白质的中间部分被删除。可替代地，肽片段可以包含治疗性蛋白质的中间部分的不相邻的和/或相邻的部分其它的多肽片段是具有生物学活性的片段。生物学活性片段是那些具有与在本发明中使用的治疗性蛋白质相似但是不必相同的活性的片段。该片段的生物学活性可能包括提高期望活性或降低不期望的活性。
一般地，蛋白质变体与对应于本发明的转铁蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的氨基酸序列总体上十分相似，在许多区域是相同的。编码这些变体的核酸也被包括在本发明中。
可以被用于本发明的其它治疗性多肽是由多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸在本领域技术人员知晓的严紧杂交条件下与编码治疗性蛋白质的氨基酸序列的核酸分子的互补物杂交(参见例如，Ausubel，F.M.等，编辑，1989Current protocol in Molecular Biology，Green Publishing Associates，Inc.，和JohnWiley & Sons Inc.，纽约)。编码这些多肽的多核苷酸也被包括在本发明中。
具有与本发明的对照(query)氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽，是指在对照氨基酸序列的每100个氨基酸中，除了对象(subject)多肽序列可能包括多达5个氨基酸改变之外，对象多肽的氨基酸序列与对照序列是相同的。也就是说，为了获得具有与对照氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，在对象序列中多达5％的氨基酸残基被插入、删除或用其它氨基酸取代。参比序列的这些改变可能发生在参比氨基酸序列的氨基末端或羧基末端或者这些末端位置之间的任何地方，分别地分散在参比序列的残基中，或者在参比序列的一个或多个邻近基团中。
实际上，任何特定多肽是否与例如本发明的转铁蛋白融合蛋白或其片段(例如转铁蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分或转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分)的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，通常可以采用已知的计算机程序来确定。用于确定对照序列(本发明的序列)与对象序列之间的最佳全面匹配的优选方法，也称作全序列比对，可以采用基于Brufiag等(Comp.App.Biosci 245(1990))的算法的FASTDB计算机程序来确定。
本发明的多肽变体可以在编码区、非编码区或者两者中具有改变。含有产生沉默取代、添加或删除而不改变被编码多肽的性质或活性的改变的多肽变体可以被用于制备被修饰的Tf融合蛋白。可以使用由于遗传密码子的简并性通过沉默取代而制备的核苷酸变体。而且，其中少于约50个、少于40个、少于30个、少于20个、少于10个或者5-50个、5-25个、5-10个、1-5个或1-2个氨基酸以任何组合被取代、删除或添加的多肽变体也可以被使用。多肽变体由于各种原因被制备，例如为了特定宿主而优化密码子表达(改变人mRNA中的密码子为宿主优选的密码子，例如上述的酵母或大肠杆菌)。
在其它实施方案中，相对于野生型序列，治疗性蛋白质部分具有保守取代。“保守取代”是指在组内替换，例如脂肪族或疏水性氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的替换；羟基残基Ser和Thr的替换；酸性残基Asp和Glu的替换；氨基残基Asn和Gln的替换；碱性残基Lys、Arg和His的替换；芳香残基Phe、Tyr和Trp的替换，以及小氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的替换。关于如何制备表型沉默的氨基酸取代的指导被提供在，例如Bowie等，“翻译蛋白质序列中的信息对氨基酸取代的耐受”(″Deciphering the Message inProtein SequencesTolerance to Amino Acid Substitutions″)，Science 2471306-1310(1990)。在特定实施方案中，本发明的多肽包括或者可替代地由在此描述的治疗性蛋白质和/或本发明的血清转铁蛋白和/被修饰转铁蛋白的氨基酸序列片段或变体组成，其中当与参比序列比较时，该片段或变体具有1-5个、5-10个、5-25个、5-50个、10-50个或50-150个氨基酸残基添加、取代和/或删除。在另一个实施方案中，氨基酸取代是保守的。编码这些多肽的核酸也被包括在本发明中。
本发明的被修饰的融合蛋白可以由通过肽键或被修饰的肽键相互连接的氨基酸组成，并且含有20种编码基因的氨基酸外的氨基酸。多肽可以通过天然加工，例如翻译后加工，或者通过本领域熟知的化学修饰技术来修饰。这种修饰在基础文章和更加详细的专论以及多卷研究文献中被充分地描述。
可以在多肽的任何位置上进行修饰，包括肽的主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。可以预期，在特定多肽的几个位置上存在相同或不同程度的相同类型的修饰。此外，特定的多肽可以含有多种类型修饰。多肽可以是分支的，例如由于遍在蛋白质化，可以是环状的，有或无分支。环状的、分支的和分支环状的多肽可以从翻译后的天然加工中获得，或者通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接亚铁血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸，糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、PEG化、蛋白质水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋作用、硫酸化、转运-RNA介导的氨基酸添加到蛋白质上，例如精氨酸化和遍在蛋白质化(参见，例如，蛋白质-结构与分子特性(PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES)，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，纽约(1993)；蛋白质的翻译后共价修饰(POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS)，B.C.Johnson，编辑，Academic Press，纽约，1-12(1983)；Seifter等(1990)Meth.Enzymol.182626-646；Rattan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.66348-62。
本发明的治疗性蛋白质包括，但是不限于多肽、肽、抗体或其片段和变体。优选地，本发明的治疗性蛋白质包括β-干扰素(β-IFN)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、EPO模拟肽(EMP-1)、T-20和可溶的毒素受体，例如突触结合蛋白I。
β-干扰素绝大多数细胞因子，包括β-IFN，在体内生成并且局部和暂时地起作用，具有相对较短的循环半衰期。为了将β-IFN用作有效的全身性治疗剂，需要相对大的剂量和频繁的施用。这种频繁的胃肠外施用是不便利的，而且是令人痛苦的。此外，β-IFN施用具有毒副作用，这种副作用十分严重，使得一些多重硬化症的患者难以耐受这种治疗。这些副作用可能与高剂量施用相关。
本发明提供半衰期延长的β-IFN/转铁蛋白融合蛋白，以及稳定性提高的含有这种融合蛋白的药物组合物。可以低剂量地给患者施用这种融合蛋白，从而降低与β-IFN相关的毒副作用。本发明包括使用β-IFN/转铁蛋白融合蛋白来治疗各种与β-IFN相关的疾病和病症的用途，例如但是不限于多发性硬化、癌症包括脑瘤和皮肤癌，以及病毒性感染，例如乙型肝炎和丙型肝炎。优选地，β-IFN/转铁蛋白融合蛋白被用于治疗患有多发性硬化症的个体。
β-IFN是具有23kD的表观分子量的(MW)的糖蛋白。编码β-IFN的基因位于染色体9上。K.Hosoi等(J.Interferon Res.，8，375-384(1988))确定含有166个残基的氨基酸序列，而Y.Kagawa等(J.Biol.Chem.，263，17508-17515(1988))报道了其配糖物的序列。
β-IFN是在对病毒或细菌感染响应或者暴露于外源细胞、大分子或RNA时由成纤维细胞分泌的。特别地，β-IFN抑制被感染细胞的增殖，刺激免疫系统。一般认为，同源的Hu-β-IFN的特定抗病毒活性在3×108和1×109iu/mg(国际单位/毫克总蛋白)之间，包括端点值(参见美国专利4,289,689和EP-A-94672)。
“干扰素-β”(IFN-β)或“β-干扰素”(β-IFN)包括天然的和重组的I型干扰素，与通常称作IFN-β-1a和IFN-β-1b的I型干扰素具有相同或相似的药学特性。
任何β-IFN序列都可以被用于制备本发明的Tf融合蛋白。例如，美国专利4,738,931公开了来自人染色体DNA的人β-IFN基因。1.8kb的EcoRI片段含有编码人β-IFN的核酸被导入到大肠杆菌中，该大肠杆菌以大肠杆菌CI4被保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC31905。人β-IFN氨基酸序列的氨基酸序列的GenBank登录号为AAA72588。β-IFN还可以是美国专利4,588,585中描述的突变蛋白，其中通常存在于野生型或天然分子的位置17上的半胱氨酸(Cys)已经用中性氨基酸替换，例如丝氨酸或丙氨酸。Mark等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815662-5666(1984))证明，当Cys 17被替换为丝氨酸时，该IFN具有与β-IFN相同生物学活性谱，例如抗细胞和抗增殖活性，活化NK细胞和中和抗人IFN的抗体。当在70℃下培养时，突变蛋白的稳定性高于天然的人(hu)β-IFN。
由于其活性，在治疗和预防病毒性疾病例如疱疹、流感等，以及在治疗肿瘤性病症例如脑瘤和白血病中，β-IFN都被作为一种有效成分。β-IFN被用于治疗多发性硬化、脑瘤、皮肤癌和乙型肝炎和丙型肝炎。本发明的β-IFN融合蛋白可以被用于治疗这些疾病的任何一种。
人β-IFN在治疗人的冠状动脉再狭窄申也是有效的，在手术操作后，选择性地抑制血管损伤部位的冠状动脉平滑肌细胞的增殖，而对手术操作后冠状动脉内皮细胞的正常增殖不具有抑制作用。美国专利5,681,558公开了给患者施用β-IFN来治疗再狭窄的方法。因此，本发明的β-IFN融合蛋白可以被用于治疗再狭窄。
β-IFN对来自患有低红细胞生成的疾病的个体的祖细胞的生长具有促红细胞生成的作用。此外，β-IFN增加祖细胞的大量形成(burst formation)并促使其更加快速成熟为正常红细胞和晚期的网状细胞。美国专利5,104,653公开了用于在患有特征为缺乏祖红细胞成熟为红细胞的异常的患者中刺激红细胞生成，包括给所述患者施用促红细胞生成有效量的人β-IFN。因此，本发明的β-IFN融合蛋白可以被用于刺激红细胞生成。
β-IFN通过STAT1和STAT2起作用，被认为能够上调和下调各种基因，这些基因大部分参与抗病毒的免疫反应。虽然大部分IFN反应由存在dsRNA诱导，DNA病毒和RNA病毒都对β-IFN的作用敏感(Biron，Seminars inImmunology，10383-390(1998))。
β-IFN通常在对病毒感染响应时生成。干扰素β-IFN通过结合到人细胞表面上的特定受体上来产生生物学作用。这种结合起始复杂的细胞内事件的级联，导致许多干扰素诱导的基因产物和标记的表达，例如2′，5′-寡腺苷酸合成酶、b2-微球蛋白和新蝶呤(neopterin)。
(2′-5′)-寡腺苷酸化合成酶和dsRNA依赖的蛋白激酶是两种最公知的IFN-β诱导的蛋白质(Biron，1998，同上文)。(2′-5′)-寡腺苷酸合成酶以独特的2′-5′方式聚合ATP(Janeway等，免疫生物学健康和疾病状态下的免疫系统(ImmunobiologyThe Immune System in Health and Disease)，第四版，纽约，Elsevier Science/Garland Publishing 385-386(1999))；生成的寡聚物激活RNase L，RNase L裂解mRNA(Biron，1998，同上文)。DsRNA依赖的蛋白激酶磷酸化和灭活转录起始物elF2。(2′-5′)-寡腺苷酸合成酶和dsRNA依赖的蛋白激酶都仅在存在dsRNA时起作用，即在被病毒感染的细胞中起作用。这两种蛋白质作用的最终结果是抑制蛋白质翻译，这将会阻碍病毒复制(Biron，1998，同上文)。
TAP(与抗原加工相关的转运子)、Lmp2、Lmp7的β-IFN依赖的上调起增加由MHC I型分子对病毒性肽的递送，以方便CD8 T细胞识别和破坏被感染的细胞。在ER中，TAP是负责将肽片段装载到MHC I型分子上的分子；Lmp蛋白是裂解特别用于MHC I型递送的蛋白质的蛋白质酶体的组分(Janeway等，1999，同上文)。
一般认为，在天然杀伤(NK)细胞，β-IFN激活和诱导一定程度增殖(Janeway等，1999，同上文)。但是，干扰素本身不是促有丝分裂剂。NK细胞的增殖可能是由IFN-β诱导的中间细胞因子引起的(Biron，1998，同上文)。NK细胞能够杀死具有不典型的MHC I型表达模式的细胞；这种细胞通常被病毒感染(Janeway等，1999，同上文)。
虽然在成功战胜感染后，T细胞在免疫系统恢复到稳态平衡时由于凋亡而死亡，但是一些T细胞必须避免凋亡，并进入G0/G1的记忆状态来保存免疫记忆。这些记忆T细胞通过与基质细胞相互作用，从凋亡中被拯救过来，基质细胞分泌β-IFN和一些IFN-α(Pilling等，European Journal ofImmunology/291041-1050(1999))。T细胞凋亡可以由细胞因子去除或者Fas连接到细胞表面上来诱导，但是β-IFN能够阻断这两种凋亡路径。前一种凋亡路径是通过β-IFN依赖的上调凋亡抑制剂Bcl-x而被阻断。Fas连接诱导的凋亡发生十分迅速，以至难以通过上调基因来阻断，所以β-IFN必须通过其它方式来阻断凋亡路径(Scheel-Toellner等，European Journal of Immunology292603-2612(1999))。存在第二种阻断机制得到Marrack等(Journal ofExperimental Medicine 189521-529(1999))的结果的支持，Marrack等发现β-IFN防止T细胞凋亡而不增加Bcl-x的生成。
Der等(Proc.Nat.Acad.Sci.，USA 9515623-15628(1998))发现，在人纤维肉瘤细胞中，IFN提高100种以上的蛋白质的转录。从功能上看，被诱导的蛋白质的范围包括细胞色素和细胞支架蛋白到免疫活性蛋白例如补体成分和dsRNA腺苷脱氨酶。这些结果表明β-IFN具有真正的多效性作用，其中的多种还未完全被了解。
许多对β-IFN的临床研究集中在其被用于多发性硬化(MS)的治疗。MS是一种自体免疫性疾病，在中枢神经系统的神经胶质细胞中，T细胞提高对自身的髓磷脂抗原的免疫反应(Goodkin，1999.多发性硬化对具有复发-缓和和继发的渐进性多发性硬化的治疗选择(Multiple sclerosisTreatment optionsfor patients with relapsing-remitting and secondary progressive multiplesclerosis)。<http//www.msnews.org/goodkinl_99.htm>)。在1993年，FDA批准皮下注射IFN-β1b来治疗MS(Revelle M.，1993，FDA批准干扰素β-1b。(<http//www.fda.gov/bbs/topics/NEWS/NEW00424.html>)。β-IFN 1b是未被糖基化形式的INF-β，在大肠杆菌中制备(Arduini等，Protein Science 81867-1877(1999))。与β-IFN 1b治疗相关的不利结果包括注射部位反应(发炎、疼痛、超敏性和坏死)和flu-样征候群(发烧、寒战、焦虑和混乱)。实际上。这些不利的副作用可以通过如上述将β-IFN融合到转铁蛋白上来减少或减轻。
目前，β-IFN 1a(真核的、被糖基化的形式)也是可以获得的(Goodkin，1999，同上文)。通过DNA重组技术制备β-IFN 1a。干扰素β-1a是一种166个氨基酸的糖蛋白，具有约22,500道尔顿的预测分子量。用导入了人的IFN-β基因的哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢细胞)来制备。β-IFN 1a的氨基酸序列与天然的人β-IFN的氨基酸序列相同，可以被用于制备本发明的Tf融合蛋白。
β-IFN/转铁蛋白融合蛋白的治疗还可能通过恢复抑制物T细胞的功能来缓解自体免疫疾病的发作；由于不清楚的原因，与完全反式(all-trans-)的视黄酸一起处理，似乎增加这种恢复作用(Qu等，1998.完全反式的视黄酸加强干扰素β-1b的能力(All-trans retinoic acid potentiates the ability of interferonbeta-1b)。<http//members.tripod.corn/～ThJuland/ra-betalb.html>)。β-IFN还可能抑制IL-1和IFN-γ对诱导型一氧化氮合酶(INOS)表达的诱导。在星形细胞中，由INOS生成一氧化氮已经被认为是MS发生的一种因素(Hua等1998.β干扰素防止一氧化氮/过氧化氮破坏中枢神经系统(Beta inteferon preventsnitric oxide/peroxynitrate from damaging the central nervous system)。(<http//members.tripod.com/-ThJuland/nitric-oxide beta.html>)。
在一个方面，本发明包括使用对于治疗各种与β-IFN相关的疾病具有治疗有效性的β-IFN类似物来生产β-IFN/转铁蛋白融合蛋白的用途。
在另一个方面，本发明包括β-IFN/转铁蛋白融合蛋白在上述方法中抑制或刺激各种细胞过程，和用于治疗和预防上述的各种疾病和病症的用途。特别地，β-IFN/转铁蛋白融合蛋白可以被用于治疗多发性硬化、疱疹、流感、脑瘤和皮肤癌。
可以通过公知的方法，将本发明的β-IFN/转铁蛋白融合蛋白配制成药物组合物。参见，例如，E.W.Martin的雷明顿药物科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)，在此引入作为参考，其中描述了合适的剂型。本发明的β-IFN/转铁蛋白融合蛋白的药物组合物可以被配制成各种形式，包括液体、凝胶、冻干，或任何其它合适形式。优选形式将取决于所治疗的特定病症，并且对于本领域技术人员来说是显而易见的。
β-IFN/转铁蛋白融合蛋白可以以纯化的形式或以适当的药物组合物的形式被施用。可以通过任何被接受的模式进行施用。因此，施用可以是，例如，口服的、鼻腔的、胃肠外的、体表的、经皮的或直肠的，形式为固体、半固体、冻干粉末或液体剂量形式，例如，片剂、栓剂、药丸、柔软弹性的和硬的明胶胶囊、粉末、溶液、悬浮液或气雾剂等，优选为适合单次精确剂量施用的单位剂量形式。该组合物包括常规的药学载体或赋形剂以及作为活性试剂的β-IFN/转铁蛋白融合蛋白，此外，可能包括其它治疗剂、药物试剂、载体、佐剂等。
一般地，根据特定的施用模式，药学上可接受的组合物将含有重约1％到约99％的β-IFN/转铁蛋白融合蛋白，和重99％到1％的合适药物赋形剂。该组合物可以是含有重约5％-75％的β-IFN/转铁蛋白融合蛋白，而剩余部分为合适的药物赋形剂。
施用的途经可以为胃肠外的，采用便捷的日剂量方案，可以按照被治疗的疾病特别是多发性硬化的严重性来调整该方案。对于这种胃肠外施用，含有β-IFN/转铁蛋白融合蛋白的药学上可接受的组合物可以通过美国专利4,462,940、4,588,585和4,992,271中所公开的方法来制备。
可替代地，β-IFN/转铁蛋白融合蛋白的药物组合物可以被口服地、静脉内地、肌肉内地、腹膜内地、经皮地或皮下地或者以任何其它可接受的方式施用。优选施用模式将取决于被治疗的特定病症，并且对于本领域技术人员来说是显而易见的。
美国专利6,333,032描述使用β-IFN治疗温血脊椎动物的疾病的有效方法，例如多发性硬化。多发性硬化的治疗包括以适合促进所述剂量的干扰素与所述动物的口腔和咽部粘膜接触的剂量形式，以每天0.01-约5IU/lb剂量施用β-IFN。干扰素的剂量可以为每天0.1-约4.0IU/lb，或者每天0.5-约1.5IU/1b体重。
本发明包括以适合于确保所述剂量形式中的干扰素与进行治疗的人或动物的口腔和咽部粘膜最大化接触的剂量形式施用β-IFN。可以通过最大化治疗溶液在口腔或咽部的停留时间来加强干扰素与粘膜的接触。因此，当患者在口腔中含所述干扰素溶液一段时间时，似乎能够获得最佳结果。将干扰素与口腔和咽部粘膜接触，进而与被治疗的人或动物的淋巴系统接触，无疑是施用免疫治疗量的干扰素的最有效方法。
此外，本发明包括β-IFN/转铁蛋白在制备可用于治疗与β-IFN相关的疾病的治疗剂中的用途。本发明所预期的疾病包括但是不限于上述的那些疾病。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种调节胰岛素分泌的胃肠道激素，属于所谓肠胰岛轴。肠胰岛轴指定一组激素，对肠道中的营养成分的出现和吸收响应时，这组激素从胃肠道粘膜中释放，促进胰岛素较早地和加强地释放。肠促胰岛素的作用是对胰岛素分泌的加强作用，对正常的葡萄糖耐受可能是重要的。GLP-1是产生肠促胰岛素作用的原因，因此是一种生理学上重要的促胰岛激素。
GLP-1是胰高血糖素原(proglucagon)的产物(Bell，等，Nature，1983，304368-371)。在肠道内分泌细胞中以两个主要的大分子形式合成，GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)。在20世纪80年代早期，最先在克隆胰高血糖素原的cDNA和基因中确定该肽。
对全长肽GLP-1(1-37)和GLP-1(1-36酰胺)的最初研究表明，较大的GLP-1分子缺乏生物学活性。在1987年，三个不同的研究小组证明，去除前6个氨基酸生成了生物学活性升高的GLP-1分子。
Schmidt等(1985Diabetologia 28 704-707)公开GLP-1的氨基酸序列。人的GLP-1是来源于前胰高血糖素原的37个氨基酸残基的肽，在回肠末端、胰腺和大脑的L-细胞中合成。前胰高血糖素原被加工成GLP-1(7-36酰胺)、GLP-1(7-37)，GLP-2主要存在于L-细胞中。GLP-1(7-36酰胺)和GLP-1(7-37)的氨基酸序列是(SEQ ID NO6)His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X其中对于GLP-1(7-36酰胺)来说，X是NH2，而对于GLP-1(7-37)来说，X是Gly。
在患有II型糖尿病(非胰岛素依赖的糖尿病(NIDDM))，有时为I型糖尿病的患者中，GLP-1样分子具有抗糖尿病活性。在仅葡萄糖水平升高时，GLP-1处理引起活性，例如胰岛素分泌和生物合成增加，胰高血糖素分泌减少，胃排空延缓，从而提供一种潜在的比胰岛素或磺酰脲更加安全的治疗方法。使用适当的GLP-1治疗，能够使患者中的餐后葡萄糖水平趋向正常水平。还有报导表明，GLP-1样分子具有保护，甚至恢复II型糖尿病患者中的胰腺β细胞功能的能力。
任何GLP-1序列可以被用于制备本发明的Tf融合蛋白，包括GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)。GLP-1还有力地作用于胃肠道。以生理剂量灌注时，GLP-1抑制五肽促胃酸激素诱导以及食物诱导的胃酸分泌(Schjoldager等，Dig.Dis.Sci.1989，35703-708；Wettergren等，Dig Dis Sci1993；38665-673)。其还抑制胃排空速率和胰腺酶分泌(Wettergren等，Dig DisSci 1993；38665-673)。在用含有糖类或脂类的溶液灌注回肠时，可以在人中产生对胃和胰腺的分泌和活动的类似抑制作用(Layer等，Dig Dis Sci1995，401074-1082；Layer等，Digestion 1993，54385-38)。同时，GLP-1分泌被极大地刺激，推测GLP-1可能至少部分地造成这种所谓“回肠闸(ileal-brake)”作用(Layer等，Digestion 1993；54385-38)。实际上，最近的研究表明，从生理学上看，GLP-1的回肠闸作用可能比其对胰岛的作用更重要。因此，在剂量响应试验中，GLP-1至少在低至影响胰岛分泌所需的灌注速率下影响胃排空速率(Nauck等，Gut 1995；37(副刊2)A124)。
GLP-1可能对食物摄取产生作用。在大鼠中，心室内施用GLP-1极大地抑制食物摄取(Schick等in Ditschuneit等(编辑)，Obesity in Europe，JohnLibbey & Company 1td，1994；363-367；Turton等，Nature 1996，37969-72)。这些作用好像是高度特异的。因此，N-末端延长的GLP-1(PG 72-107)酰胺是无活性的，并且适当剂量的GLP-1拮抗剂，exendin 9-39消除了GLP-1的作用(Tang-Christensen等，Am.J.Physiol.，1996，271(4 Pt 2)R848-56)。在大鼠中，急剧外周施用GLP-1不会剧烈地抑制食物摄取(Tang-Christensen等，Am.J.Physiol.，1996，271(4 Pt 2)R848-56；Turton等，Nature 1996，37969-72)。但是，肠道L细胞分泌的GLP-1还可能作为一种过饱信号。
在糖尿病患者中，GLP的促胰岛素作用和GLP-1对胃肠道的作用受到保护(Willms等，Diabetologia 1994；37，副刊1A118)，这可能有助于降低食物诱导的葡萄糖偏离(excursion)，但是，更加重要的是还可能影响食物摄取。已经证明，在NIDDM患者中，以4ng/kg/min速率连续地静脉内施用GLP-1一周会显著地改善对血糖的控制，而不产生显著的副作用(Larsen等，Diabetes1996；45，副刊2233A)。
包含至少一个GLP-1类似物及其片段的GLP-1/转铁蛋白融合蛋白可用于治疗1型和2型糖尿病以及肥胖症。
如在此所用，术语“GLP-1分子”是指GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物。
如在此所用，术语“GLP-1类似物”被定义为，与GLP-1相比，具有一个或多个氨基酸取代、删除、倒置或添加的分子。许多GLP-1类似物在本领域是已知的，并且包括，例如GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、Val8-GLP-1(7-37)，Gly8-GLP-1(7-37)、Ser8-GLP-1(7-37)、Gln9-GLP1(7-37)、D-Gln9-GLP-1(7-37)、Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)和Lys18-GLP-1(7-37)。其它的类似物包括二肽酶抵抗形式的GLP-1，其中该肽的N末端被保护。这种类似物包括，但是不限于具有其它氨基酸的GLP-1，例如被添加到N末端或取代进入N末端氨基酸(GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)中的氨基酸7或8)的组氨酸。在这些类似物中，N末端可以包括残基His-His-Ala、Gly-His-Ala、His-Gly-Glu、His-Ser-Glu、His-Ala-Glu、His-Gly-Glu、His-Ser-Glu、His-His-Ala-Glu、His-His-Gly-Glu、His-His-Ser-Glu、Gly-His-Ala-Glu、Gly-His-Gly-GIu、Gly-His-Ser-Glu、His-X-Ala-Glu、His-X-Gly-Glu、His-X-Ser-Glu，其中X为任何氨基酸。美国专利5,118,666公开了GLP-1类似物的例子，例如GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)。
术语“GLP-1衍生物”被定义为具有GLP-1或GLP-1类似物的氨基酸序列，但是在一个或多个氨基酸侧链基团、α-碳原子、末端氨基基团或末端羧酸基团的上具有其它化学修饰的分子。化学修饰包括，但是不限于，添加化学部分、产生新键和去除化学部分。
如在此所用，术语“GLP-1相关化合物”是指落入GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物的定义中的任何化合物WO 91/11457公开活性GLP-1肽7-34，7-35，7-36和7-37的类似物，也可以被用作GLP-1部分。
EP 0708179-A2(Eli Lilly & Co.)公开包括被连接到位置34的赖氨酸残基上的N末端咪唑基团和可选择地无支链的C6-C10烷基基团的GLP-1类似物和衍生物。
EP 0699686-A2(Eli Lilly & Co.)公开某些N末端截断的GLP-1片段，它们被报导具有生物学活性。
美国专利5,545,618公开了基本上由GLP-1(7-34)、GLP1(7-35)、GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)组成的GLP-1分子或其酰胺形式，以及其药学上可接受的盐，具有至少一个选自如下的修饰(a)甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸或D-赖氨酸取代位置26和/或位置34上的赖氨酸；或者甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸或D-精氨酸取代位置36上的精氨酸；(b)抗氧化氨基酸取代位置31上的色氨酸；(c)如下取代中的至少一种取代酪氨酸取代位置16上的缬氨酸；赖氨酸取代位置18上的丝氨酸；天冬氨酸取代位置21上的谷氨酸；丝氨酸取代位置22上的甘氨酸；精氨酸取代位置23上的谷氨酸；精氨酸取代位置24上的丙氨酸；和谷氨酰胺取代位置26上的赖氨酸；和(d)如下取代中的至少一种取代甘氨酸、丝氨酸或半胱氨酸取代位置8上的丙氨酸；天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸取代位置9上的谷氨酸；丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸取代位置10上的甘氨酸；和谷氨酸取代位置15上的天冬氨酸；和(e)甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸，或D-或N-乙酰化或烷基化形式的组氨酸取代位置7上的组氨酸；其中在取代为(a)、(b)、(d)和(e)中时，被取代的氨基可选择地是D-型的，并且在位置7上被取代的氨基酸可选择地是N-乙酰化或N-烷基化形式的。
美国专利5,118,666公开具有促胰岛素活性的GLP-1分子。这种分子选自具有氨基酸序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(SEQ ID NO7)或His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly(SEQ ID NO8)的肽；和所述肽的衍生物，并且其中所述肽选自药学上可接受的所述肽的酸加成盐；药学上可接受的所述肽的羧酸盐；药学上可接受的所述肽的低级烷基酯和药学上可接受的所述肽的酰胺，选自酰胺、低级烷基胺，和低级二烷基胺。
美国专利6,277,819教导一种降低心肌梗塞的死亡率和发病率的方法，包括给患者施用GLP-1、GLP-1类似物和GLP-1衍生物。GLP-1类似物用如下的结构式表示(SEQ ID NO9)R1-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-X2-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-X3-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R2及其药学上可接受的盐，其中R1选自L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、同型组氨酸、α-氟甲基-组氨酸和α-甲基-组氨酸；X1选自Ala、Gly、Val、Thr、Ile和α-甲基-Ala；X2选自Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly；X3选自Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly；R2选自NH2和Gly-OH；只要GLP-1类似物具有范围在约6.0到约9.0的等电点，而且还当R1为His，X1为Ala，X2为Glu，和X3为Glu时，R2必须是NH2。
Ritzel等(Journal of Endocrinology，1998，15993-102)公开了一种GLP-1类似物，[Ser8]GLP-1，其中N末端的第二个氨基酸丙氨酸用丝氨酸替换。这种修饰不会消弱该肽的促胰岛素作用，而且生成血浆稳定性比GLP-1更高的类似物。
美国专利6,429,197教导在急性卒中或出血后，进行GLP-1治疗，优选静脉内施用是一种理想的治疗方法，因为它为优化胰岛素分泌、提高大脑合成代谢、通过抑制胰高血糖素来增强胰岛素效力，以及维持血糖正常或适度低血糖而没有严重的低血糖的危险或者其它不利的副作用提供一种途经。本发明提供一种在急性卒中或出血后用GLP-1或其生物活性类似物处理局部缺血的或再灌注的大脑的方法，优化胰岛素分泌，通过抑制胰高血糖素拮抗作用来增强胰岛素效力，以及维持euglycemia或适度低血糖而不产生严重的低血糖的危险。
美国专利6,277,819提供一种降低患心肌梗塞后的死亡率和发病率的方法，包括给需要的患者施用有效正常化血糖的剂量的选自GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物或其药学上可接受的盐的化合物。
美国专利6,191,102公开降低需要降低体重的个体的体重的方法，通过给个体施用有效引起体重下降的剂量的包含胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽类似物(GLP-1类似物)、胰高血糖素样肽衍生物(GLP-1衍生物)或其药学上可接受的盐的组合物一段时间，该时间足以引起体重下降，所述时间为至少4周。
皮下施用后，GLP-1是完全活化的(Ritzel等，Diabetologia 1995；38720-725)，但是由于二肽酶IV样酶的降解作用，GLP-1被迅速降解(Deacon等，J Clin Endocrinol Metab 1995，80952-957；Deacon等，1995，Diabetes 441126-1131)。因此，不幸的是GLP-1及其多种类似物在人体内的血浆半衰期很短(Orskov等，Diabetes 1993；42658-661)。因此，本发明的目的在于提供包含GLP-1或其类似物的转铁蛋白融合蛋白，所述类似物的作用模式相对于GLP-1(7-37)被延长。本发明的另一个目的在于提供GLP-1的衍生物和类似物，它们的清除率比GLP-1(7-37)低。此外，本发明的目的在于提供包含稳定性提高的GLP-1/转铁蛋白融合蛋白或GLP-1类似物/转铁蛋白融合蛋白的药物组合物。此外，本发明包括GLP-1/转铁蛋白融合蛋白或GLP-1类似物/转铁蛋白融合蛋白用于治疗与GLP-1相关的疾病的用途，例如，但是不限于上面描述的疾病。
本发明的一个方面，包含GLP-1肽/转铁蛋白融合蛋白或GLP-1类似物/转铁蛋白融合蛋白的药物组合物可以通过任何一种已经建立的配制药物组合物的方法来配制，例如，在雷明顿药物科学，1995中描述的方法。该组合物可以是适合系统注射或灌注的形式，因而可以与合适的液体媒介物一起配制，例如无菌水或等渗盐水或葡萄糖溶液。组合物可以通过本领域知晓的常规灭菌技术来灭菌。得到的水溶液可以被包装备用或在无菌条件下过滤和冻干，冻干制备物在施用前与无菌水溶液混合。组合物可以含有近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如缓冲试剂、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。
本发明的GLP-1/转铁蛋白融合蛋白和GLP-1类似物/转铁蛋白融合蛋白被改进以适合鼻腔的、经皮的、肺部或直肠施用。在组合物中所用的药学上可接受的载体或稀释剂可以是任何常规的固体载体。这种固体载体的例子为乳糖、高岭土(terra alba)、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、胶质、阿拉伯树胶、硬脂酸镁和硬脂酸。类似地，载体或稀释剂可以包括本领域知晓的任何持续释放物质，例如甘油基单硬脂酸或甘油基二硬脂酸，单独地或者与腊混合。
提供持续释放制剂形式的本发明的组合物是特别有利的。因此，组合物可以被配制成含有GLP-1/转铁蛋白融合蛋白或GLP-1类似物/转铁蛋白融合蛋白的微囊或微粒，被包裹在或分散在合适的药学上可接受的可生物降解的聚合物，例如多聚乳酸、多聚羟基乙酸或乳酸/羟基乙酸的共聚物中。
对于鼻腔内施用，该制备物可以含有溶解在或悬浮在喷雾应用的液体载体中，特别是水溶液载体中的GLP-1/转铁蛋白融合蛋白或GLP-1类似物/转铁蛋白融合蛋白。该载体可以含有添加剂，例如稳定剂，例如丙二醇，表面活性剂，吸收增强剂，例如卵磷脂(卵磷脂)或环化糊精，或者防腐剂例如对羟基苯甲酸酯类(parabenes)。
一般地，本发明的化合物被分散在单位剂量形式中，每个单位剂量包含0.5-500mg融合蛋白以及药学上可接受的载体。
此外，本发明包括GLP-1/转铁蛋白和GLP-1类似物/转铁蛋白融合蛋白在加工药剂产品中的用途，该药剂被用于治疗与葡萄糖水平升高相关的疾病，例如但是不限于上述的疾病。特别地，本发明包括GLP-1/转铁蛋白融合蛋白在治疗糖尿病中的用途，包括II型糖尿病、肥胖症、严重灼伤和心力衰竭，包括充血性心力衰竭和急性冠状动脉综合症(acute coronary syndrome)。
GLP-1的N末端一般被酰胺化。在酵母中不发生酰胺化。在本发明的一个方面，为了弥补在酵母中不发生的N末端的酰胺化，额外氨基酸被添加到GLP-1的N末端。由于空间位阻，将氨基酸加到GLP-1的N末端可以防止二肽酶(dipeptidyl peptidase)在GLP-1的第二个氨基酸进行裂解。因此，GLP-1将保留功能活性。20种氨基酸的任何一种可以被添加到GLP-1的N末端。在某些情况下，无电荷的或带正电荷的氨基酸被使用，优选地，添加较小的氨基酸例如甘氨酸。然后将具有额外氨基酸的GLP-1融合到转铁蛋白上。因此，具有添加氨基酸的GLP-1被融合在GLP-1/转铁蛋白融合蛋白的N末端。
在一个制备对二肽酶的裂解具有更高的抵抗性的GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)的实施方案中，His残基被添加到GLP-1的N末端上或者在GLP-1的N末端的His残基后插入His，使得GLP-1的N末端以His-His开始。
在本发明的另一个实施方案中，GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)肽(SEQ IDNO6)的N末端的第二个残基用另一种氨基酸取代。例如，GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)肽的N末端的第二个残基上的Ala残基可以用Ser、Gly、Val或另一种氨基酸取代。
用于治疗2型糖尿病的GLP-mTf融合蛋白如上所讨论，GLP-1激活和调控机体内的重要内分泌激素系统，并在葡萄糖的代谢中起重要的操纵作用。与市场上的所有其它糖尿病治疗剂不同，GLP-1作为B细胞的生长因子具有恢复潜力，从而增强胰腺分泌胰岛素的能力，而且通过提高稳定性来使已有的胰岛素水平更有效地起作用和更好地稳定葡萄糖水平。这将降低每日监控葡萄糖水平的负担，并且可能延迟由于糖尿病的血糖波动引起的严重的长期副作用。另外，GLP-1可以降低食欲和减轻体重。肥胖症是对葡萄糖代谢控制不力的内在结果，这只会进一步恶化糖尿病的病症。
由于天然GLP-1在循环中被迅速降解(半衰期为数分钟)，其临床应用受到限制。为了维持循环中的治疗性水平，需要采用泵或片膜装置进行持续高剂量的施用，这增加治疗成本。对于尤其结合所有其它药剂来治疗糖尿病和监控葡萄糖水平的长期持续应用来说，这是不方便的。GLP-1融合蛋白保留了GLP-1的活性，而且具有更长的半衰期(14-17天)，可溶性和转铁蛋白(mTf)的生物分布特性。这些特性使得成本低，体积小，可以每月进行s.c.(皮下)注射，这种类型的产品完全是长期持续使用所需的。
胰岛素人胰岛素含有两条肽链，称作A和B链，长度分别为21个和30个氨基酸，通过两个胱氨酸二硫键连接。该肽具有约6kDa的分子量。胰岛素的直接前体是胰岛素原，胰岛素原(proinsulin)是由B链和A链组成的单链肽，通过碱性残基的相邻配对被连接到被称作C肽的约31个氨基酸的连接肽上。这三个肽在胰岛素原分子中以氨基末端开始，排列如下B链-Arg-Arg-C-肽-Lys-Arg-A链。但是，当被转化为mRNA时，生成前胰岛素原，其含有在氨基末端连接长度为24个氨基酸的极度疏水的信号肽的胰岛素原。
前胰岛素原在胰岛中的胰腺p细胞中被合成，胰岛分布在整个胰腺中。信号肽的去除在粗面内质网中发生，然后生成的胰岛素原被转运到高尔基体中，被包装成分泌颗粒。折叠的胰岛素原通过二硫键被稳定。在分泌颗粒的加工过程中，折叠的胰岛素原分子的配对碱性残基被特定的蛋白酶裂解，释放胰岛素和C肽。
在美国，糖尿病是一种袭击约1700万人或者6.2％人口的疾病。每年大约100万20岁以上的人被诊断为患有糖尿病，在美国，糖尿病是第六大导致死亡的原因(http//www.niddk.nih.gov/health/diabetes/pubs/dmstats/dmstats.htm7)。大约90-95％的糖尿病病例为2型糖尿病，以前称作成人型(adult-onset)糖尿病，该病开始为胰岛素抗性(机体细胞不能正确地利用胰岛素)，进展为胰腺不能生产胰岛素。1型糖尿病，以前称作幼年型糖尿病或者胰岛素依赖的糖尿病，构成其余的5-10％的糖尿病病例。在1型糖尿病中，机体免疫系统破坏胰腺中生产胰岛素的β细胞。
由于人胰岛素仅含有51个氨基酸残基，容易通过重组技术来制备，并且已经制备大量胰岛素类似物和变体。这些类似物或变体的任何一种可以被用于制备本发明的mTf融合蛋白。
糖尿病患者通常需要胰岛素替代治疗，包括每天通过皮下注射一种或多种剂量的药物。但是，通过注射进行治疗在心理上和生理上都是令人痛苦的，并且需要技术技巧，在施用注射中，许多糖尿病患者需要帮助。但是，由于胰岛素在GI道特别是在胃的酸性环境中被快速降解，胰岛素的口服制剂是不成功的。然而，作为注射的替代，例如口服、鼻腔的和局部制剂都被试验过。美国专利5,824,638，Burnside等，描述了口服的乳剂制备物，其中胰岛素被溶解在亲水相中，例如水、盐水或易溶于水的醇，用表面活性剂分散在亲水相中，例如长链脂肪酸或脂肪酸酯。虽然乳剂使胰岛素被分散，却不能防止肽受到苛刻的胃环境的破坏。美国专利6,427,681，Gonda等中公开了在气雾中将胰岛素递送到肺部的鼻腔制备物，在美国专利6,399,566，Dardai等公开了局部制备物。
也已经开发出用于注射的被修饰的胰岛素，含有氨基酸取代或糖基化残基，来提高活性、抑制降解或抑制肽聚集(参见美国专利4,478,746，Kim等，糖基化的胰岛素衍生物；美国专利4,992,418，Katsoyanis等，含有Asp10的胰岛素(B链)来提高活性；美国专利5,716,927，Balschmidt等，B链的位置28上的Lys或Arg，或由Asn修饰为A18、A21或B3，或者B链的C末端的其它修饰来防止凝集和活性降低)。其它氨基酸取代物被乙酰化，赋予较长的活性期，被公开在美国专利5,750,497，Havelund等。A21 B3和B30可以用除了Lys、Arg或Cys外的任何氨基酸取代。B1可以被删除，而B30可以用10-24个碳原子的亲脂链取代。用于改进胰岛素的重组生产的融合蛋白(较高的产量、溶解性，正确折叠)被描述在美国专利6,534,288，Habermann等。这些肽在B链的氨基末端含有融合部分，接着为氨基酸RDVP-Yn-A链，其中Y是长度为2-50个氨基酸的肽，以碱性氨基酸结束。
本发明包括包含转铁蛋白和胰岛素蛋白或肽的融合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白被配制成用于口服递送。因此，本发明还包括给需要的患者特别是糖尿病患者口服施用本发明的胰岛素融合蛋白的方法。
在一个实施方案中，本发明包括包含单链胰岛素类似物的转铁蛋白融合蛋白(Lee等，2000，Nature，408483)。在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白中的胰岛素可能含有特异于胃肠道(GI)或胃肠道特定部分的蛋白酶裂解位点，使得该位点将被GI道的一种或多种酶识别。胰岛素原可以以这种方式被激活。该裂解位点存在于连接A和B链的肽中。
EPO模拟肽(EMP)促红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白激素，在哺乳动物肾脏中被合成，用于刺激有丝分裂性的细胞分裂和红细胞前体细胞分化。因此，EPO起刺激和调节红细胞生成。由于EPO在红细胞生成中的作用，EPO可用于特征为低红细胞生成或红细胞生成缺陷的血液紊乱的诊断和治疗中。
研究证明了EPO治疗在各种疾病状态、紊乱和造血无规律状态中的效果，例如β-地中海贫血(Vedovato等(1984)Acta.Haematol.71211-213)；囊性纤维化(Vichinsky等(1984)J.Pediatric 10515-21)；妊娠和月经紊乱(Cotes等(1983)Brit.J.Ostet.Gyneacol.90304-311)；早期早熟贫血(early anemia ofprematurity)(Haga等(1983)Acta Pediatr.Scand.72827-831)；脊髓损伤(Claus-Walker等(1984)Arch.Phys.Med.Rehabil.65370-374)；太空飞行病(space flight)(Dunn等(1984)Eur.J.Appl.Physiol.52178-182)；急性失血(Miller等(1982)Brit.J.Haematol.52545-590)；老化(udupa等(1984)J.Lab.Clin.Med.103574-588)；伴随异常红细胞生成的各种赘生性疾病(Dainiak等(1983)Cancer 51101-1106)；和肾脏机能不全(renal insufficiency)(Eschbach等(1987)N.Eng.J.Med.31673-78)。在最近十五年中，EPO已经被用于治疗肾衰竭的贫血、与类风湿性关节炎相关的慢性疾病的贫血、炎症性肠道疾病、AIDS和癌症，以及用于治疗造血恶化(hematopoietic malignancies)、骨髓移植后和自体固有的血液捐献(autologous blood donation)的贫血。
EPO活性受其受体的调节。EPO受体(EPO-R)属于生长因子类型的受体，被配基诱导的蛋白质二聚化激活。其它激素和细胞因子，例如人生长激素(hGH)、粒细胞菌落刺激因子(G-CSF)、表皮生长因子(EGF)，而胰岛素能够交联两分子受体，生成并置的两个细胞质尾部。许多这些二聚化活化的受体在细胞质尾部具有蛋白激酶结构域，在二聚化的基础上磷酸化尾部。而一些细胞质尾部缺少内在的激酶活性，这些功能与蛋白质激酶相关。EPO是后一种类型。在各种情况下，磷酸化导致信号路径的活化。
人们对具有EPO性能的分子模拟物越来越感兴趣。例如，在存在天然EPO或合成的EPO模拟肽(EMP)时，促红细胞生成素受体(EPOR)的二聚化是细胞内事件，引起受体活化和下游信号转换事件。总之，目的在于获得具有与EPO等价效能的模拟物。
Wrighton等(1996，Science，273458-463)采用噬菌体展示方法，其中随机肽被暴露在丝状噬菌体的衣壳蛋白上。在该筛选系统中，随机肽噬菌体文库可以结合到EPO受体的细胞外结构域上，随后被洗脱下来。首先采用弱结合系统捕获具有CRIGPITWVC(SEQ ID NO10)的一致序列的EPO弱结合结构域(Kd 10mM)。随后，分离出相对于200pM的EPO，亲合性(Kd)为200nM的20个氨基酸的肽EMP1，(GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG，SEQ ID NO11)，该序列实际上不存在于天然的EPO中。这种模拟的激动剂肽的复合物具有EPO受体的细胞外结构域，在2.8辨析率下的晶体结构表明，肽二聚体诱导该受体的几乎完美的双重(twofold)二聚化(Livnah等，1996 Science，273(274)464-471)。这种20个氨基酸的肽具有b-片层结构，通过C-C二硫键稳定。
EMP1的生物学活性表明EMP1可以作为一种EPO模拟物。例如EMP1在受体结合分析中与EPO竞争，引起被遗传工程化来对EPO响应的细胞系的细胞增殖(Wrighton等，1996，Science，273458-463)。在对EPO响应的细胞中，EPO和EMP1都诱导类似的磷酸化事件的级联和细胞周期进展(Wrighton等，1996，Science，273458-463)。此外，通过两种的体内分析初生红细胞生成的不同方法进行监控，证明EMP1在小鼠中具有显著的促红细胞生成作用(Wrighton等，1996，Science，273458-463)。
Johnson等(1998，Biochemistry，373699-3710)确定在分析EPO模拟作用中仍保留活性的最小肽。采取N末端和C末端删除，他们发现最小活性肽为具有序列YSCHFGPLTWVCK(SEQ ID NO12)的EMP20，即EMP1的氨基酸4-16。他们还发现EMP1的Tyr4和Trp13对于模拟作用十分重要。
本发明提供半衰期延长的EMP1/转铁蛋白融合蛋白，以及包含这种融合蛋白的药物组合物。任何EMP1序列可以被用于制备EMP1/转铁蛋白融合蛋白，包括EMP1序列，其中一个或多个C残基被删除或替换。然后这些序列被插入到mTf环中，给融合蛋白的EMP1区域提供三维结构。本发明包括用融合蛋白治疗各种与EPO相关的疾病和病症的用途，例如但是不限于上述疾病和病症。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含EMP1/转铁蛋白融合蛋白，可以通过任何已经建立的配制药物组合物的方法来配制，例如在雷明顿药物科学，1985中所描述的方法。该组合物可以是适合系统注射或灌注的形式，因而可以与合适的液体媒介物例如无菌水或等渗盐水或葡萄糖溶液一起配制。这些药物组合物含有缓冲液、盐和其它赋形剂来稳定组合物或者辅助递送转铁蛋白融合蛋白。
在优选实施方案中，本发明提供用于治疗与EPO相关的紊乱的方法。该方法通过在有效缓解紊乱的病症的条件下，即有效影响二聚化和EPO受体生物学活性的条件下，施用在此提供的EMP1/转铁蛋白融合蛋白一段时间来实现。在为EPO的情况下，这种方法可用于治疗晚期肾衰竭/透析；贫血，特别是与AIDS或慢性炎症性疾病例如类风湿性关节炎和慢性肠道炎症相关的贫血；自体免疫性疾病；以及用于必要时，例如在手术之前或作为输液的预处理，增加患者的红细胞数量。本发明的EMP1/转铁蛋白融合蛋白作为EPO激动剂，可以被用于激活巨核细胞。
由于EPO已经被证明对血管内皮细胞具有促有丝分裂和趋化作用，也作用于中枢胆碱能神经元(Amagnostou等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87597805982；Konishi等(1993)Brain Res.60929-35)，本发明的化合物还可以被用于治疗各种血管疾病，例如促进伤口愈合，侧支冠状血管生长(例如在心肌梗塞后发生)，损伤和血管移植后处理，以及各种神经学紊乱，通常表现为绝对水平低的乙酰胆碱，或与其它刺激神经组织的物质如神经传递素相比，乙酰胆碱的水平相对低。
因此，本发明包括包含作为活性成分的本发明的EMP1/转铁蛋白融合蛋白以及药物载体或稀释剂的药物组合物。本发明的EMP1/转铁蛋白融合蛋白可以通过口服、胃肠外(肌肉内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、经皮(被动地或者采用离子电渗疗法或电穿孔)或者经粘膜(鼻腔、阴道、直肠或舌下)的施用路径以适合于各种施用路径的剂量形式被施用。
用于口腔施用的固体剂量形式包括胶囊、片剂、药丸、粉末和颗粒。在这种固体剂量形式中，活性化合物与至少一种药学上可接受的惰性载体，例如蔗糖、乳糖或淀粉一起混合。对于通常实践，这种剂量形式还可以包含惰性稀释剂外的其它物质，例如滑润剂如硬脂酸镁。在为胶囊、片剂和药丸的情况下，该剂量形式还可以包含缓冲剂。片剂和药丸可以另外地用肠衣制备。
用于口服施用的液体剂量形式包括药学上可接受的乳化剂、溶液、悬浮液、糖浆，具有通常用于本领域的药典中含有的惰性稀释剂，例如水。除了这些惰性稀释剂外，组合物中还可以包括佐剂，例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂，以及甜味剂、调味剂和芳香剂。
按照本发明的用于胃肠外施用的制备物包括无菌的水溶性或非水溶性的溶液、悬浮液或乳液。非水溶性溶剂或媒介物的例子为丙二醇，聚乙二醇，植物油，例如橄榄油或玉米油，明胶和可注射的有机酯例如油酸乙酯。这种剂量形式还可以含有佐剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过例如通过除菌滤器过滤、往组合物中加入灭菌剂、照射组合物或加热组合物来进行灭菌。还可以在使用之前用无菌水或者其它无菌的可注射的媒介来加工。
用于直肠或阴道施用的组合物优选为栓剂，除了活性物质外，还含有赋形剂例如可可油或栓剂腊。用于鼻腔或舌下施用的组合物用本领域知晓的标准赋形剂来制备。
本发明的组合物中的活性成分的剂量是可变的；但是，活性成分的用量必需使得能够获得合适的剂量形式。剂量选择取决于期望的治疗效果、施用路径和期望的治疗持续期。通常，在0.001-10mg/kg体重之间的剂量水平被施用给哺乳动物。
此外，本发明还包括包含EMP1或其类似物的转铁蛋白融合蛋白在加工可以用于治疗与低或缺乏红细胞生成相关的疾病的药物中的用途。这种疾病的例子不限于上述的那些疾病。
T-20和T-1249HIV感染十分流行，并且HIV相关疾病代表了主要的世界性健康问题。虽然已经尽极大努力来成功设计有效的治疗方法，目前还没有具有治愈性的抗AIDS的抗逆转录病毒药物。为了开发这种药物，HIV生活周期的多个阶段被认为是治疗干涉的靶点(Mitsuya，H.等，1991，FASEB J.52369-2381)。例如，病毒编码的反转录酶成为药物开发的一个焦点。大量反转录酶靶向药物，包括2′，3′-二脱氧核苷酸类似物例如AZT，ddI，ddc和d4T已经被开发，并被证明对于抵抗HIV是有用的(Mitsuya，H.等，1991，Science 2491533-1544)。这些药物虽然是有益的，但是可能由于迅速出现耐药性的HIV突变体，这些核苷酸类似物不具有治愈性(Lander，B.等，1989，Science 2431731-1734)。此外，这些药物通常具有毒副作用，例如抑制骨髓、呕吐和肝脏功能异常。
进入抑制剂(Entry inhibitor)显著区别于现有类别的抵抗HIV的药物。其它药物在被感染的细胞的内部起作用。核苷酸反转录酶抑制剂例如AZT和abacavir以及非核苷酸反转录酶抑制剂例如nevirapine和efavirenz都是通过灭活反转录酶来起作用，HIV一旦进入细胞内部就利用反转录酶来复制自身。蛋白酶抑制剂灭活HIV用来包装自身以排出的病毒蛋白酶。相反，进入抑制剂是位于细胞外膜，干扰病毒最初袭击相关过程的药物。
T-20是所有进入抑制剂中被研究最多的一种，是融合抑制剂种类中的首个成员。不同于在细胞内部起作用并靶向参与病毒复制的病毒性酶的现有AIDS药物，T-20抑制病毒进入细胞和开始其复制过程之前的HIV与宿主细胞的融合。T-20结合到gp41的两个螺旋状结构域之一上。gp41是弹性装载的(spring-loaded)HIV-1蛋白，其在CD4结合到HIV gp-120上时被激活。如果gp41的两个螺旋状结构域不能折叠在一起，其融合过程被抑制。T-20结合到gp41上，有效地防止该蛋白质起作用。在早期的单臂(single-arm)临床试验中，T-20本身使病毒侵入下降10倍以上，已经被证明与蛋白酶抑制剂同样的有效，并且与其它抗逆转录病毒剂联合施用是安全的。
美国专利5,464,933公开了T-20(pentafuside，DP-178)作为一种36个氨基酸的合成肽。由于这种药物是肽，容易被消化系统破坏，因此不能口服施用。当通过皮下注射施用时，T-20在血液中产生具有抗HIV活性的足够量。一天两次的皮下施用。但是，患者在注射部位产生皮肤反应。最频繁报道的与不利事件相关的治疗是适度地调节局部注射位点反应。这反应由注射部位的微痛、肿胀和红肿构成。
美国专利6,479,055公开DP-178的肽类似物(对应于HIV-1LAI的跨膜蛋白质gp41的氨基酸残基638-673的肽，其具有抗膜融合能力、抗病毒活性，例如抑制HIV传播到未被感染的CD-4+细胞中的能力，或者调节涉及卷曲螺旋肽结构的细胞内处理的能力。此外，本专利涉及DP-178和DP-178的部分和/或类似物作为抗真菌或抗病毒化合物或者作为在涉及卷曲螺旋肽结构的细胞内事件的抑制剂的用途。此外，本专利教导这些肽作为诊断剂的用途。例如，DP178肽可以被用作HIV亚型特异性诊断剂。
T-1249是T-20的姐妹化合物。与T-20类似，T-1249靶向称作gp41的HIV糖蛋白，HIV利用gp41来结合CD4细胞。在动物和实验室研究中，T-1249被证明具有潜在的抗HIV作用。在人中，初步的安全、用量和效率的试验给正在进行的研究提供支持。
目前，通过每天一次或两次皮下(皮肤下)注射来施用T-1249。第一个在人中进行的T-1249的安全试验存在两种严重的不利事件超敏性反应(口腔溃疡、斑丘疹、发烧)和严重的嗜中性白血球减少症。40％的接受者产生注射部位反应，但是这些反应似乎是温和的。还报道接受者中出现头昏眼花、腹泻、头痛和发烧。没有剂量限制的毒性被确定，并且较高剂量的试验结果也是类似的。
T-1249已经完成了I/II期的安全性和用量的试验。最初结果表明，较高剂量产生1.3log的平均病毒侵入的下降。
已经报道，HIV RNA发生剂量依赖的下降。在T-1249试验中，从基线开始的平均下降范围在0.29-1.96log拷贝/ml(Gulick 2002)。
本发明提供半衰期延长的包含T-20、T-1249或其类似物的转铁蛋白融合蛋白，以及包含该融合蛋白的药物组合物。本发明还提供用于治疗目的的包含这些转铁蛋白融合蛋白的药物组合物。本发明包括这种融合蛋白作为人或非人类的逆转录病毒特别是HIV传播到未被感染的细胞的抑制剂的用途。传播被本发明的肽抑制的人的逆转录病毒包括，但是不限于HIV-1和HIV-2和人T-淋巴细胞病毒(HTLV-I、II、III)的所有菌株。传播被本发明的肽抑制的非人类的逆转录病毒包括，但是不限于牛白血性增生病毒(bovine leukosisvirus、猫科肉瘤和白血病病毒(feline sarcoma and leukemia virus)，猿肉瘤和白血病病毒(simian sarcoma and leukemia virus)，以及绵羊渐进性肺炎病毒(sheep progress pneumonia virus)。
对于HIV，包含T-20、T-1249或其类似物的本发明的转铁蛋白融合蛋白可以被用作治疗AIDS的治疗剂。采用本领域熟知的方法来施用这些转铁蛋白融合蛋白。优选地，包含这些转铁蛋白融合蛋白的药物组合物被配制，并被系统地施用。用于配制和施用的技术可以在“雷明顿药物科学”第18版，1990 Mack Publishing Co.，Easton，Pa中找到。合适的路径包括口腔、直肠、经粘膜或肠道的施；胃肠外递送，包括肌肉内、皮下、骨髓内注射，以及膜内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射，仅列举少数。更加优选地，施用是静脉内的。例如，包含T-20、T-1249或其类似物的转铁蛋白融合蛋白可以被配制在水溶液中，优选在生理上相容的缓冲液中，例如Hanks溶液、Ringer溶液或者生理盐水缓冲液。对于这种经粘膜施用，适合被渗透的屏障的渗透剂被用于配制。这种渗透剂是本领域通常所知的。
此外，包含T-20、T-1249或其类似物的转铁蛋白融合蛋白可以被用作先前未感染的个体在急性暴露于HIV病毒后的预防措施。肽的这种预防用途的例子包括，但是不限于，预防病毒从母亲到婴儿的病毒传播，或者传播到其它可能发生HIV传播的环境中，例如，其中工作人员暴露于含有HIV的血液产品的健康护理环境中发生的意外。在这种情况下，包含T-20、T-1249或其类似物的本发明的转铁蛋白融合蛋白可被用作预防疫苗，在宿主体内产生抵抗本发明的融合蛋白的抗体，该抗体起抵抗HIV病毒作用，例如抑制进一步的HIV感染。因此，施用本发明的转铁蛋白融合蛋白作为预防疫苗，将包括给宿主施用一定浓度的转铁蛋白融合蛋白，有效产生足以中和HIV的免疫反应，通过例如抑制HIV感染细胞的能力来中和HIV。精确浓度将取决于被施用的转铁蛋白融合蛋白中的特定肽，但是可以通过采用分析免疫反应发生的标准技术来确定，这对于本领域普通技术人员来说是熟知的。通常通过肌肉内施用作为疫苗的转铁蛋白融合蛋白。
被施用的包含T-20、T-1249或其类似物的转铁蛋白融合蛋白的有效剂量可以通过本领域技术人员熟知的操作来确定，该操作测定如生物半衰期、生物利用度和毒性的参数。如在下文第6节中给出的数据，例如DP-178，在获得10ng/ml肽的循环水平所需的剂量下，被证明在体内是有效的。
此外，本发明包括包含T-20、T-1249或其类似物的转铁蛋白融合蛋白在制备用于治疗与病毒传播相关的疾病的药物中的用途。
可溶的毒素受体本发明提供包含可溶的毒素受体和转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白的融合蛋白。如在此所用，术语“毒素”是指生物来源的有毒物质。包含可溶的毒素受体的融合蛋白可被用于治疗患有与毒素相关的疾病的患者。这种融合蛋白还可用于诊断目的。
毒素的例子包括，但是不限于，假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、蓖麻毒素、相思豆毒素、炭疽毒素、志贺菌毒素、肉毒杆菌毒素、破伤风毒素、霍乱毒素、maitotoxin、水螅毒素、ciguatoxin、textilotoxin、蟾毒素、α芋螺毒素(alpha conotoxin)、泰攀蛇毒素(taipoxin)、河豚毒素、alpha tityustoxin、蛤蚌毒素、类毒素、微囊藻素、乌头碱、exfoliatin毒素A和B、肠毒素、毒性休克综合症毒素(TSST-1)、Y.pestis毒素、气性坏疽毒素等。由于这些毒素中的部分所引起的疾病的严重性，而且它们中的部分容易被获得并用于生物战争，有必要开发能够低成本获得大量可能的抗毒素的方法。
本发明包括可溶的毒素受体作为抗毒素用于治疗和预防与各种毒素相关的疾病的用途。毒素受体是结合到特异的毒素上的分子。可溶的毒素受体是能够被溶解的分子。通常，受体的肽或片段是可溶的。本发明在于结合特定毒素的毒素受体的可溶的肽或片段。
与上述的其它肽相似，这些肽具有较短的半衰期。本发明提供包含被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白上的毒素受体的可溶肽的融合蛋白。与可溶的毒素受体肽相比，生成的融合蛋白的半衰期延长了。该融合蛋白还容易通过重组方法被大量地制备。由于这些可溶的肽的结合特性未被改变，其将会在循环中结合毒素，并防止毒素结合到目标受体上，从而灭活该毒素。因此，该融合蛋白是潜在的抗毒素。
在一个实施方案中，本发明提供包含被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白上的可溶的毒素受体和药学上可接受的载体的药物组合物。在另一个实施方案中，本发明提供包含可溶的毒素受体的转铁蛋白融合蛋白在制备用于治疗或预防与毒素相关的疾病或病症的药剂中的用途。
不同于大量制备是困难的和昂贵的抗体，本发明的转铁蛋白/抗毒素融合蛋白高效并且其制备是低成本的。此外，不能期望在一次生物威胁作用后进行大量施用的情况下，免疫能够维持起保护作用所需的抗体效价。在预期的暴露中大规模地免疫群体是不切实际的。
炭疽杆菌(Bacillus Anthtracis)毒素受体炭疽毒素是熟知的来自炭疽杆菌的生物战争试剂。炭疽杆菌生成三种蛋白质，当被恰当地结合时形成两种高效的毒素，共同称作炭疽毒素(anthraxtoxin)。保护性抗原(PA，82，684Da(道尔顿))和水肿因子(EF，89，840Da)结合形成水肿毒素(ET)，而PA和致死因子(LF，90，237Da)结合形成致死毒素(LT)(Leppla，S.H.Alouf，J.E.和Freer，J.H.，编辑Academic Press，London277-302，1991)。ET和LT都遵照AB毒素模式，PA具有目标细胞结合(B)功能，EF或LF作为效应子或催化(A)部分。这些毒素的独特特征是在缺乏PA时，LF和EF无毒性，这显然是由于它们无法进入真核细胞的细胞质中。
最近，在细胞中确定致死因子(LF)的靶点中的两个。LF是一种金属蛋白酶，其特异性地裂解Mek1和Mek2蛋白激酶，这些酶是MAP-激酶信号路径中的组成。LF的蛋白质水解活性通过裂解激活促有丝分裂原的蛋白激酶激酶1或2(MEK1或MEK2)来灭活MAP-激酶信号级联。(Leppla，S.A.In TheComprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins.J.E.Alouf和J.H.Freer，编辑，第二版，San Diego，Academic Press，1999；243-263)。
PA能够结合到许多类型的细胞的表面上。在PA结合到易感细胞表面的特定受体上后(Leppla，同上文，1991)，其在单个位点上被细胞表面蛋白酶裂解，可能是费林蛋白酶(furin)，生成氨基末端的19-kDa的片段，该片段从受体/PA复合物上释放(Singh等，J.Biol.Chem.26419103-19107，1989)。从PA上去除该片段，在结合受体的63-kDa的羧基末端片段(PA63)上暴露LF和EF的高亲合性结合位点。PA63和LF或EF的复合物进入细胞，并可能经过酸化的内涵体到达细胞溶质。
PA是该毒素的无毒的、结合细胞组分，是目前可以获得的人疫苗的重要组成。该疫苗通常从炭疽杆菌的Sterne菌株的批量培养中制备，虽然是无毒性的，但是仍然被要求作为III级病原体来处理。除了PA，该疫苗含有少量炭疽毒素部分、水肿因子和致死因子和一定范围的培养来源蛋白。所有这些因子在一些个体中产生所记载的该疫苗的反应性(reactogenicity)。该疫苗是昂贵的，并且需要六个月进行四次接种。此外，目前的证据表明，这种疫苗对于抵抗某些菌株的吸入性攻击是无效的(M.G.Broster等，Proceedings ofthe International Workshop on Anthrax，Apr.11-13，1989，Winchester UK.Salisbury med Bull Suppl No 68，(1990)91-92)。
Bradley等(Nature，2001，414225-229)公开结合PA的人炭疽热受体的克隆。受体ATR(炭疽毒素受体(anthrax toxin receptor))是I型膜蛋白，由368个氨基酸组成。该蛋白具有一个27个氨基酸的预测的信号肽，含有3个推定的N联糖基化位点的293个氨基酸的细胞外结构域、23个氨基酸的推定的跨膜区域和25个氨基酸的短的胞质尾巴。ATR的一个显著特征是细胞外结构域由von willebrand因子类型A(VWA)结构域组成，已知该结构域在蛋白-蛋白相互作用中是重要的。这种VWA结构域位于氨基酸44-216上。可溶形式的ATR包含氨基酸41-227，被证明能够结合炭疽毒素。因此，ATR的VWA结构域直接结合到PA上。
本发明提供包含炭疽抗毒素，该抗毒素被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白分子上的ATR的细胞外结构域。本发明还涉及包含被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白分子上的结合PA的ATR的细胞外结构域的片段的融合蛋白。此外，本发明涉及包含被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白分子上的结合PA的ATR的细胞外结构域的小分子模拟物的融合蛋白。优选地，本发明提供被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白上的ATR的氨基酸41-227。
肉毒梭杆菌(Clostridium Botulinum)毒素梭菌神经毒素是最毒的物质。人类由于创伤被暴露于由破伤风梭菌产生的神经毒素(破伤风毒素)。虽然在全世界发展中国家中，破伤风毒素仍然是严重的公众健康问题，但是在西方国家，由于在孩童时期进行免疫接种，几乎每个人都能够预防破伤风毒素感染。人们常常由于食物中度与由肉毒梭杆菌产生的神经毒素(肉素杆菌毒素)发生接触。但是，很少发生创伤肉毒杆菌中毒和称作婴儿肉毒杆菌中毒的婴儿定居感染。由于很少发生肉毒杆菌中毒，由于费用和疫苗的不利反应的预期比例，普通人群的免疫接种没有得到保障。因此，人们对肉毒杆菌毒素没有抵抗力。此外，这些毒素相对容易制备。结果，肉毒杆菌毒素是可能的生物战争试剂。
如所讨论，厌氧的、革兰氏阳性细菌肉毒梭杆菌生成最毒的生物神经毒素，已知人类致死剂量为毫微克(ng)。毒素作用的范围从导致肠道破坏的腹泻疾病到能够导致死亡的瘫痪作用。肉毒梭杆菌的孢子存在于土壤中，在未被正确灭菌和密封的家用罐装的食物容器中生长，这就是许多肉毒杆菌中毒案例的病因。肉毒杆菌中毒的病症通常出现在食用被肉毒梭杆菌培养物或孢子感染的食物后的18-36h。肉毒杆菌毒素显然能够穿过肠道的内膜而不被灭活，并攻击外周的运动神经元。肉毒杆菌毒素中毒的病症可以从行走、吞因和言语困难到呼吸肌瘫痪和死亡。
根据毒素进入血流的方法，肉毒杆菌中毒疾病可以分为4类。由于摄食未正确保存和不完全加热的含有肉毒杆菌毒素的食物造成的食物携带肉毒杆菌中毒(即在摄食之前该毒素已经形成)。由于肉毒梭杆菌穿过受损组织并产生毒性，该毒素被吸收到血流中而造成的创伤诱导的肉毒杆菌中毒。自从1950年以来，有30个创伤诱导的肉毒杆菌中毒被报道(Swartz，″厌氧孢子形成杆菌梭菌”(Anaerobic Spore-Forming BacilliThe Clostridia)，633-646，载于Davis等，(编辑)，Microbiology，第4版，J.B.Lippincott Co.(1990))。当毒素被吸入时引起的吸入性肉毒杆菌中毒。已经报道，吸入性肉毒杆菌中毒是由于意外暴露于实验室的结果(Holzer，Med.Klin.，411735 )，并且如果该毒素被用作生物战争的试剂，是一种潜在危险(Franz等，载于肉毒杆菌和破伤风神经毒素(Botulinum and Tetanus Neurotoxins)，DasGupta(编辑)，PlenumPress，New York ，473-476)。由于肉毒梭杆菌定居婴儿的肠道并产生毒素和吸收到血流中而引起的感染性婴儿肉毒杆菌中毒。
不同的肉毒梭杆菌菌株产生用字母A-G命名的抗原性上相互区别的毒素。血清型A毒素涉及26％食物肉毒杆菌中毒的病例，类型B、E和F也涉及较小比例的食物肉毒杆菌中毒的病例(Sugiyama，Microbiol.Rev.，44419(1980))。已经报道，创伤性肉毒杆菌中毒仅由A或B型毒素引起(Sugiyama，同上文)。几乎所有的婴儿肉毒杆菌中毒的病例都是由产生类型A或类型B的毒素细菌引起(例外地，一个新墨西哥州的病例是由产生类型F的毒素的肉毒梭杆菌引起，另一个是由产生类型B-类型F杂合体的肉毒梭杆菌引起)(Arnon，Epidemiol.Rev.，345(1981))。类型C毒素影响水禽、牛、马和貂。类型D毒素作用于牛，而类型E毒素作用于人和鸟类。
肉毒梭杆菌神经毒素作用于神经末梢来阻断乙酰胆碱释放。神经毒素通过其重链结合到膜受体上，这在毒素作用模式中是最重要的一步。Li等(J NatToxins 1998，7(3)215-26)采用神经毒素亲合柱层析法，从大鼠大脑突触体中纯化类型E肉毒杆菌神经毒素(BoNT/E)或类型A的肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)。用0.5M NaCl从亲合层析柱上洗脱下来的蛋白质馏分含有57kDa蛋白质作为主要的洗脱物。用抗突触结合蛋白的抗体免疫印迹洗脱物，结果表明57kDa蛋白质是突触结合蛋白I。已经有人提出，在大鼠大脑中，大鼠突触结合蛋白I是BoNT/B的受体(Nishiki等，J.Biol.Chem.269，10498-10503，1994)。Li等通过微量滴定板方法研究BoNT/A和BoNT/E与突触结合蛋白I的结合。在用BoNT/E预培养该蛋白质后，突触结合蛋白I对覆盖在平板上的BoNT/A的结合竞争性地下降，表明BoNT/A和BoNT/E竞争性地结合到该受体上。综合考虑，这些结果表明，相同的受体蛋白结合到所有被检测的三种BoNT血清型上。
突触结合蛋白I是肉毒梭杆菌神经毒素血清型A、B和E以及可能C、D、F和G的作用受体。其位于运动神经元细胞上。突触结合蛋白I的N末端片段，氨基酸1-53(SEQ ID NO4)负责结合各种神经毒素血清型。该结合介导神经毒素转移到细胞中，并且阻断神经传递素的释放，导致瘫痪，以及在极端情况下导致死亡。N末端片段可以通过重组方法来制备，并用于结合循环中的神经毒素。该片段结合到神经毒素上阻止神经毒素结合其目标受体，从而中和该毒素。
本发明的目的在于提供肉毒梭杆菌的抗毒素，与重组制备的53个氨基酸的片段相比具有显著更长的半衰期，使得该抗毒素在进入循环后有足够的时间来寻找和结合神经毒素。本发明提供包含被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白上的突触结合蛋白I的N末端的53个氨基酸的融合蛋白，从而延长该片段的半衰期而不改变该片段的结合特性。可替代地，该片段可以通过化学方法被PEG化来延长其循环寿命。较长的抗毒素的半衰期将使给定剂量更加有效。与抗体不同，本发明的抗毒素融合蛋白广泛地作用和结合到数个神经毒素血清型上，特别是神经毒素A、B和E。
在优选实施方案中，在高效的微生物制备系统中被制备融合蛋白，该系统在合理的费用下生成大量抗毒素，在生物威胁作用中大量暴露后来治疗群体。该融合蛋白还可以被用于暴露前的预防模式。
本发明还包括包含被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白分子上的突触结合蛋白I的氨基酸1-53的肽片段或突触结合蛋白I的氨基酸1-53的小分子模拟物的抗毒素。
融合蛋白还可以被用于阻断肉毒杆菌通过食物或空气污染在民众中传播。
在本发明的一个方面，抗毒素融合蛋白被用于治疗在治疗各种疾病例如偏头痛性肌张力障碍(migraine dystonia)和多汗中由于药物使用和意外过度剂量的肉毒杆菌神经毒素导致的创伤性肉毒杆菌中毒。
在本发明的另一个方面，抗毒素融合蛋白被用于治疗食物中毒引起的肉毒杆菌中毒。
白喉毒素受体白喉由细菌白喉棒杆菌引起，该细菌通常感染粘膜鼻子和咽喉是感染发生的最常见部位，但是眼睛粘膜或生殖器粘膜也会被感染。该细菌生成对组织产生损害的毒素，该损害在原始感染部位或一旦毒素通过血流扩散时会在机体的其它部位产生损害。白喉毒素的最严重的作用发生在心脏(肌肉损伤导致丧失泵血能力)、肾脏和神经系统。
可以通过给予青霉素或其它抗生素来杀死细菌，以及用抗毒素清除机体中游离的毒素来治疗白喉。但是抗毒素不能够清除已经结合到细胞上并且开始损伤细胞的毒素。较好的方法是，给予类毒素来刺激对毒素的免疫性，从而使机体能够在一旦毒素出现就清除掉。对细菌毒素例如白喉毒素(DT)的免疫性可以在感染过程中天然地获得或者通过注射脱毒形式的毒素(即类毒素)来人为地获得(Germanier，编辑，Bacterial Vaccines，Academic Press，Orlando，Fla.，1984)。类毒素通常通过化学修饰天然毒素来制备(例如，用福尔马林或甲醛)(Lingood等，Brit.J.Exp.Path.44177，1963))，使它们无毒性，而仍然保留抗原性，该抗原性保护被免疫的动物抵抗天然毒素的随后的攻击；化学灭活的DT的一个例子是Michel和Dirkx(Biochem.Biophys.Acta 491286-295，1977)中所描述的，其中片段A的Trp-153是被修饰的残基。类毒素最开始在2、4和6月龄给予，在18月龄和5岁再次给予，此后有规律地每10年给予一次。
数年来，白喉已不再是主要的公众健康威胁。但是，最近在前苏联的新独立国家、厄瓜多尔、泰国、阿尔及利亚和其它国家中，又出现了白喉。虽然白喉患者已经用中和未结合的毒素的马抗毒素治疗，但是存活的患者常常出现血清学疾病，一种免疫复合物类型的疾病。因此，有必要开发更好的治疗白喉患者的方法。
DT分子作为535个氨基酸的单一多肽被制备，由于在残基190、192或193上被断裂，该多肽容易被剪切来形成通过二硫键连接的两个亚基，片段A(约21Kda的N末端)和片段B(约37Kda的C末端)(Moskaug，等，Biol Chem26415709-15713，1989；Collier等，Biol Chem，2461496-1503，1971)。片段A是DT的催化活性部分。DT是一种NAD依赖的ADP核糖基转移酶，其特异性地靶向称作为伸长因子2(EF-2)的蛋白质合成因子，从而灭活EF2并关闭细胞中的蛋白质合成。片段A由白喉毒素C-结构域组成。片段A通过多肽环被连接到白喉毒素片段B上。DT的片段B具有受体结合结构域(R结构域)，其识别毒素分子，并将其结合到存在于许多类型哺乳动物细胞的表面上的特定受体结构上。一旦DT通过该受体结构结合到细胞上，该受体/DT复合物被细胞通过受体介导的细胞内吞作用而吸收。片段B上的第二个功能区域(T结构域)起转移DT穿过内吞囊泡的膜的作用，将催化活性片段A释放到细胞的细胞溶质中。单一的片段A分子足以使特定细胞中的蛋白质合成机制失效。
Naglich等(Cell，1992，691051-1061)描述从高度毒素敏感的猴Vero细胞中表达克隆白喉毒素受体。发现受体氨基酸序列与细胞表面表达的肝素结合的表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)前体(proHB-EGF)的序列相同。虽然proHB-EGF被断裂，并作为可溶的成熟HB-EGF被释放(Goishi等，Mol.BiolCell，1995，6967-980)，高含量的proHB-EGF仍然存在于细胞表面，并作为近旁分泌的(juxtacrine)生长因子(Hagashiyama等，Science，，251929-938)和作为DT受体(Iwamoto等，EMBO J.，1994，132322-2330；Naglich等，Cell，1992，691051-1061)起作用。
Hooper等(Biochem.Biophys.Res.Commun.，1995，206710-717)证明，由残基63-148(细胞外结构域或成熟的生长因子)构成的重组成熟人HB-EGF强烈地抑制放射性标记的DT结合到携带毒素受体的细胞上。该结果表明，有可能用成熟的HB-EGF治疗白喉患者，HB-EGF是一种天然的神经生长因子，不会引起血清学疾病。但是，成熟的HB-EGF具有生长因子活性，可能会产生副作用。
Cha等(Infection and Immunity，2002，70(5)2344-2350)开发了基于人DT受体/HB-EGF前体的治疗剂。他们描述了重组的截断HB-EGF，由残基106-149组成，缺乏肝素结合结构域的大部分，能够抑制放射性碘标记的DT结合到细胞上。但是，他们证明，该重组截断HB-EGF是比重组的成熟HB-EGF更为有效的DT结合抑制剂。另外，这些研究人员突变了重组截断HB-EGF的EGF样结构域中一些残基来破坏其部分促有丝分裂作用。已经证明，受体类似物(I117A/L148A)具有更低的促有丝分裂作用。截断的(I117A/L148A)HB-EGF蛋白仍然保留高度DT结合亲合性。Cha等的工作表明，截断的HB-EGF蛋白是安全的EGF受体的抗毒素。
本发明提供包含被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白上的截断的(I117A/L148A)HB-EGF蛋白的抗毒素融合蛋白。本发明还提供包含结合DT并具有最小促有丝分裂活性的截断的(I117A/L148A)HB-EGF蛋白的片段的转铁蛋白/抗毒素融合蛋白。此外，本发明提供包含结合DT并具有最小促有丝分裂活性的截断的(I117A/L148A)HB-EGF蛋白的类似物的转铁蛋白/抗毒素融合蛋白。
其它毒素受体细菌苏云金芽孢杆菌(BT)(Bacillus thuringiensis)产生细菌蛋白，该蛋白对于有限范围内的昆虫有毒，主要是鳞翅目的、鞘翅目的和双翅目的。Bt毒素被用于控制病虫害，通过将苏云金芽孢杆菌应用于植物或转化植物本身，使得植物借助其转基因特性产生毒素。如Hofte，H.等Microbiol Rev(1989)53242所描述，该毒素本身是cry基因的糖蛋白产物。美国专利5,693,491描述了来自烟草天蛾幼虫的编码糖蛋白受体的cDNA，其结合苏云金芽孢杆菌的毒素。cDNA的获得，使得可以在其它昆虫和生物体中修复编码同源受体的DNA，设计分析潜在的杀虫剂的细胞毒性和结合亲合性的方法，以及开发加工天然的和/或导入的同源受体的方法，从而破坏目标细胞、组织和/或生物体。
大部分通过删除编码霍乱毒素(CT)的ctxA基因而构建的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)疫苗能够产生高的抗体反应，但是，半数以上的疫苗仍然会引起中度腹泻(Levine等，Infect.Immun.，56(1)161-167(1988))。考虑在缺乏CT时产生的大量腹泻，推测霍乱弧菌产生其它肠道毒素因子，这种因子仍存在于删除了ctxA序列的菌株中(Levine等，同上文)。结果，发现由霍乱弧菌产生的第二种毒素zonula occludens毒素(下文称作“ZOT”)，其导致了其余的腹泻(Fasano等，Proc.Nat.Acad.Sci.，USA，85242-5246(1991))。Zot基因紧邻ctx基因。在霍乱弧菌菌株中同时存在高比例的zot基因和ctx基因(Johnson等，J.Clin.Microb.，31/3732-733(1993)；和Karasawa等，FEBSMicrobiology Letters，106143-146(1993))，这表明在急性脱水性腹泻型的霍乱的病因中，ZOT可能起协同作用。还在其它肠道病原体中确定了zot基因(Tschape，2nd Asian-Pacific Symposium on Typhoid fever and other Salomellosis，47(摘要)(1994))。美国专利5,864,014公开了纯化的zonula occludens毒素的受体。
腹泻可以由小的、热稳定肽毒素(ST)引起，这些肽毒素由各种病原性细菌产生(Thompson，M.R.，1987，Pathol.Immunopathol.Res.6，103-116)。在发展中国家中，这种毒素引起被报道的腹泻病例的50％-80％(Giannella，R.A.，1981，Ann.Rev.Med.32，341-357)。在实验室和家养动物中，ST也是主要的腹泻病因(Burgess等，1978，Infect.Immun.21，526-531)。已经证明，在肠道中，热稳定性肠毒素结合到细胞表面受体上，随后引起鸟苷酸环化酶的活化(Field等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75，2800-2804；Guerrant等，1980，J.InfectiosDiseases 142，220-228)。然后，环化GMP的增多刺激液体分泌，从而引起腹泻。已经报道，根据部分层析从鸟苷酸环化酶中分离去垢剂所溶解的ST结合蛋白，ST受体是显著地区别于鸟苷酸环化酶的蛋白。(Kuno等，1986，J.Biol.Chem.261，1470-1476；Waldman，等，1986，Infect.Immun.51，320-326)。美国专利5,237,051公开克隆编码肠道受体的核酸，该受体识别热稳定肠毒素，并具有鸟苷酸环化酶活性。数据表明，该受体通常通过环化的GMP第二信使系统来结合肠毒素和信号。
脓毒症(Sepsis)最通常由感染或由毒素诱导的损伤引起。脓毒症的最初病症通常包括寒战、大汗、无规律的间歇性发烧、虚弱等，接着为持续发烧，血压过低导致休克，嗜中性白血球减少症，白血球减少症，弥漫性血管内凝血，成人呼吸窘迫综合症和多重器官衰竭。已经发现，脓毒症诱导的毒素与病原性细菌、病毒、植物和毒液相关。在被充分描述的细菌中，毒素是革兰氏阴性细菌的内毒素或脂多糖(LPS)。这些分子是广泛存在于革兰氏阴性菌的外膜中的糖脂类。已经报道，膜固定的CD14作为蛋白质结合内毒素(LPS)复合物的受体，并介导内毒素的细胞作用(Wright等，1990，Science，2491431)。在氨基酸71处截断的可溶的CD14(N71)含有脂糖结合序列。已经证明，N71中和循环中的LPS，即作为内毒素的拮抗剂(Higuchi等，Pathobiology，2002，70103)。
递送抗毒素融合蛋白的方法在一个实施方案中，本发明的抗毒素融合蛋白将被包装在具有两个相邻腔室的单活塞注射器中。第一个腔室将含有稀释剂，第二个腔室含有冻干的抗毒素融合蛋白。当下压活塞时，稀释剂会被推进到下一个腔室中，溶解抗毒素融合蛋白，而融合蛋白将会从针头中排出用于直接肌肉内注射。该稀释剂可以含有抗冻剂例如甘油，以在冷藏条件下起作用。该冻干产品在温热条件下仍然保持稳定。
本发明包括以这种方式将本发明的抗毒素融合蛋白递送给进入战场的士兵，在该条件下他们暴露于毒素的危险性很大。抗毒素融合蛋白可以被用于在战场上的直接治疗和作为奔赴战场前的预防药。
核酸本发明还提供编码包含被共价地连接或结合到治疗性蛋白质，优选为治疗性蛋白质上的转铁蛋白或转铁蛋白部分的转铁蛋白融合蛋白的核酸分子。如下文更加详细的讨论，任何治疗性蛋白质可以被使用。融合蛋白还可以包含接头区，例如少于约50个、40个、30个、20个或10个氨基酸残基的接头。该接头被共价地连接到转铁蛋白或其部分与治疗性蛋白质，优选治疗性蛋白质之间。本发明的核酸分子被纯化或未被纯化。
用于复制核酸分子和表达被编码的融合蛋白的宿主细胞和载体也被提供。任何载体或宿主细胞都可以被使用，无论是原核或真核的细胞，但是真核表达系统，特别是酵母表达系统是优选的。许多用于该目的载体和宿主细胞在本领域是已知的。选择用于期望应用的恰当表达系统完全在本领域的能力内。
编码转铁蛋白、转铁蛋白部分和目标治疗性蛋白的DNA序列可以从本领域知晓的各种基因组或cDNA文库中克隆得到。采用探针方法分离这种DNA序列的技术是常规技术，是本领域技术人员熟知的。用于分离这种DNA序列的探针可以基于公开的DNA或蛋白质序列(参见，例如，Baldwin，G.S.(1993)来自不同物种的转铁蛋白的比较Comp.Biochem.Physiol106B/1203-218及其所引用的全部参考文献，在此全部引入作为参考)。可替代地，可以采用Mullis等(美国专利4,683,195)和Mullis(美国专利4,683,202)描述的聚合酶链式反应(PCR)方法，在此引入作为参考。用于分离这种DNA序列的文库的选择和探针的选择在本领域普通技术人员水平内。
如本领域所知，两条多核苷酸或多肽之间的“相似性”，是通过将一条多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列及其保守性核苷酸或氨基酸取代物与第二条多核苷酸或多肽的序列比较来确定。如本领域所知，“同一性”是指两条多肽或两条多核苷酸序列之间的序列相关程度，通过鉴定这种序列两条链之间的匹配程度来确定。同一性和相似性都很容易计算(ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，编辑，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.，编辑，AcademicPress，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，PartI，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编辑，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysisin Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑，M Stockton Press，NewYork，1991)。
虽然存在大量测定两条多肽或多核苷酸序列之间的同一性和相似性的方法，术语“同一性”和“相似性”对于技术人员来说是熟知的(SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，等，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)。通常用于确定两条序列之间的同一性或相似性的方法包括，但是不限于那些被公开在Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，编辑，Academic Press，SanDiego，1994，和Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.481073(1988)的方法。
确定同一性的优选方法被设计来在两条被检测的序列之间产生最大匹配。确定同一性和相似性的方法被编写在计算机程序中。确定两条序列之间的同一性和相似性的优选的计算机程序方法包括，但是不限于，GCG程序软件包(Devereux，等，Nucl.Acid Res.12(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，等，J.Mol.Biol.215403(1990))。上面所提及的相似性或同一性的大小被确定为两条序列之间的相同程度，通常表示第一条序列衍生于第二条序列。两条核酸序列之间的相同程度可以通过本领域知晓的计算机程序来确定，例如在GCG程序软件包中提供的GAP(Needleman和Wunsch J.MolBiol.48443-453(1970))。为了确定本发明的两条核酸序列之间的相同程度，使用GAP，具有如下设定5.0的GAP产生(creation)罚分和0.3的GAP延长(extension)罚分。
密码子优化遗传密码的简并性使得可以改变转铁蛋白和/或目标的治疗性蛋白质的核苷酸序列，而仍然生成具有与天然DNA序列编码的多肽相同的氨基酸序列的多肽。该操作称作“密码子优化”(被描述在美国专利5,547,871中，在此全文引入作为参考)，提供设计这种被改变的DNA序列的方法。密码子优化的基因的设计应当考虑各种因素，包括生物体中密码子利用的频率、最接近的邻近频率、RNA稳定性、二级结构形成的可能性、合成路径以及确定的将会对该基因进行的DNA操作。特别地，当采用酵母表达系统时，采用可获得的方法来用那些最容易被酵母识别的密码子替换编码特定融合蛋白的密码子。
遗传密码的简并性使得相同的氨基酸序列可以用多种不同方式来编码和翻译。例如，亮氨酸、丝氨酸和精氨酸分别由六种不同的密码子编码，而缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸和甘氨酸分别由四种不同密码子编码。但是，在真核细胞和原核细胞中，这种同义密码子的使用频率在基因组之间是不同的。例如，同义密码子的选择模式在哺乳动物中十分类似，而在进化距离远的生物体例如酵母(例如酿酒酵母)、细菌(例如大肠杆菌)和昆虫(例如D.Melanogaster)中，则表现出明显不同的遗传密码利用频率模式(Grantham，R.，等，Nucl.Acid Res.，8，49-62(1980)；Grantham，R.，等，Nucl.Acid Res.，9，43-74(1981)；Maroyama，T.，等，Nucl.Acid Res.，14，151-197(1986)；Aota，S等，Nucl.Acid Res.，16，315-402(1988)；Wada，K.等，Nucl.Acid Res.，19 Supp.，1981-1985(1991)；Kurland，C.G.，FEBS Lett.，285，165-169(1991))。密码子选择模式的这些差别似乎通过调节肽伸长比例来影响各个基因的整体表达水平。(Kurland，C.G.，FEBS Lett.，285，165-169(1991)；Pedersen，S.，EMBO J.，3，2895-2898(1984)；Sorensen，M.A.，J.Mol.Biol.，207，365-377(1989)；Randall，L.L.等，Eur.J.Biochem.，107，375-379(1980)；Curran，J.F.和Yarus，M.，JMol.Biol.，209，65-77(1989)；Varenne，S.等，J.Mol.Biol.，180，549-576(1984)，Varenne，S.等，J.Mol，Biol.，180，549-576(1984)；Garel，J.-P.，J.Theor.Biol.，43，211-225(1974)；Ikemura，T.，J.Mol.Biol.，146，1-21(1981)；Ikemura，T.，J.Mol.Biol.，151，389-409(1981))。
合成基因的优选密码子利用频率应当反映来源于精确的(或者尽可能密切相关)细胞/生物体的基因组的核基因的密码子利用，该细胞/生物体将被用于重组蛋白的表达，特别是酵母属的细胞/生物体。如上所讨论，在一个优选实施方案中，在此所描述的修饰之前或之后，人Tf序列被密码子优化以用于酵母表达，该序列可以是治疗性蛋白质的核苷酸序列。
载体用于本发明的表达单位通常包含如下元件，以5′到3′方向被可操作地连接转录启动子、分泌信号序列、被连接到编码目标的治疗性蛋白质或肽的DNA序列上的编码包含转铁蛋白或转铁蛋白的部分的被修饰的Tf融合蛋白的DNA序列，以及转录终止子。如上所讨论，被融合到Tf部分上或者被融合在Tf部分内的治疗性蛋白质或肽的任何排列可以被用于本发明的载体中。合适的启动子、信号序列和终止子的选择，将通过所选择的宿主细胞来确定，对于本领域的技术人员来说是显然的，将在下文中被更加清楚地讨论。
用于本发明中的合适酵母载体在美国专利6,291,212中被描述，包括YRp7(Struhl等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 761035-1039，1978)、YEp13(Broach等，Gene 8121-133，1979)、pJDB249和pJDB219(Beggs，Nature 275104-108，1978)、pPPC0005、pSeCHSA、pScNHSA、pC4及其衍生物。有用的酵母质粒载体还包括pRS403-406、pRS413-416和得自Stratagene CloningSystems，La Jolla，CA 92037，USA的毕赤氏酵母(Pichia)载体。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406都是酵母整合型质粒(YIps)并且纳入了酵母可选择标记HIS3、TUPI、LEU2和URA3。质粒pRS413-41.6是酵母中心粒质粒(YCps)。
这种载体通常包括可选择的标记，可以是任意大量具有显性表型的基因之一，由此，可以进行表型分析来选择转化体。优选的可选择标记是那些弥补宿主细胞营养缺陷的标记，产生抗生素抗性或使细胞能够利用特定的碳源，包括LEU2(Broach等ibid.)、URA3(Botstein等，Gene 817，1979)、HIS3(Struhl等，ibid.)或POT1(Kawasaki和Bell，EP171，142)。其它合适的选择性标记包括CAT基因，其赋予酵母细胞氯霉素抗性。用于酵母中的优选启动子包括来自酵母糖分解基因的启动子(Hitzeman等，J Biol.Chem.22512073-12080，1980；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Genet.1419-434，1982；Kawasaki，美国专利4,599,311)或乙醇脱氢酶基因的启动子(Young等，载于Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals，Hollaender等，(编辑)，355，Plenum，纽约，1982；Ammerer，Meth.Enzymol.101192-201，1983)。从这一点看，特别优选的启动子是TPI1启动子(Kawasaki，美国专利4,599,311)和ADH2-4C(美国专利6,291,212启动子(Russell等，Nature 304652-654，1983)。表达单位可能还包括转录终止子。优选的转录终止子为TPI1终止子(Alber和Kawasaki，ibid.)。其它优选载体和优选组分例如酵母表达系统中的启动子和终止子被公开在欧洲专利EP 0258067、EP 0286424、EP 0317254、EP0387319、EP 0386222、EP 0424117、EP 0431880和EP 1002095；欧洲专利申请公开EP 0828759、EP 0764209、EP 0749478和EP 0889949；PCT公开WO 00/44772和WO 94/04687；和美国专利5,739,007；5,637,504；5,302,697；5,260,202；5,667,986；5,728,553；5,783,423；5,965,386；6150,133；6,379,924和5,714,377中，在此全部引入作为参考。
除了酵母，本发明的被修饰的融合蛋白可以在丝状真菌中表达，例如，在曲霉菌菌株中。有用的启动子的例子包括那些来源于Aspergillus nidulans糖分解基因的启动子，例如adh3启动子(McKnight等，EMBO J.42093-2099，1985)和tpiA启动子。合适的终止子的例子为adh3终止子(McKnight等，ibid.)。利用这种元件的表达单位可以被克隆到能够插入到例如曲霉菌的染色体DNA中的载体中。
用于实现本发明的哺乳动物表达载体将包括能够引导被修饰的Tf融合蛋白的转录的启动子。优选启动子包括病毒启动子和细胞启动子。优选的病毒启动子包括来自腺病毒2的主要晚期启动子(Kaufman和Sharp，Mol.Cell.Biol.21304-13199，1982)和SV40启动子(Subramani等，Mol.Cell.Biol.1854-864，1981)。优选的细胞启动子包括小鼠金属硫蛋白1启动子(Palmiter等，Science 222809-814，1983)和小鼠Vκ(参见美国专利6,291,212)启动子(Grant等，Nuc.Acids Res.155496，1987)。特别优选的启动子是小鼠VH(参见美国专利6,291,212)启动子(Loh等，ibid.)。这种表达载体还可以含有位于启动子下游和编码转铁蛋白融合蛋白的DNA序列上游的一套RNA剪切位点。优选的RNA剪切位点可以从腺病毒和/或免疫球蛋白基因中获得。
在表达载体中还含有位于目标编码序列下游的聚腺苷酸信号。聚腺苷酸信号包括来自SV40的早期或晚期聚腺苷酸信号(Kaufman和Sharp，ibid.)，来自腺病毒5E1B区以及人生长基因终止子的聚腺苷酸信号(DeNoto等，Nucl.Acid Res.93719-3730，1981)。特别优选的聚腺苷酸信号为VH(参见美国专利6,291,212)基因终止子(Loh等，出处同上)。表达载体可以包括非编码的病毒前导序列，例如腺病毒2的三联前导序列，位于启动子和RNA剪切位点之间。优选的载体还可以包括增强子序列，例如SV40增强子和小鼠μ(参见美国专利6,291,212)增强子(Gillies，Cell 33717-728，1983)。表达载体还可以包括编码腺病毒VARNA的序列。
转化体用于转化真菌的技术在本领域是已知的，被描述在例如Beggs(ibid.)、Hinnen等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751929-1933，1978)、Yelton等，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811740-1747，1984)和Russell(Nature 301167-169，1983)中。还可以使用将克隆DNA序列导入真菌细胞中的其它技术，例如电穿孔(Becker和Guarente，Methods in Enzymol.194182-187，1991)。宿主细胞的基因型通常具有遗传缺陷，该缺陷由存在表达载体上的选择标记来弥补。选择特定宿主和可选择的标记在本领域普通技术人员的能力之内。
可以通过例如磷酸钙介导的转染将包含本发明的被修饰的Tf融合蛋白的克隆DNA序列导入到被培养的哺乳动物细胞中(Wigler等，Cell 14725，1978；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7603，1981；Graham和Van der Eb，Virology 52456，1973)。还可以采用将克隆DNA序列导入哺乳动物细胞中的其它技术，例如电穿孔(Neumann等，EMBO J.1841-845，1982)或脂转染。为了鉴定已经整合了克隆DNA的细胞，通常将可选择标记以及目标基因或cDNA插入到细胞中。培养哺乳动物细胞的优选可选择标记包括赋予对药物的抗性的基因，这些药物例如新霉素、潮霉素和氨甲蝶呤。可选择标记可以是可扩增的选择标记。优选的可扩增的选择标记为DHFR基因。特别优选的可扩增标记为DHFRr(参见美国专利6,291,212)cDNA(Simonsen和Levinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802495-2499，1983)。可选择标记在Thilly(Mammalian Cell Technology，Butterworth Publishers，Stoneham，Mass.)中被评述，并且选择可选择的标记在本领域普通技术人员的能力内。
宿主细胞本发明还包括被转化来表达本发明的被修饰的转铁蛋白融合蛋白的细胞，优选为酵母细胞。除了被转化的宿主细胞本身，本发明还包括这些细胞在营养液中的培养物，优选单克隆(纯系同源的)培养物或者来源于单克隆培养物的培养物。如果多肽被分泌，则培养液中含有该多肽和细胞，或者细胞被过滤或离心掉，则不含细胞。
用于实现本发明的宿主细胞包括真核细胞，有时为原核细胞，能够用外源DNA转化或转染，并在培养液中生长，例如被培养的哺乳动物、昆虫、真菌、植物和细菌细胞。
真菌细胞，包括酵母类(例如酵母属，裂殖酵母属，毕赤氏酵母属)可以被用作本发明中的宿主细胞。包括被期望用于实现本发明、作为表达本发明的转铁蛋白融合蛋白的酵母的真菌的例子是毕氏酵母属(其中的某些种类以前被分类为汉逊酵母属(Hansenula))，酵母属，克鲁维酵母菌属，曲霉菌属，念珠菌属，球拟酵母属(Torulopsis)，孢圆酵母属(Torulaspora)，裂殖酵母，固囊酵母属(Citeromyces)，Pachysolen，接合酵母属(Zygosaccharomyces)，德巴利酵母属(Debaryomyces)，木霉属(Trichoderma)，头孢霉属，腐质霉菌属(Humicola)，毛霉菌属，脉孢菌属，Yarrowia，Metschunikowia，Rhodosporidium，Leucosporidium，Botryoascus，锁掷孢酵母属(Sporidiobolus)，拟内孢霉菌属(Endomycopsis)等。酵母菌属的例子为酿酒酵母、S.italicus和S.Rouxii克鲁维酵母菌属的例子为K fragilis、K lactis和Kmarxianus。合适的孢圆酵母属种类为T.delbrueckii。毕赤氏酵母菌属的例子为P.angusta(以前称作H.polymorpha)、P.anomala(以前称作H.anomala)和P.pastoris。
用于制备本发明的Tf融合蛋白的特别有用的宿主细胞为甲基营养Pichia pastoris(Steinlein等(1995)Protein Express.Purif 6619-624)。自从Pichia pastoris的醇氧化酶(alcohol oxidase)启动子被分离和克隆以来，Pichiapastoris已经被开发作为制备外源蛋白的重要宿主；其转化体首次在1985年被报导。在缺乏葡萄糖时，P.pastoris能够利用甲醇作为碳源。P.pastoris表达系统能够利用甲醇诱导的醇氧化酶(AOX1)启动子，该启动子控制编码用于醇氧化酶的表达的基因，醇氧化酶催化甲醇代谢的第一个步骤。该启动子被表征，并且被插入到一系列P.pastoris表达载体中。由于在P.pastoris中生成的蛋白质通常能够正确地折叠，并被分泌到培养液中，遗传工程化的P.pastoris的发酵提供一种作为大肠杆菌表达系统的优良替代。大量蛋白质已经采用这种系统进行制备，包括破伤风毒素片段、百日咳博德特氏菌(Bordatella pertussis)粘着素(pertactin)、人血清白蛋白和溶菌酶。
酿酒酵母菌株是另一种优选宿主。在一个优选实施方案中，使用酵母细胞，或者特别是在糖蛋白的天冬酰胺偶联的糖基化所需的基因中具有遗传缺陷的酿酒酵母宿主细胞。具有这种缺陷的酿酒酵母宿主细胞通过常规的突变和选择技术来制备，尽管许多可以获得的酵母菌株已经被修饰来防止或减少糖基化或超甘露糖基化。Ballou等(J.Biol.Chem.2555986-5991，1980)已经描述了缺乏影响天冬酰胺偶联糖基化的基因的甘露糖蛋白生物合成突变体的分离。Gentzsch和Tanner(Glycobiology 7481-486，1997)已经描述了一个至少6个基因(PMT1-6)的家族，这些基因编码负责酵母中的O-联糖基化的第一步的酶。缺乏这些基因中的一个或多个的突变体表现出O-联糖基化下降和/或O-联糖基化的特异性改变。
为了优化异源蛋白的制备，优选宿主菌株具有突变，例如酿酒酵母的pep4突变(Jones，Genetics 8523-33，1977)，导致蛋白质水解活性下降。对于制备大量本发明的Tf融合蛋白来说，在其它蛋白酶编码区中具有突变的宿主菌株是特别有用的。
含有本发明的DNA构建体的宿主细胞在适当生长培养液中生长。如在此所用，术语“适当的生长培养液”是指含有细胞生长所需营养的培养液。细胞生长所需营养包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、矿物质和生长因子。生长培养液通常用于筛选含有DNA构建体的细胞，通过例如药物选择或缺乏关键营养，营养缺乏通过DNA构建体上的可选择标记来弥补，或者用DNA构建体共转染。酵母细胞，例如，优选在化学成分确定的培养液中生长，培养液中含有碳源，例如蔗糖，非氨基酸的氮源，无机盐，维生素和必需氨基酸添加剂。培养液的pH优选维持在大于2并小于8的pH下，优选为pH5.5-6.5。维持稳定的pH的方法包括进行缓冲和持续的pH控制。优选的缓冲试剂包括琥珀酸和Bis-Tris(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)。缺失天冬酰胺偶联糖基化所需基因的酵母细胞优选在含有渗透稳定剂的培养液中生长。优选的渗透稳定剂是被添加到培养液中的山梨醇，其浓度在0.1M和1.5M之间，优选为0.5M或1.0M。
被培养的哺乳动物细胞一般在可以购买得到的含血清或无血清培养液中生长。选择适合于特定细胞系的培养液在本领域普通技术人员的能力内。被转染的哺乳动物细胞生长一段时间，通常为1-2天，并开始表达目标DNA序列。然后进行药物选择，选择以稳定的方式表达可选择标记的细胞的生长。对于已经用可扩增的选择标记转染的细胞来说，可以逐步提高药物浓度来选择拷贝数增加的克隆序列，从而提高表达水平。
杆状病毒/昆虫细胞表达系统也可以被用于制备本发明的被修饰Tf融合蛋白。BacPAKTM杆状表达表达系统(BD Biosciences(Clontech))在昆虫宿主细胞中高水平地表达重组蛋白。目标基因被插入到转化载体中，该载体与线性化的BacPAK6病毒DNA一起被共转染到昆虫宿主细胞中。BacPAK6 DNA缺乏杆状病毒基因组的关键部分。当DNA与载体结合时，该关键元件被恢复，而目标基因被转移到杆状病毒的基因组中。重组后，少数病毒斑被挑取和纯化，验证重组表型。然后，新分离的重组病毒被扩增，并用于感染昆虫细胞培养物来制备大量的期望蛋白质。
本发明的Tf融合蛋白还可以用转基因植物和动物来制备。例如，绵羊和山羊在其乳汁中生成治疗性蛋白质。烟草植物在其叶片中包括该蛋白质。转基因植物和动物生产蛋白质，都包括将编码融合蛋白的新基因添加到生物体的基因组中。转基因生物体不仅能够生成新的蛋白质，而且能够将这种能力传递给其后代。
分泌信号序列术语“分泌信号序列”或者“信号序列”或者“分泌前导序列”可以被相互交换使用，被描述在美国专利6,291,212和美国专利5,547,871中，这两个专利在此全部引入作为参考。分泌信号序列或信号序列或分泌前导序列编码分泌肽。分泌肽是引导成熟多肽或蛋白质从细胞中分泌出来的氨基酸序列。通常，分泌肽的特征在于一个疏水氨基酸核心，并且典型地(但是不是唯一地)存在于新合成的蛋白质的氨基末端。在分泌过程中，分泌肽通常从成熟蛋白质上被裂解下来。分泌肽可能含有加工位点，使得在经过分泌路径时，信号肽从产生蛋白质上裂解下来。加工位点被编码在信号肽申，或者例如通过诱变被添加到信号肽中。
分泌肽可以被用于引导本发明的被修饰Tf融合蛋白的分泌。可用于与其它分泌肽结合的一种这种分泌肽为α交配因子前导序列。分泌信号序列或信号序列或分泌前导序列是一系列复杂的翻译后加工步骤所需的，这些步骤导致蛋白质的分泌。如果存在完整的信号序列，被表达的蛋白质进入粗面内质网的内腔，然后通过高尔基体转运到分泌小泡中，最后被转运到细胞外。通常，信号序列紧跟在起始密码子后面，并且编码被分泌的蛋白质的氨基末端的信号肽。在大多数情况下，信号序列被称作信号肽酶的特定蛋白酶裂解掉。优选的信号序列提高由病毒、哺乳动物或酵母病毒载体表达的重组蛋白质的加工和外排效率。在有些情况下，天然的Tf信号序列被用于表达和分泌本发明的融合蛋白。
接头本发明的被修饰转铁蛋白融合蛋白的Tf部分和治疗性蛋白质可以直接融合或者采用各种长度的接头肽来融合，以在被融合的蛋白质之间产生更大的物理分离和更大的空间灵活性，从而最大化治疗性蛋白质的例如结合其关联受体的可达性。接头肽由柔韧的或刚性更大的氨基酸组成。例如，接头例如但是不限于多聚甘氨酸序列。接头可以少于约50个，40个，30个，20个或10个氨基酸残基。接头可以被共价地连接到转铁蛋白或其部分与治疗性蛋白质之间。
Tf融合蛋白的检测生物活性的被修饰的转铁蛋白融合蛋白的检测分析包括Western转移、蛋白质印迹或菌落滤膜(colony filter)，以及检测包含转铁蛋白和治疗性蛋白质的融合蛋白的活性分析。Western转移滤膜可以采用Towbin等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 764350-4354，1979)描述的方法来制备。简而言之，样本在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。将凝胶中的蛋白质通过电泳转移到硝化纤维纸上。蛋白质印迹滤膜通过用例如Minifold(Schleicher & Schuell，Keene，N.H.)将上清液样本或浓缩物过滤在硝化纤维滤纸上来制备。菌落滤膜通过在硝化纤维素滤膜培养菌落来制备，该滤膜被铺展在适当的生长培养液上。在这种方法中，固体培养液是优选的。细胞在滤膜上生长至少12小时。用不会去除结合到滤膜上的蛋白质的恰当缓冲液来冲洗滤膜，去除细胞。优选的缓冲液包含25mM Tris-碱，19mM甘氨酸，pH8.3，20％甲醇。
本发明的转铁蛋白融合蛋白用放射性同位素或者其它显像剂标记，用于体内诊断目的。优选的放射性同位素显像剂包括碘-125和锝-99，锝-99是特别优选的。用于制备蛋白质表位偶联物的方法在本领域是已知的，被描述在例如Eckelman等(美国专利4,652,440)，Parker等(WO 87/05030)和Wilber等(EP 203,764)中。可替代地，转铁蛋白融合蛋白被结合到自旋标记物增强剂上，用于磁共振(MR)显像。合适的自旋标记物增强剂包括稳定的、空间障碍的、自由基化合物，例如硝基氧。用于MR显像标记配体的方法被公开在，例如Coffman等(美国专利4,656,026)中。
通过将治疗性蛋白质偶联(即物理上连接)到可检测的物质上来方便本发明的转铁蛋白融合蛋白的检测。可检测的物质的例子包括各种酶，辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或者乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸盐、若丹明、二氯三连氮基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括发光氨；生物发光材料的例子包括荧光素酶、虫荧光素和发光蛋白质，合适的放射性材料的例子包括125I、131I、35S或3H。
在一个实施方案中，分析本发明的转铁蛋白融合蛋白结合或与抗原竞争结合抗体的能力，可以采用本领域知晓的各种免疫测定方法，包括但是不限于，采用例如放射性免疫测定、ELISA(酶链式免疫吸收分析)、夹心式免疫测定、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、原位免疫分析(例如采用胶体金、酶或放射性同位素标记)、western印迹、沉淀反应、凝集分析(例如凝胶凝集分析)、补体结合分析、荧光免疫分析、蛋白A分析和免疫电泳分析等的竞争性和非竞争性的分析体系。在一个实施方案中，通过检测转铁蛋白融合蛋白上的标记来检测转铁蛋白融合蛋白的结合。在另一个实施方案中，通过检测与转铁蛋白融合蛋白相互作用的第二抗体或试剂的结合来检测转铁蛋白融合蛋白。在另一个实施方案中，第二抗体或试剂被标记。已知在本领域有许多方法被用于检测免疫测定中的结合，这些方法在本发明的保护范围内。
还通过测定治疗性蛋白质部分的活性来检测本发明的融合蛋白。特别地，采用本领域普通技术人员知晓的分析方法来分析本发明的转铁蛋白融合蛋白的功能活性(例如，生物学活性或治疗活性)。此外，本领域技术人员能够采用熟知的分析方法常规地分析对应于本发明的融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白质的活性。此外，本领域技术人员能够采用熟知的分析方法常规地分析被修饰的转铁蛋白的片段的活性。
例如，在一个实施方案中，可以采用本领域的各种免疫测定方法来分析本发明的转铁蛋白融合蛋白结合或与治疗性蛋白质竞争地结合抗治疗性多肽的抗体和/或抗转铁蛋白的抗体的能力，包括但是不限于，采用例如放射性免疫测定、ELISA(酶链式免疫吸收分析)、夹心式免疫测定、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、原位免疫分析(例如采用胶体金、酶或放射性同位素标记)、western印迹、沉淀反应、凝集分析(例如凝胶凝集分析)、补体结合分析、荧光免疫分析、蛋白A分析和免疫电泳分析等的竞争性和非竞争性的分析体系。在一个实施方案中，通过检测第一抗体上的标记来检测抗体结合。在另一个实施方案中，通过检测第二抗体或试剂与第一抗体的结合来检测第一抗体。在还有一个实施方案中，第二抗体被标记。许多本领域已知的方法用于检测免疫测定中的结合，这些方法在本发明的保护范围内。
在还有一个实施方案中，当治疗性蛋白质的结合配偶体(例如受体或配基)被确定，含有治疗性蛋白质作为融合物的治疗性蛋白质部分的转铁蛋白融合蛋白与结合配偶体的结合可以例如，通过本领域知晓的方法来测定，这些方法例如还原的和非还原的凝胶层析、蛋白质亲合层析和亲合印迹。其它方法对于技术人员来说是已知的，在本领域的保护范围之内。
融合蛋白质的制备本发明还提供采用在此公开的核酸分子制备本发明的被修饰的融合蛋白的方法。总的来说，重组形式的蛋白质的制备通常包括如下步骤。
首先获得编码本发明的转铁蛋白融合蛋白的核酸分子。然后优选将核酸分子以可操作的连接与合适的控制序列连接在一起，如上所述，形成含有蛋白质开放阅读框的表达单位。用表达单位来转化合适的宿主，在允许重组蛋白生成的条件下培养被转化的宿主。可选择地，从培养液或从细胞中分离重组蛋白质；在某些允许存在一些杂质的情况下，蛋白质的回收和纯化不是必需的。
前述的各个步骤可以各种方式来完成。例如，在各种宿主中，可操作的表达载体的构建采用如上列举的适当复制子和控制序列来实现。控制序列、表达载体和转化方法取决于表达基因的宿主细胞类型，先前已经被详细讨论过，同样是本领域技术人员知晓的。如果在正常情况下不能获得合适的限制性位点，可以被添加到编码序列的末端，产生可以被插入到这些载体中的可切割基因。技术人员能够容易地改进本领域熟知的任何宿主/表达系统，与本发明的核酸分子一起使用来制备期望的重组蛋白质。
如上所讨论，可以采用任何表达系统，包括酵母、细菌、动物、植物、真核和原核系统。在某些实施方案中，酵母、哺乳动物细胞培养物和转基因动物或植物生产系统是优选的。在其它实施方案中，采用被改进来降低天然酵母糖基化、超糖基化或蛋白质水解活性的酵母系统。
被修饰的转铁蛋白融合蛋白的分离/纯化从宿主细胞培养液中分离被分泌的具有生物活性的被修饰转铁蛋白融合蛋白，宿主细胞在允许生物活性融合蛋白分泌的条件下生长。从培养液中去除细胞物质，采用本领域知晓的分离技术分离生物活性融合蛋白。合适的技术包括通过各种层析方法来进行沉淀和分馏，包括凝胶过滤、离子交换层析和亲合层析。
特别优选的纯化方法是在离子结合或金属螯合柱上进行亲合层析，或采用定向抗多肽融合物的转铁蛋白或治疗性蛋白质的抗原进行免疫亲合层析。这些抗原优选被固定在或结合到固体支持物或基底上。特别优选的基底是CNBr-活化的琼脂糖(Pharmacia LKB Technologies，Inc.，Piscataway，N.J.)。通过这种方法，在允许结合发生的条件下，培养液与抗原/基底结合。洗涤复合物来去除未被结合的物质，采用不利复合物形成的条件来释放或洗脱转铁蛋白融合蛋白。特别有用的洗脱方法包括改变pH，其中在第一个pH下，被固定的抗原对转铁蛋白融合蛋白具有很高的亲合性，而在第二个(更高或更低)pH下，亲合性下降；改变洗脱液的浓度；或者使用去垢剂。
将药物或治疗性蛋白质递送到细胞内部和/或跨越血脑屏障(BBB)在本发明的保护范围内，被修饰的转铁蛋白融合蛋白可以被用作载体来将复合到转铁蛋白的铁离子上的分子或小分子递送到细胞的内部或者跨越血脑屏障或者其它屏障，包括跨越任何天然表达或者被工程化来表达Tf受体的细胞类型的细胞膜。在这些实施方案中，Tf融合蛋白通常被工程化或者被修饰来抑制、防止或去除糖基化，延长融合蛋白和/或治疗性蛋白质部分的血清半衰期。特别包括添加目标肽来进一步将Tf融合蛋白靶向到特定细胞类型上，例如癌细胞。
在一个实施方案中，含铁的抗贫血药物，铁-山梨糖醇-柠檬酸盐复合物被添加到被本发明的修饰的Tf融合蛋白中。已经证明，铁-山梨糖醇-柠檬酸盐(FSC)在体外抑制各种鼠癌细胞的增殖，在体内致使肿瘤衰退，但是对非恶性细胞的增殖不产生任何作用(Poljak-Blazi等(June 2000)CancerBiotherapy and Radiopharmaceuticals(美国)，15/3285-293)。
在另一个实施方案中，都与铁离子形成复合物的抗肿瘤药物阿霉素(doxorabicin)和/或化疗药物博来霉素，被添加到本发明的Tf融合蛋白上。在其它实施方案中，制备药物的盐，例如，柠檬酸盐或碳酸盐，并与铁离子复合，然后结合到Tf上。由于肿瘤细胞常常具有较高的铁周转率(turnoverrate)；转铁蛋白被修饰来携带至少一种抗肿瘤剂，提供一种提高试剂暴露或加载到肿瘤细胞上的方法(Demant，E.J.，(1983)Eur.J.Biochem.137/(1-2)113-118；Padbury等(1985)J.Biol.Chem.260/137820-7823)。
药物制剂与治疗方法采用标准的施用操作，将包含本发明的被修饰的转铁蛋白的被修饰的融合蛋白施用给需要的患者。例如，本发明的被修饰的Tf转铁蛋白可以单独或结合或顺序结合其它调节特定病理过程的试剂来被提供。如在此所用，当两种试剂同时被施用或者以使得两种试剂同时或接近同时起作用的方式被施用时，这两种试剂被认为是被组合地施用。
本发明的融合蛋白可以通过胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、经皮和口腔的路径被施用。例如，一种试剂通过微灌注(microinfusion)被局部地施用到损伤部位。可替代地，或者同时地，施用可以是非侵入性的，通过口服、吸入、鼻腔或肺部路径。被施用的剂量将取决于受体的年龄、健康状况和体重，并行治疗法的类型，如果存在，治疗频率和期望的作用特点。
虽然任何施用方法可以被用于递送本发明的mTF融合蛋白，对于特定类型的融合蛋白或对于治疗特定病症来说，口服施用或递送是优选的实施方案。
本发明还提供含有一种或多种本发明的融合蛋白的组合物。虽然个体需要是不同的，确定各种组分的有效量的最佳范围属于本领域的技术。典型的剂量包含约1pg/kg到约100mg/kg体重。用于系统施用的优选剂量包含约100ng/kg到约100mg/kg体重。通过微灌注直接施用到部位的优选剂量包含约1ng/kg到约1mg/kg体重。当通过直接注射或微灌注施用时，本发明的被修饰融合蛋白可以被工程化来减少或不与铁结合，以部分地防止局部化的铁毒性。
除了药学活性的融合蛋白，本发明的组合物含有合适的药学上可接受的载体，包括方便将活性化合物加工成制备物的赋形剂和辅料，可以在药学上使用制备物来递送到作用部位。用于胃肠外施用的合适制剂包括可溶于水形式的活性化合物的水溶液，例如，可溶于水的盐。此外，可以施用作为适当的油性注射悬浮液的活性化合物的悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括油脂，例如，芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯。水溶性注射悬浮液可以含有提高悬浮液的粘性的物质，包括，例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和葡聚糖。可选择地，该悬浮液还可以含有稳定剂。脂质体也可以被用于包囊被递送到细胞中的试剂。
按照本发明的用于系统施用的药物制剂可以被配制成用于肠道的、胃肠外的或局部的施用。实际上，可以同时使用所有三种类型的制剂，达到系统施用活性成分的效果。用于口服施用的合适制剂包括硬的或软的明胶胶囊，药丸，片剂，包括糖衣片剂，药丹，悬浮液，糖浆或吸入剂及其控制释放形式。
本发明的药物组合物可以为剂量单位形式，例如，为片剂或胶囊。在这种形式中，组合物被细分成含有适当含量活性成分的单位剂量；单位剂量形式可以是被包装的组合物，例如，被包装的粉末，药水瓶，针剂，预装的注射器或含有液体的袋子。单位剂量形式可以是，例如，胶囊或片剂本身，或者可以是合适数量的包装形式的任何这种组合物。被用于治疗中的剂量必需由主治医生主观确定。
在实施本发明的方法中，本发明的融合蛋白可以单独地或组合地或结合其它治疗性或诊断性试剂地被使用。在特定优选实施方案中，本发明的组合物可以与其它化合物共同施用，这些化合物按照通常可接受的医疗实践被开成处方用于这些病症。本发明的组合物可以在体内使用，通常在哺乳动物中，例如人、绵羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠，或者体外使用。
口服药物组合物以及递送方法在本发明中，Tf融合蛋白，包括但是不限于被修饰的Tf融合蛋白，可以被配制用于口服递送。特别地，被用于治疗特定类型的疾病或医学病症的本发明的特定融合蛋白特别适合于口服制剂和递送。这种类型的疾病或病症包括，但是不限于，急性的、慢性的和反复发作的疾病。慢性的或反复发作的疾病包括，但是不限于，病毒性疾病或感染，癌症，代谢疾病，肥胖，自体免疫性疾病，炎症性疾病，过敏症，移植物抗宿主疾病，全身性微生物感染，贫血，心血管疾病，精神病，遗传病，神经退行性疾病，造血细胞异常，内分泌系统疾病或生殖疾病，胃肠道疾病。这些类型的疾病的例子包括糖尿病，多发性硬化，哮喘，HCV或HIV感染，高血压，高胆固醇血症，动脉硬化(scherosis)，关节炎和Alzheimer病。在许多慢性疾病中，本发明的Tf融合蛋白的口服制剂和施用方法是特别有用的，这是由于通过在家口服施用可以长期进行患者护理和治疗，而不依赖于可注射的治疗或药物方案。
包含本发明的Tf融合蛋白性口服制剂和递送方法部分地利用转铁蛋白受体介导的转胞吞作用穿过胃肠道(GI)上皮。Tf受体高浓度地存在于人GI上皮，转铁蛋白对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化具有极高的抵抗力，而Tf化学偶联物已经被用于成功地递送蛋白质和肽穿过GI上皮(Xia等，(2000)J.Pharmacol.Experiment.Therap.，295594-600；Xia等(2001)PharmaceuticalRes.，18(2)191-195；和Shah等(1996)J.Pharmaceutical Sci.，85(12)1306-1311，全部在此全文引入作为参考)。一旦被转运穿过GI上皮，本发明的Tf融合蛋白在血清中的半衰期被延长，与未被融合状态下的治疗性蛋白质或肽相比，被连接或插入到Tf中的治疗性蛋白质或肽具有被延长的血清半衰期。
可以制备适合被转运到GI上皮的本发明的Tf融合蛋白的口服制剂，以在胃内保护Tf融合蛋白和其它的活性组分。这种制剂可以包括载体和分散组分，可以为任何合适的形式，包括气雾剂(用于口腔或肺部递送)、糖浆、药丹、片剂，包括可咀嚼的片剂，硬的或软的胶囊、药片、止咳糖浆、水溶性的或油性的悬浮液、乳剂、扁胶剂或球形颗粒，和可分散的粉末。优选地，Tf融合蛋白制剂以适合于精确剂量的简便施用，优选口服施用的固体剂量形式被使用。口服施用的固体剂量形式优选为片剂、胶囊等。
对于片剂或胶囊形式的口服施用，需要注意确保有足够的活性成分被宿主吸收以产生有效反应。因此，例如，应当提高Tf融合蛋白的含量超过理论所需量，或者采用其它已知措施例如包被或胶囊化，防止多肽在胃内被酶促作用。
典型地，肽和蛋白质药物通过注射被施用，这是由于当通过非胃肠外施用，特别是口服施用时，它们的生物利用度很低。这些药物倾向于化学和构象不稳定，常常被胃内的酸性条件以及胃内的和胃肠道的酶降解。为了克服这些递送问题，已经开发出某些用于口服递送的技术，例如封装在作为药物载体的由具有疏水主链和亲水分支的聚合物组成的纳米颗粒中，封装在微粒中，插入到乳剂中的脂质体中，和偶联到其它分子上。所有这些都可以与本发明的Tf融合分子一起使用。
纳米颗粒的例子包括用壳聚糖和Carbopol包被的粘膜吸附纳米颗粒(Takeuchi等，Adv.Drug Deliv.Rev.47(1)39-54，2001)和含有带电的组合聚酯、多聚(2-磺丁基-乙烯醇)和多聚(D，L-乳酸共羟基乙酸)(Jung等，Eur.J.Pharm.Biopharm.50(1)147-160，2000)。当含有具有多聚-N-异丙基丙烯酰胺区和阳离子多聚-乙烯酰胺基团的表面聚合物的纳米颗粒被口服施用给大鼠时，表现为鲑降钙素(salmon calcitonin)吸收改善。
由藻酸盐和胶质组成的药物递送颗粒，用多聚赖氨酸加强，具有相对的酸碱抵抗性，可以被用作药物的载体。这些颗粒结合了生物附着、增强吸收和持续释放的优点(Liu等，J.Pharm.Pharmacol.51(2)141-149，1999)。
此外，脂氨基酸基团和脂糖基团被偶联到肽例如合成的生长激素抑制素的N末端和C末端上，形成两性的表面活性剂，生成了保留生物学活性的组合物(Toth等，J.Med.Chem.42(19)4010-4013，1999)。
其它的肽递送技术的例子包括carbopol包被的含有目标肽的粘膜附着乳剂，亚硝基N-乙酰-D，L-青霉胺和carbolpol或牛磺胆酸和聚羧乙烯(carbopol)。已经证明，当这些物质被口服施用给大鼠时，有效降低血清的钙浓度(Ogiso等，Biol.Pharm.Bull.24(6)656-661，2001)。来自卵磷脂的磷脂酰乙醇被用于制备作为胰岛素载体的含有磷脂酰乙醇的脂质体。已经证明，当被口服施用给大鼠时，这些脂质体是有活性的(Kisel等，Int.J.Pharm.216(1-2)105-114，2001)。
胰岛素也被配制在多聚(乙烯醇)中-凝胶球体，该球体含有胰岛素和蛋白酶抑制剂，例如抑酶肽或杆菌肽。已经证明，在大鼠中这些凝胶球体具有降低葡萄糖的特性，而胰岛素在小肠下段(lower intestine)被大量释放(Kimura等，Biol.Pharm.Bull.19(6)897-900，1996。
已经用多聚(烷基氰基丙烯酸酯)构成的纳米颗粒研究胰岛素的口服递送，该纳米颗粒与表面活性剂分散在油相中(Damge等，J.Pharm.Sci.86(12)1403-1409，1997)，并采用用壳聚糖包被的藻酸钙珠(Onal等，Artif.Cells BloodSubstit.Immobil.Biotechnol.30(3)229-237，2002)。
在其它方法中，肽的N末端和C末端被连接到聚乙二醇上，然后连接到烯丙基链上形成偶联物，该偶联物对酶促降解的抵抗性和通过GI壁的扩散性都被提高(www.nobexcorp.com)。
BioPORTER是一种阳离子脂质混合物，非共价地与肽相互作用来产生保护性包被或涂层。肽-脂质复合物能够融合到细胞的质膜上，该肽被内化到细胞中(www.genetherapysystems.com)。
在采用脂质体作为起始材料的方法中，螺旋形的颗粒被开发作为药物媒介物。将肽添加到主要含有负电荷脂质的脂质体悬浮液中。钙的加入引起脂质体瓦解，融合成由脂质双层构成的大片层，然后该片层自发地卷曲或堆叠成螺旋形(美国专利5,840,707；http//www.biodeliverysciences.com)。
用于口服用途的含有Tf融合蛋白的组合物可以按照任何本领域知晓的用于药物组合物加工的方法来制备，这种组合物含有一种或多种选自甜味剂的试剂，以产生药学上优良的和美味的制备物。例如，为了制备可口服递送的片剂，Tf融合蛋白与至少一种药物赋形剂混合，按照已知方法将该固体制剂压成片剂，被递送到胃肠道中。片剂组合物通常用添加剂配制，例如糖类或纤维素载体，粘合剂例如淀粉糊或甲基纤维素，填充剂，分解剂或其它通常用于药物制备物加工的添加剂。为了制备口服递送的胶囊，DHEA与至少一种药物赋形剂混合，将固体制剂放置在适合递送到胃肠道中的囊状容器中。可以如雷明顿药物科学第18版，1990(Mack Publishing Co.EastonPa.18042)第89章中一般描述的方法来制备保护Tf融合蛋白的组合物，其在此引入作为参考。
如上所述，本发明的口服制剂可能含有抵抗胃环境并在肠道中释放生物活性物质的惰性成分。这种制剂或肠衣在本领域是熟知的。例如，可以使用含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的Tf融合蛋白的片剂，该赋形剂适合于片剂加工。这些赋形剂可以是惰性的稀释剂，例如碳酸钙，碳酸钠，乳糖，磷酸钙或磷酸钠；粒化剂和分解剂，例如玉米淀粉、明胶或阿拉伯树胶，以及滑润剂，例如硬脂酸镁硬脂酸或滑石粉。
片剂可以是未包被的，或者用已知技术包被来延迟在胃肠道中的分解和吸收，从而在一段较长的时间内产生持续的作用。例如，延时物质，例如甘油基一硬脂酸盐或甘油基二硬脂酸盐可以单独地或与腊一起应用。
用于口服使用的制剂还可以用明胶胶囊递送，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，例如，碳酸钙，磷酸钙或高岭土，或者作为软的明胶胶囊递送，其中活性成分与水溶性或油性溶液混合，例如，花生油(rachis oil)，花生油(peanut oil)，液体石蜡或橄榄油。
水溶性悬浮液可以含有与适合水溶性悬浮液加工的赋形剂混合的Tf融合蛋白。这种赋形剂是悬浮剂，例如，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟基丙基甲基纤维素，藻酸钠，聚乙烯吡咯烷酮，黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或湿润剂可以是天然磷脂，例如，卵磷脂，或氧化亚烃基与脂肪酸的缩聚产物，例如聚氧化乙烯硬脂酸盐，或氧化乙烯与长链脂肪醇的浓缩产物，例如七癸基乙基氧化十六烷醇(heptadecylethyloxycetanol)或氧化乙烯和来源于脂肪酸与己糖醇的不完全酯的缩聚产物，例如聚氧乙烯山梨醇一油酸酯，或氧化乙烯与来源于脂肪和己糖醇酐的不完全酯的缩聚产物，例如聚氧乙烯山梨聚糖一油酸酯。水溶性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，例如亚基或n-丙基p-羟基苯甲酸酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。
油性悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油中来配制，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，或者悬浮在矿物油中，例如液体石蜡。油性悬浮液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或十六醇。还可以添加甜味剂，例如上面列举的那些，以及调味剂来产生一种美味的口服制备物。可以通过添加一种抗氧化剂例如抗坏血酸来保存这些组合物。
适合于通过添加水来制备水溶性悬浮液的可分散的粉末和颗粒提供具有活性成分以及含有分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂的混合物。合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂由上面提及的那些试剂例证。还存在其它赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
含有Tf融合蛋白的药物组合物还可以是油溶于水的乳剂形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或者矿物油，例如，阿拉伯树胶或黄蓍胶，天然卵磷脂(phosphotides)，例如大豆卵磷脂，以及来源于脂肪酸和己糖醇酐的酯或不完全酯，例如，山梨聚糖一油酸和相同的不完全酯与氧化乙烯的缩聚产物，例如聚氧乙烯山梨聚糖一油酸酯。乳剂还可以含有甜味剂和调味剂。
还可以用甜味剂来配制含有Tf融合蛋白的糖浆和药丹，例如，甘油，山梨醇或蔗糖。这种制剂还可以含有缓和剂、防腐剂和调味剂和着色剂。药物组合物可以是可注射的无菌制备物形式，例如，作为可注射的无菌水溶性或油质性悬浮液。该悬浮液可以采用那些合适的上面提及的分散剂或湿润剂和悬浮剂，按照已知方法来配制。可注射的无菌制备物还可以是溶于无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的可注射的无菌溶液或悬浮液，例如，溶于1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的媒介物和溶剂中，可以被使用的是水，Ringer溶液和等渗的氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油脂通常被用作溶剂或悬浮液。此时，任何无味的不挥发性油可以被使用，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可以用于注射剂的制备。
还可以采用聚酯微球、玉米蛋白微球、类蛋白微球、多聚氰基丙烯酸盐微球和脂质系统来配制用于口服递送的药物组合物(参见，例如DiBase和Morrel，Oral Delivery of Microencapsulated Proteihs，载于Protein DeliveryPhysical Systems，Sanders和Hendren(编辑)，255-288(Plenum Press 1997))。
药物活性Tf融合蛋白与载体和/或其它物质的比例可以在约0.5到约100wt％(重量百分比)之间变化。对于口服使用，药物制剂通常含有重量为约5到约100％的活性物质。对于其它使用，该制剂将通常含有约0.5到约50wt％的活性物质。
用于本发明的Tf融合蛋白制剂被施用给个体时产生有效量的Tf融合蛋白。如本文所用，Tf融合物的“有效量”是足以有效改善疾病病症的含量。
虽然不是必需的，可以每日施用有效改善病症的含量的本发明的Tf融合蛋白组合物。一般地，总日剂量至少为约50mg，优选至少为约100mg，更加优选为至少约200mg，和最优选不超过500mg/天，口服施用，例如以4粒胶囊或片剂，每粒含有50mgTf融合蛋白。用于口服递送的胶囊或片剂通常含有每天全部的口服剂量，例如200mg或更高剂量。
在特别优选的实施方案中，包含Tf融合蛋白的药物组合物被配制成缓冲的液体形式，然后被封装到软包被或硬包被的明胶胶囊中，然后在胶囊上包裹适当的肠衣。对于本发明的口服药物组合物来说，释放区域可以是GI系统中的任何部位，包括小肠(十二指肠、空肠或回肠)或者大肠。
在其它实施方案中，用已知的延时释放制剂配制本发明的口服组合物，在GI系统中缓释活性成分，包括本发明的Tf融合蛋白。
用于口服递送的本发明的Tf融合蛋白能够结合存在于GI上皮中的Tf受体。为了便于这种结合以及受体介导的转运，本发明的Tf融合蛋白通常被制备成Tf部分上结合了铁，有时为碳酸盐。往本发明的融合蛋白组合物的Tf部分上添加铁和碳酸盐的处理和方法是本领域已知的。
在一些本发明的药物组合物中，Tf融合蛋白的Tf部分被修饰来提高Tf部分对铁的亲合性或亲合力。这些方法在本领域是已知的。例如，可以采用诱变来制备对铁的亲合力高于天然转铁蛋白的突变转铁蛋白部分。在人血清转铁蛋白中，作为金属铁螯合的配基的氨基酸包括但是不限于SEQ ID NO3的N端圆形突出物(N lobe)的氨基酸Asp63，Tyr95，Tyr188，Lys206，His207和His249；以及C端圆形突出物(C lobe)的氨基酸Asp392，Tyr426，Tyr517和His585(氨基酸边上的数字表示该氨基酸残基在一级氨基酸序列上的位置，而成熟蛋白的缬氨酸被指定为位置1)。参见美国专利5,986,067，其在此引入作为参考。在一个实施方案中，N端圆形突出物中的Lys206和His207的残基分别用Gln和Glu替换。
在本发明的一些药物制剂中，Tf融合蛋白被工程化，在治疗性蛋白质或肽和Tf部分之间含有裂解位点。这种可裂解的位点或接头在本领域是已知的。
本发明的药物组合物和本发明的方法包括添加转胞吞作用增强剂，方便融合蛋白转运穿过GI上皮。这些增强剂在本领域是已知的。参见Xia等，(2000)J.Pharmacol.Experiment.Therap.，295594-600；和Xia等(2001)Pharmaceutical Res.，18(2)191-195。
在本发明的优选实施方案中，口服药物制剂包括包含被融合到上述的胰岛素或GLP-1蛋白质或肽的N末端上的被修饰的Tf部分的Tf融合蛋白，被修饰的Tf部分的糖基化减少或无糖基化。通过口服施用包含有效剂量的融合蛋白的药物组合物，这种药物组合物可以被用于治疗葡萄糖失衡的紊乱，例如糖尿病。
融合蛋白的有效剂量可以通过多种方法来测定，包括被计算来减轻患者中的与特定疾病相关的病症的剂量，例如糖尿病病症。在其它制剂中，计算的剂量包括在患者中诱导血糖水平的可检测变化的融合蛋白的有效量。血糖中的这种可检测的变化可以包括血糖水平下降约1％和90％之间，或者在约5％和约80％之间。血糖水平的下降将取决于被治疗的疾病病症，而可以改进药物组合物或者施用的方法来在各个患者中达到期望结果。在其它情况下，配制药物组合物和改进施用方法，检测患者中治疗性蛋白质或肽的活性水平的升高，例如，胰岛素或GLP-1的活性的可检测的升高。这种制剂和方法可以递送约1pg到约100mg/kg体重的融合蛋白，约100ng到约100μg/kg体重的融合蛋白，约100μg/到约100mg/kg体重的融合蛋白，约1μg到约1g的融合蛋白，约10μg到约100mg融合蛋白或者约10mg到约50mg融合蛋白。还可以采用单位测定治疗性蛋白质活性方法来计算制剂，例如约5-到约500单位的人胰岛素或约10到约100单位的人胰岛素。重量或活性的测定值可以采用被融合到Tf上的各个治疗性蛋白质或肽的已知标准物来计算。
本发明还包括口服施用本发明的药物组合物的方法。这种方法可以包括但是不限于，由患者或护理人员实施的口服施用的步骤。这种施用步骤可以包括间隔施用，例如每天一次或两次，取决于Tf融合蛋白，疾病或患者病症或者个别患者。这种方法还包括施用各种剂量的各种Tf融合蛋白。例如，药物组合物的第一个剂量可是较高含量，产生期望效果，例如血糖水平下降。一旦获得期望效果，就可以降低随后的剂量。对施用方案的这些改变或修改可以由主治医生或卫生保健人员来实现。在有些情况下，可以由各个患者来改变施用方案，例如，当患者正在监控血糖水平被施用本发明的mTf-胰岛素或mTf-GLP-1口服组合物时。
本发明还包括制备本发明的口服组合物或药剂组合物的方法，包括将本发明的Tf融合蛋白配制成可口服施用的形式。在其它情况下，本发明包括制备本发明的组合物或药剂组合物的方法，包括将本发明的Tf融合蛋白配制成适合口服施用的形式。
此外，本发明包括肺部递送Tf融合蛋白制剂。肺部递送特别可用于递送难以通过其它施用路径递送的大分子。由于被递送到肺部的药物很容易通过肺泡区域直接吸收到血液循环中，这种肺部递送对于系统递送以及局部递送来治疗肺部疾病来说是有效的。
本发明提供适合形成用于口腔吸入(肺部递送)来治疗各种病症或疾病的药物分散体的组合物。Tf融合蛋白制剂可以通过不同方法来递送，例如液体喷雾器、气雾计量剂量吸入器(MDI′s)和干粉分散装置。在配制用于肺部递送的组合物中，通常加入药学上可接受的载体包括表面活性剂(Surface activeagent)或表面活性剂(surfactant)和填充载体(bulk carrier)，来产生稳定性、分散性、一致性，和/或提高该组合物均衡地肺部递送给患者的分散特性。
表面活性剂(Surface active agent)或表面活性剂(surfactant)促进多肽通过粘膜或内层被吸收。有用的表面活性剂(Surface active agent)或表面活性剂(surfactant)包括脂肪酸及其盐、胆汁盐、磷脂或烷基糖。脂肪酸及其盐的例子包括辛酸(C8)、癸酸(C10)、月桂酸(C12)和豆蔻酸(C14)的钠盐、钾盐和赖氨酸盐。胆汁盐的例子包括胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、石胆酸和熊脱氧胆酸。磷脂的例子包括单链磷脂，例如溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰肌糖和溶血磷脂酰丝氨酸；或双链磷脂，例如二酰磷脂酰胆碱、二酰磷脂酰甘油、二酰磷脂酰乙醇胺、二酰磷脂酰肌糖和二酰磷脂酰丝氨酸。烷基糖的例子包括烷基葡萄糖苷或烷基甘露糖苷，例如癸基葡萄糖苷和十二烷基葡萄糖苷。
可用作载体的药物赋形剂包括稳定剂，例如人血清白蛋白(HSA)；填充剂(bulking agent)如糖类、氨基酸和多肽；pH调节剂或缓冲剂；盐如氯化钠，等等。这些载体可以是结晶的或者无定形的形式或者两种的混合物。
用作填充剂的糖类的例子包括单糖如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、海藻糖等；环化糊精，例如2-羟基丙基-.β.-环化糊精；以及多糖，例如棉子糖、麦芽糖糊精、葡聚糖等；醛醇，例如甘露醇、木糖醇等。用作填充剂的多肽的例子包括天冬氨酰苯丙氨酸甲酯。氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸，甘氨酸是优选的。
添加剂是组合物中的最小组分，包含它们来在喷雾干燥过程中稳定构象和提高粉末的分散性。这些添加剂包括疏水性氨基酸，例如色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等。
合适的pH调节剂或缓冲剂包括从有机酸和碱中制备得到的有机盐，例如柠檬酸钠、抗坏血酸钠等，柠檬酸钠是优选的。
用于肺部递送的Tf融合物组合物可以被包装成单位剂量，其中治疗有效量的组合物被添加到单位剂量容器中，例如泡状包装物或明胶胶囊等。典型地采用包装领域通常熟知的方法来加工泡状包装物或明胶胶囊。
美国专利6,524,557公开了药物气雾制剂，包括(a)HFA推进剂；(b)可分散在推进剂中的药物活性肽；和(c)表面活性剂，如C8-C16脂肪酸或其盐、胆汁盐、磷脂或烷基糖类，这些表面活性剂增强在呼吸道后端系统地吸收多肽。本发明还提供加工这种制剂的方法和这种制剂在治疗患者中的用途。
肺部递送干燥粉末的方法利用用于产生加压气体来源的手泵的手持装置。加压气体通过粉末分散装置急速释放，例如文氏管管口，分散的粉末可以被患者吸入。
干燥粉末分散装置在几个专利中被描述。美国专利3,921,637描述了具有用于刺穿简单的粉末药物的胶囊的针头的手动泵。在EP 0467172；国际专利公开WO 91/02558；和WO 93/09832；美国专利4,627,432；4,811,731；5,035,237；5,048,514；4,446,862；5,048,514，和4,446,862中描述了多种药物的托盘或条带的用途。
蛋白治疗剂的气雾化被公开在欧洲专利EP 0289336中。治疗性的气雾剂被公开在国际专利公开WO 90/09781中。
本发明提供配制用于口腔吸入的Tf融合蛋白。制剂包含Tf融合蛋白和适合肺部递送的药物赋形剂。本发明还提供通过口腔吸入将Tf融合蛋白组合物施用给需要的患者。
转基因动物在本发明的一个实施方案中，包括制备转基因的非人类动物，该动物含有血清半衰期、血清稳定性或生物利用度升高的本发明的被修饰的转铁蛋白融合构建体。在一些实施方案中，乳铁蛋白可以被用作融合蛋白的Tf部分，使得在乳汁中产生和分泌融合蛋白。
在大量专利和出版物中描述了成功制备转基因的非人类动物，例如美国专利6,291,740(2001年9月18日授权)；美国专利6,281,408(2001年8月28日授权)；和美国专利6,271,436(2001年8月7日授权)，其内容在此完全引入作为参考。
对动物的遗传组成进行改变，可以进行广泛的商业应用，这些动物例如家养动物，包括奶牛、猪、山羊、马、肉牛和绵羊。这些应用包括动物生产，这些动物表达大量容易回收形式的外源蛋白(例如，表达到乳汁或血液中)，体重增加、饲养效率、胴体组成、乳汁产量或含量升高、抗病性和对特定微生物感染的抵抗的动物生产，提高生长率或繁殖特性的动物生产。在其基因组中含有外源DNA序列的动物被称作为转基因动物。
最广泛用于生产转基因动物的方法是将DNA显微注射到受精胚的原核中(Wall等，J.Cell.Biochem.49113 )。其它用于生产转基因动物的方法包括用逆转录病毒或逆转录病毒载体感染胚胎。用野生型或重组的逆转录病毒感染移植前或移植后的小鼠胚胎已经被报导(Janenich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 731260 ；Janenich等，Cell 24519 ；Stuhlmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 817151 ；Jahner等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 826927 ；Van der Putten等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 826148-6152 ；Stewart等，EMBO J.6383-388 )。
用逆转录病毒感染胚胎的可替代方法是将病毒或生产病毒的细胞注射到小鼠胚胎的囊胚腔中(Jahner，D.等，Nature 298623 )。已经报导，采用子宫内逆转录病毒感染妊娠中期的小鼠胚胎，将转基因导入小鼠的幼殖体中(Jahner等，同上文 )。已经报导用逆转录病毒或逆转录病毒载体感染牛和绵羊的胚胎，来生产转基因动物。这些方案包括将逆转录病毒颗粒或者释放逆转录病毒颗粒的生长停滞(即，丝裂菌素C处理的)细胞微注射到受精卵或早期胚胎的卵周隙中(PCT国际专利申请WO 90/08832 ；和Haskell和Bowen，Mol.Reprod.Dev.，40386 。PCT国际专利申请WO 90/08832描述将野生型猫科白血病病毒B注射到2-8个细胞阶段的绵羊胚胎的卵周隙中。由被注射胚胎发育得到胎儿被证明含有多个整合位点。
美国专利6,291,740(2001年9月18日授权)描述采用转导分化细胞(例如来源于鼠白血病病毒[MLV]的载体)的逆转录病毒载体，将外源DNA导入成熟前卵母细胞和成熟的未受精的卵母细胞(即，受精前的卵母细胞)中来生产转基因动物。该专利还描述了通过细胞巨化病毒启动子起始以及小鼠乳腺癌LTR来表达各种重组蛋白的方法和组合物。
美国专利6,281,408(2001年8月28日授权)描述采用胚胎干细胞生产转基因动物的方法。简而言之，胚胎干细胞与桑椹胚混合共培养来产生转基因动物。在共培养之前，通过例如电穿孔、微注射或逆转录递送，将外源遗传物质导入导胚胎干细胞中。通过选择标记例如新霉素，选择以这种方式转染的ES细胞，其中发生基因整合。
美国专利6,271,436(2001年8月7日)描述转基因动物的生产，采用的方法包括分离原始生殖细胞，培养这些细胞以产生原始生殖细胞来源细胞系，转化原始生殖细胞和被培养的细胞系，使用这些被转化的细胞和细胞系来生产转基因动物。生产转基因动物的效率被极大地提高，因而，在生产转基因的非啮齿类动物物种中可以采用同源重组方法。
基因治疗在本发明的一个实施方案中，包括被修饰的转铁蛋白融合构建体用于基因治疗的用途，其中被修饰的转铁蛋白或转铁蛋白结构域被连接到治疗性蛋白质或肽上。血清半衰期或血清稳定性提高的本发明的被修饰的转铁蛋白融合构建体特别适合于基因治疗。
成功使用基因治疗来表达可溶的融合蛋白已经被描述。简而言之，最近在Ijima等(June 10，2001)Human Gene Therapy(美国)12/91063-77中说明，通过注射含有编码可溶的融合蛋白的基因的腺病毒载体进行基因治疗，可溶的融合蛋白由细胞毒性淋巴细胞抗原4(CTLA4)和人免疫球蛋白G1的Fc部分组成。在该基因治疗应用中，通过关节内注射载体成功地治疗了II型胶原诱导的关节炎的鼠模型。
基因治疗还在大量美国专利中被描述，包括美国专利6,225,290(2001年5月1日授权)；美国专利6,187,305(2001年2月13日授权)和美国专利6,140,111(2000年10月31日)。
美国专利6,225,290提供方法和构建体，其中哺乳动物个体的肠上皮细胞被遗传改进，可操作地插入表达具有期望治疗作用的蛋白质的基因。通过施用主要由裸DNA组成的制剂，实现肠道细胞的转化，该DNA被口服施用。口服的或其它胃肠道内的施用路径提供了一种简单的施用方法，而采用裸核酸避免与使用病毒载体进行基因治疗相关的并发症。表达的蛋白质被直接分泌到胃肠道和/或血流中，获得治疗性血液水平的蛋白质，从而治疗需要该蛋白质的患者。被转化的肠道上皮细胞短期或长期地治疗与缺乏特定蛋白质相关的疾病，或者通过过度表达一种蛋白质进行治疗。
美国专利6,187,305提供在脊椎动物，特别是哺乳动物来源的细胞中进行基因或DNA靶向的方法。简而言之，通过DNA的同源重组或靶向，将DNA导入到脊椎动物来源的原代(primary)或次代(secondary)细胞中，DNA被导入到初级或次级细胞的基因组DNA的预先选择的位点上。
美国专利6,140,111(2000年10月31日授权)描述逆转录病毒基因治疗的载体。所公开的逆转录病毒载体包括目标基因的插入位点，能够在广泛的各种转染细胞类型中表达高水平的蛋白质，该蛋白质来源于目标基因。还公开了缺乏可选择标记的逆转录病毒载体，从而使得它们适合于在各种疾病状态的治疗中进行人的基因治疗，而不会共表达标记产物，例如抗生素。这些逆转录病毒载体特别适合用于特定包装细胞系中。逆转录病毒载体能够插入到哺乳动物细胞的基因组中，使得它们成为人类和动物的遗传疾病的基因治疗中的特别有前景的候选。基因治疗典型地包括(1)在体内将新的遗传物质增加到患者细胞中，或者(2)从机体中取出患者细胞，将新的遗传物质添加到细胞中，并将细胞重新导入机体中，即，体外基因治疗。对于如何使用逆转录病毒载体在各种细胞中进行基因治疗的讨论，存在于例如1989年9月19日授权的美国专利4,868,116和1990年12月25日授权的美国专利4,980,286(上皮细胞)，1989年8月10日公开的WO 89/07136(肝细胞)，1990年7月25日公开的EP 378,576(成纤维细胞)和1989年6月15日公开的WO 89/05345和1990年6月28日公开的WO/90/06997(内皮细胞)中，这些专利的公开内容在此引入作为参考。
含有转铁蛋白融合蛋白的试剂盒在还有一个实施方案中，本发明提供含有转铁蛋白融合蛋白的试剂盒，该试剂盒可以被用于，例如，治疗性或非治疗性应用。试剂盒包含具有标签的容器。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶和试管。容器可以用各种材料制备，例如玻璃或塑料。容器中装有包括转铁蛋白的组合物，如上所述，转铁蛋白对于治疗性或非治疗性的应用是有效的。组合物中的活性试剂是治疗性蛋白质。容器上的标签指明该组合物被用于特定的治疗或非治疗性应用，可能还指明用于体内的或体外的用途，例如如上所描述的那些用途。
本发明的试剂盒通常还包括上述的容器，以及一个或多个包含商业和使用者期望的物质的其它容器，包括缓冲液，稀释剂，滤器，针头，注射器和具有用途说明的包装插入物。
无需进一步描述，通过利用前面的描述和如下的说明性实施例，相信本领域的普通技术人员能够利用本发明并实施要求保护的方法。例如，当与未被融合的治疗性部分的可比较的活性相比时，技术人员能够容易地确定本发明的融合蛋白构建体的体外和体内的生物活性。类似地，本领域技术人员能够容易地确定按照本发明的构建体的血清半衰期和血清稳定性。因此，如下的工作实施例特别地指示本发明的优选实施方案，不被解释为以任何方式限制公开的剩余权利。
实施例实施例1T-20/转铁蛋白融合蛋白T-20是HIV基因融合抑制剂肽，具有如下氨基酸序列YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO17)。
本发明提供半衰期延长的包含T-20和被修饰的转铁蛋白(mTf)的融合蛋白，用于治疗与病毒传播相关的疾病的这种融合蛋白的药物组合物。下面描述的实施例也可以用于生产具有肽T-20的类似物的转铁蛋白融合蛋白。
利用酿酒酵母将T-20融合到被修饰的转铁蛋白(mTf)上，制备本发明的具有抗-HIV活性的转铁蛋白融合蛋白。因此，首先，将SEQ ID NO17反译为DNA，密码子优化为适合酿酒酵母，融合到mTf的N末端或C末端来生产T-20融合构建体。
5′端融合作为一个例子，采用在两端具有限制性位点突出端的重叠引物，例如用于连接到适当载体中的XbaI和KpnI位点，将T-20融合到mTf的5′端。可替代地，可以制备具有其它限制性位点突出端的重叠引物，或者引物可以退火到具有适当的限制性位点突出端的衔接子上，用于连接到特定设计载体上。
载体被特别设计来具有限制性位点，例如XbaI和KpnI位点，使得治疗性分子可以融合到mTf的N末端。利用XbaI和KpnI位点或者被修饰的转铁蛋白(mTf)的载体的5′端上的其它合适限制性位点，将引物退火并克隆到该载体中。然后，从该载体中切出编码T-20/mTf融合蛋白的表达盒，并克隆到用于蛋白表达的酵母载体中。
特别地，具有限制性突出端的如下重叠引物被设计来制备5′T-20融合物 重叠引物具有如下序列P0038CTAGAGAAAAGGTACACTAGCTTAATACAC(SEQ ID NO18)P0039TGCGATTCTTCAATTAAGGAGTGTATTAAGCTAGTGTACCTTTTCT(SEQ ID NO19)P0040TCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATG(SEQ ID NO20)P0041TAATTCCAATAATTCTTGTTCATTCTTTTCTTGCTGGTTT(SEQ ID NO21)P0042AACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTGTAC(SEQ ID NO22)P0043AAACCAATTCCACAAACTTGCCCATTTATC(SEQ ID NO23)引物在65℃下退火，被连接到特别设计的pREX0004载体上，用XbaI和KpnI酶切生成pREX0016。通过测序确定正确克隆后，汇集正确的克隆，并用另一对合适的限制性酶例如PsiI和AgeI，从pREX0016中切取编码T-20/mTf融合蛋白的表达盒。将该表达盒连接到用PsiI和AgeI酶切的酵母载体例如pSAC3中。然后，含有T-20/mTfN末端融合蛋白的pSAC3通过电穿孔进入到酵母细胞中，用于蛋白质生产。
3′端融合以相同的方式，采用两端具有限制性位点突出端的重叠引物，例如Sal1和HindIII或其它限制性酶，将T-20融合物融合到T-20的3′端上。一旦退火，利用限制性位点例如Sal1和HindIII将该片段克隆到特别设计的载体pREX0001上。在测序确定正确克隆之后，用Sal1和HindIII酶切质粒，将片段亚克隆到pREX0004中，pREX0004被特别地设计成具有独特的Sal1和HindIII位点，以使治疗性蛋白被融合到mTf的C末端上。得到的质粒是pREX0017。然后，用适当的酶例如PsiI和AgeI来酶切pREX0017，以从该载体中取出T-20/mTf表达盒。将T-20/m-Tf表达盒亚克隆到酵母载体例如pSAC3中，以在酵母中表达。
特别地，具有限制性突出端的如下重叠引物被设计来制备被融合到mTf的C末端的T-20融合物 重叠引物具有如下序列
P0044TCGACCTTACACTAGCTTAATACAC(SEQ ID NO24)P0045TGCGATTCTTCAATTAAGGAGTGTATTAAGCTAGTGTAAGG(SEQ ID NO25)P0040TCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATG(SEQ ID NO26)P0041TAATTCCAATAATTCTTGTTCATTCTTTTCTTGCTGGTTT(SEQ ID NO27)P0046AACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTTAATA(SEQ ID NO28)P0047AGCTTATTAAAACCAATTCCACAAACTTGCCCATTTATC(SEQ ID NO29)引物在65℃下退火，被连接到用Sal1和HindIII酶切的特别设计载体上。在测序确定正确克隆后，汇集正确的克隆，并用另一对合适的限制性酶例如PsiI和AgeI来从载体中切取编码T-20/mTfC末端融合蛋白的表达盒。将该表达盒连接到用PsiI和AgeI酶切的酵母载体例如pSAC3中。然后，含有T-20/mTf融合蛋白的pSAC3通过电穿孔进入到酵母细胞中，用于蛋白质生产。
C末端修饰在mTf的3′端进行修饰，确定它们是否会提高融合物表达水平、T-20融合物活性和/或肽在mTf的C末端的肽的灵活性(mobility)。
RRP删除首先，mTf的3′末端的脯氨酸被去除。除了脯氨酸，相邻的两个精氨酸残基可能会呈现潜在的Kex2p蛋白酶裂解位点，被去除。被删除的序列被显示在下面的未被修饰的3′T-20mTf融合插入物(pREX0017，SEQ ID NO31)和具有RRP删除的3′T-20mTf融合插入物(pREX0032，SEQ ID NO30)的比对中
ArgArgPro (pREX0032SEQ ID NO30) (pREX0017SEQ ID NO31)特别地，用与所述序列相邻区域同源的引物删除RRP序列，用于产生删除的引物为P0060TCATCACTCCTGGAAGCCTGCACTTTCTACACTAGCTTAATACACTCCTT(SEQ ID NO32)P0061AAGGAGTGTATTAAGCTAGTGTAGAAAGTGCAGGCTTCCAGGAGTGATGA(SEQ ID NO33)采用外引物(external primer)，以pREX0017作为模板进行诱变PCR反应，生产缺失编码RRP的9个碱基的产物。然后，用SphI/HindIII酶切该产物，并克隆到用SphI/HindIII酶切的pREX0017中，制备pREX0032。然后用AgeI/PsiI酶切pREX0032，亚克隆到酵母载体例如pSAC3中，转化到酵母中来表达蛋白。
C402-C674二硫键的去除在接下来的步骤中，去除伸展在mTF分子的Cys402和Cys674之间的二硫键。这是通过将两个半胱氨酸残基突变为甘氨酸残基来实现。首先，采用诱变引物将Cys402突变为Gly。诱变引物为P0064TTGTCTACATAGCGGGCAAGGGTGGTCTGGTGCCTGTCTTG (SEQ ID NO34)P0065CAAGACAGGCACCAGACCACCCTTGCCCGCTATGTAGACAA (SEQ ID NO35)采用外引物，以pREX0017作为模板进行PCR反应，产生具有期望突变的产物。然后用HpaI/PstI酶切产物，再克隆到pREX0017中来产生一个Gly402中间体，pREX0039。接着，按照相同程序，采用pREX0004作为模板，使用如下引物将Cys674突变为Gly674P0068TCCACCTCATCACTCCTGGAAGCCGGTACTTTCCGTCGACCTTAA(SEQ ID NO36)P0069CTTATTAAGGTCGACGGAAAGTACCGGCTTCCAGGAGTGATGAGGTGG(SEQ ID NO37)生成的产物周SphI/HindIII酶切，并亚克隆到新的Gly402中间体pREX0039中，生成pREX0038。该质粒不含T-20肽，使得它将来可用于其它mTf融合物中。为了将T-20肽插入pREX0038中，克隆pREX0017的SalI/AgeI片段来形成pREX0034。然后用AgeI/PstI酶切pREX0034。将该表达盒亚克隆到酵母载体如pSAC3中，转化到酵母中来进行蛋白表达。该突变被显示在下面的未被修饰的3′T-20mTf融合质粒插入物(pREX0017)和具有C402-C674二硫键删除的3′T-20mTf融合插入物的比对中 (SEQ ID NO38)(SEQ ID NO39) (SEQ ID NO40)(SEQ ID NO41)二硫键和RRP去除组合在第三步中，RRP删除和C402-C674二硫键删除被组合。开始，以与pREX0032相同的方式制备中间体质粒pREX0041，除了在引物中存在Cys674突变。如下引物被采用P0066TCCACCTCATCACTCCTGGAAGCCGGCACTTTCTACACTAGCTTAATA(SEQ ID NO42)P0067GTGTATTAAGCTAGTGTAGAAAGTACCGGCTTCCAGGAGTGATGAGGT(SEQ ID NO43)
然后用SphI/HindIII酶切pREX0041，并亚克隆到pREX0039中来生成pREX0033。然后用AgeI/PsiI酶切pREX0033。将表达盒亚克隆到酵母载体例如pSAC3中，然后转化到酵母中来进行蛋白表达。如下的pREX0033与pREX0017的mTf3′T-20融合物的比对显示生成的产物的突变。
(SEQ ID NO38)(SEQ ID NO39) (SEQ ID NO40)(SEQ ID NO44)mTf-T20在兔子中的药物代谢动力学通过上述方法将T20融合到mTf的C末端，以生产mTf-T-20融合蛋白。将50μg mTf-T20融合蛋白静脉注射到新西兰白兔体内，并且在指定时间(参见附图4)采集3ml血液，分离血浆并冷冻保存。随后在特异于人转铁蛋白而不与兔子内源转铁蛋白发生交叉反应的ELISA检测中分析血浆样本。在注射2h后测定的mTf-T20的浓度通常是最高的，被视为100％。其它浓度与2小时时的浓度相比较。计算得到清除半衰期为44±2小时。附图4显示mTf-T20在两只兔子体内的药物代谢动力学。
mTf在人体内的半衰期约14天，在兔子体内为60小时。因此，可以预期mTf-T20在人体内的半衰期超过7天，比所报道的T20的2小时的半衰期显著地延长了。
实施例2EMP1/转铁蛋白融合蛋白已经证明，EMP1(SEQ ID NO11)通过引起受体二聚化，能够模拟EPO活性。该肽是环化的，与EPO不同源。为了具有活性，该肽得与其它肽一起作用，例如作为二聚体，使得两个拷贝的受体足够接近以形成活性复合物。与许多肽一样，肽二聚体的半衰期短，融合到转铁蛋白上将会延长寿命，是有益的。本发明提供具有EPO模拟活性的融合蛋白。作为例子，本发明的融合蛋白包含肽EMP1肽(SEQ ID NO11)和半衰期延长的被修饰的转铁蛋白(mTf)。本发明还提供这种融合蛋白的药物组合物，用于治疗与低或缺乏红细胞生成相关的疾病。
EMPI-mTF的融合与插入起始融合到mTf上包括融合到mTf的N末端，C末端，以及N末端与C末端上。各个融合物能够结合受体，但是不能使受体活化。双融物(dualfusion)，其中一个是区别于另一个的不同密码子组成以防止重组，使能结合到受体上并引起受体的活化。
以兔模型1JNF作为模板，采用ExPasy Swiss Model Server检验人Tf的N-结构域(PDB标识符1A8E)和全长Tf模式AAAaoTfwo，表明存在大量潜在位点，用于插入肽，直接插入，或者通过替换大量残基来插入。这些位点与C-结构域的等价位点重复。

这些环中的两个是插入EMP1肽的优选位点N1His289(286-292)和N2Asp166(162-170)。这些位点提供结合EPO受体的两半所需的正确方位。当插入位点在N结构域的N1和N2结构域上时，这两个亚结构域之间具有铰链的柔韧性，使得它们能够结合到受体上。
由于N结构域和C结构域之间的结构相似性，C结构域上的等同插入位点(C1489-495，C2623-628)可以用于使该分子多价化。这可通过上面指出的位于N或C结构域上的潜在插入位点或者两个结构域上的位点的组合来实现。
N1＝SEQ ID NO13N2＝SEQ ID NO14C1＝SEQ ID NO15C2＝SEQ ID NO16制备EMP1/mTf融合蛋白的步骤在本实施例中，采用EMP1肽和mTf的编码核酸，将两条EMP1肽(SEQID NO11)工程化到转铁蛋白支架上。
1 ggtggtactt actcttgtca ttttggtcca ttgacttggg tttgtaagcc acaaggtggtg g t y s c h f g p l t w v c k p q g g核酸序列SEQ ID NO45氨基酸序列SEQ ID NO11AEMP1肽被工程化到mTf的His289和Gly290之间。转铁蛋白分子固有的重复，即两个结构域相互映衬，使得可能将第二条EMP1肽工程化到C结构域的重复区中，在Glu625和Thr626之间。
N 277 D-KSKE--FQ LFSSP KDL LFKDSAHGFL KVPPRMDAKM YLGYEYVTAIC 611 NVTDCSGNFC LFRS KDL LFRDDTVCLA KLHDRNTYEK YLGEEYVKAVN-结构域SEQ ID NO13C-结构域SEQ ID NO16作为一个例子，对于各种插入，合成两个重叠诱变引物(参见下文)。采用含有编码mTf的核酸的载体作为模板，例如pREX0010，使用各种诱变引物和来自Tf cDNA的5′端或3′端的外引物进行反应。然后，将来自这两个反应的产物混合，用外引物进一步反应来将两种产物连接在一起。His289-Gly290插入子的PCR产物用XbaI和HpaI消化，并连接到用XbaI/HpaI消化的pREX0010中。然后用HpaI和SalI消化得到的载体，连接用HpaI/SalI消化的Glu625-Thr626插入子的PCR产物。
His289-Gly290插入(SEQ ID NO46)←-------------2031 agacaaatca[aaagaatttc aactattcag ccctcctcat ggtggtactt actcttgtca ttttggtccatctgtttagt tttcttaaag ttgataagtc gagaggagta ccaccatgaa[tgagaacagt aaaaccaggt>>.............EMOm..............>
>....................................Tf....................................>
>.................................N结构域..................................>
2101 ttgacttggg tttgtaagcc]acaaggtggt gggaaggacc tgctgtttaa ggactctgcc cacgggttttaactgaaccc aaacattcgg tgttccacca cccttcctgg acgacaaatt cctgagacgg]gtgcccaaaa-----------→>............EMOm.............>>
>....................................Tf..................................>
>.................................N结构域................................>
Glu625-Thr626插入(SEQ ID NO47)←-------------3081 cctatttgga agcaacgtaa ctgactgctc[gggcaacttt tgtttgttcc ggtcggaagg tggtacttacggataaacct tcgttgcatt gactgacgag cccgttgaaa acaaacaagg ccagccttcc accatgaat[g>>...EPOm...>
>...................................C结构域................................>
>....................................Tf....................................>
KpnI-------3151 tcttgtcatt ttggtccatt gacttgggtt tgtaagccac]aaggtggtac caaggacctt ctgttcagagagaacagtaa aaccaggtaa ctgaacccaa acattcggtg ttccaccatg gttcctggaa gacaagtctc-----------→>......................EPOm.......................>>
>.................................C结构域.................................>
>...................................Tt....................................>
3221 atgacacagt atgtttggcc aaacttcatg acagaaacac atatgaaaaa tacttaggag aagaatatgttactgtgtca]tacaaaccgg tttgaagtac tgtctttgtg tatacttttt atgaatcctc ttcttataca>................................C结构域..................................>
>....................................Tf...................................>
用适当的限制性酶，从载体上切出含有EMP1/mTF融合蛋白的表达盒，并连接到酵母载体中，例如pSAC35。将pSAC35转化到酵母中来表达蛋白质。
用于插入EPO模拟肽或者任何其它肽的可替代位点是转铁蛋白C-结构域的两个糖基化位点，N413和N611。这些位点的优点在于，一旦实现插入，就会通过破坏N-X-S/T序列来防止糖基化。
实施例3GLP-1/转铁蛋白融合蛋白GLP-1是调控胰岛素分泌的肽。在患有糖尿病特别是II型糖尿病的人类患者中，GLP-1具有抗糖尿病活性。与其它肽相同，GLP-1在人体内的血浆半衰期短。本发明提供半衰期延长的被融合到mTf上的GLP-1融合蛋白，以及可以口服施用的这种融合蛋白的药物组合物，它们可以用于治疗与异常葡萄糖水平相关的疾病。
本发明还提供包含GLP-1类似物和mTF的融合蛋白。在本发明的一个实施方案中，GLP-1类似物在N末端具有额外His残基。His残基可以被添加到GLP-1的N末端，或者在GLP-1的N末端的His残基后插入His残基。在另一个实施方案中，GLP-1类似物包含在位置2上的氨基酸取代。例如，GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)肽(SEQ ID NO6)上的Ala被另一种氨基酸取代。
在该实施例中，描述了制备GLP-1/mTf融合蛋白的步骤。相同的步骤可以被用于生产具有GLP-1肽类似物的转铁蛋白融合蛋白。
采用GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)的氨基酸序列来制备GLP-1/mTf融合蛋白。
haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr (SEQ ID NO48)haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrg (SEQ ID NO64)例如，GLP-1(7-36)的肽序列可以被反译成DNA，并针对酵母进行密码子优化catgctgaaggtacttttacttctgatgtttcttcttatttggaaggtcaagctgctaaagaah a e g t f t s d v s s y l e g q a a k etttattgcttggttggttaaaggtaga (SEQ ID NO49)f i a w l v k g r(SEQ ID NO48)特别地设计引物，以在退火后形成5′XbaI和3′KpnI粘性末端，并且可以被直接连接到XbaI/KpnI酶切的pREX0052中，正好位于前导序列的5′末端和mTf的N末端。可替代地，可改造成其它的粘性末端，连接到其它载体中。
XbaI-+-----1 aggtctctag agaaaaggca tgctgaaggt acttttactt ctgatgtttc ttcttatttgtccagagatc tcttttccgt acgacttcca tgaaaatgaa gactacaaag aagaataaac>>......FL.......>>
r s l e k r (SEQ ID NO52)>>..................GLP-1....................>
(SEQ ID NO48)h a e g t f t s d v s s y lKpnI------+61 gaaggtcaag ctgctaaaga atttattgct tggttggtta aaggtagggt acctgatacttccagttc gacgatttct taaataacga accaaccaat ttccatccca tggactat>......................GLP-1......................>>
e g q a a k e f i a w l v k g r>>..mTf..>>
v p d顶端的链SEQ ID NO50底端的链SEQ ID NO51顶端的链的引物P0056(SEQ ID NO50的核苷酸7-112)底端的链的引物P0057(SEQ ID NO51的核苷酸9-108)
在退火和连接后，对克隆进行测序来确定正确插入。该载体被命名为pREX0094。用NotI从pREX0094中切出表达盒，并亚克隆到NotI酶切的酵母载体pSAC35中，制备pREX0100。
然后将该质粒通过电穿孔进入到宿主酵母属酵母菌中，在极限培养基平板上选择亮氨酸原养型的转化体。在液体极限培养基(minimal media)中培养，通过SDS-PAGE、western印迹和ELISA分析上清液来检测表达。
实施例4β-IFN/转铁蛋白融合蛋白β-IFN可有效用于治疗各种疾病，例如，但是不限于，多发性硬化、脑瘤、皮肤癌和乙型肝炎和丙型肝炎。与大多数细胞因子相同，β-IFN的循环半衰期短。本发明提供包含被融合到mTf上的β-IFN的融合蛋白，其半衰期被延长，并且提高了在患者中的功效。本实施例描述制备可以口服施用的β-IFN/mTf融合蛋白的步骤。
在本实施例中，IFNβ-1被融合到被修饰的转铁蛋白的N末端或C末端。从ATCC(No.39517)获得IFNβ-1克隆。用特定设计的引物确定IFNβ-1克隆的DNA序列。这些引物在IFNβ-1DNA序列外，被设计来从载体开始阅读，以获得该克隆的全长序列。所用的引物为P0070 GCTATGACCAACAAGTGTCTC (SEQ ID NO53)P0071 CGCACCTGTGGCGCCGGTGATG (SEQ ID NO54)N末端融合一旦确定DNA序列，设计将IFNβ-1融合到mTf上的引物。N末端融合是一个两步的过程。采用具有XbaI和KpnI位点的引物的直接融合，将破坏KpnI位点，并修剪(clip)mTf的起始。设计一种接头，引物为P0082(SEQ IDNO55的核苷酸18-48)和P0083(SEQ ID NO56的核苷酸17-39)，通过bp486的单一沉默突变，由T变为G(黑体)，在IFNβ-1的3′末端产生内部KpnI位点，具有5′XbaI突出端和与KpnI位点退火的3′GTAC。突出端破坏存在于pREX0052的KpnI位点。接头被退火并连接到用XbaI/KnpI酶切的pREX0054上，生成具有未被改变的mTf和KpnI位点的中间体载体，该载体可以用于将IFNβ-1融合在mTf的N末端。
XbaI KpnI-+----- -----+>>............P0082.............>>
ctgcttactc taggtctcta gagaaaacag ggtacctccg aaacgtacct gataaaactggacgaatgag atccagagat ctcttttgtc ccatggaggc tttgcatgga ctattttgac<<........P0083........<<
>>.........MFa-1..........>>
a y s r s l e k (SEQ ID NO57)>>....IFN-B-1.....>>
t g y l r n (SEQ ID NO58)>>.....mTf......>
v p d k t(SEQ ID NO59)顶端的链SEQ ID NO55底端的链SEQ ID NO56
第二套引物，P0084(SEQ ID NO60)和P0085(SEQ ID NO61)被设计来裁剪IFNβ-1基因的末端，借助XbaI和KpnI位点，通过诱变PCR顺序插入到中间体载体中。用XbaI/KpnI消化该被裁剪的基因，去除IFNβ-1的最后5个氨基酸；然而，将它们工程化到中间体载体中。将用XbaI/KpnI剪切的IFNβ-1基因连接到用XbaI/KpnI剪切的中间体载体上，得到的构建体pREX0048。
P0084 (SEQ ID NO60)>>-------FL--------->>
>>----IFNβ-1------->>
XbaICTCTAGGTC GAAAAGGAGCTACAACTTGCTTGGATTCP0085 (SEQ ID NO61)<<--------IFNβ-1-------<<
KpnIGTTTCGGA CTGTAAGTCTG
在建立pREX0048构建体后，进行测序来确定正确插入。然后，NotI片段的表达盒被亚克隆到NotI酶切的酵母载体pSAC35中，制备pREX0050。
C-末端融合
用特定设计的引物P0086(SEQ ID NO62)和P0087(SEQ ID NO63)PCR扩增起始克隆，此外，用于裁剪IFNβ-1的末端，以分别在5′和3′末端产生SalI和HindIII位点。将新裁剪的产物连接到用SalI/HindIII酶切的pREX0052上，产生pREX0049。
P0086 (SEQ ID NO62)>>---mTf---->>
>>-----IFNβ-1------->>
SalIACTTTCC CTAGCTACAACTTGCTTGGATTCP0087 (SEQ ID NO63)<<----3′ADHlt-------<< * *<<-----IFNβ-1-------<<
HindIIICATAAAATCATAAGAATT TATTAGTTTCGGAGGTAACCTGTAAGT在建立Prex0049构建体后，进行测序来确定正确插入。然后，将NotI片段的表达盒亚克隆到NotI酶切的酵母载体中，例如pSAC35，制备pREX0051。
在本发明的一个实施方案中，将Cys17(成熟蛋白中的)突变为Ser，使β-IFN-1(GenBank登录号NM_002176，SEQ ID NO65)变得更稳定和更易溶。通过常规的诱变反应，例如采用特定设计的引物，和以编码β-IFN-1的核酸作为模板进行诱变PCR反应，将Cys17突变为Ser。
此外，通过修饰N联糖基化位点NES(SEQ ID NO65的残基80-82)/T，来修饰β-IFN-1，以防止糖基化。作为一个例子，N可以被诱变为Q，而S/T可以被诱变为Ala和其它氨基酸。可以采用特定设计的引物，以编码β-IFN-1的核酸作为模板进行诱变PCR反应来进行这种诱变。
实施例5胰岛素-转铁蛋白融合蛋白胰岛素是一种由胰腺中的胰岛分泌的肽激素，其调节碳水化合物和脂肪的代谢，特别是在葡萄糖转化为糖原中。胰岛素被施用给患有I型和II型糖尿病的病人，以及糖尿病动物。目前，胰岛素必需通过皮下注射来施用，在人体中的半衰期短。本发明提供半衰期延长的被融合到mTf上的胰岛素的融合蛋白，以及可以口服施用的这种融合蛋白的药物组合物，用于治疗与异常葡萄糖水平相关的疾病。
在本实施例中，描述了用于制备胰岛素/mTf融合蛋白的步骤。可以采用类似步骤来制备具有胰岛素肽类似物的转铁蛋白融合蛋白。
对于在酵母属中进行表达，首先在基础载体pREX0052中制备构建体，包括具有用于在酵母中表达mTf的表达盒的大肠杆菌克隆载体，被插入到5′XhaI/KpnI位点之间用于N末端融合或者在3′SalI/HindIII位点上用于C末端融合。
XbaI KpnI-+----- ------+aggtctctag agaagagggt acctgata (SEQ ID NO67)tccagagatc tcttctccca tggactat>>......FL.......>>
r s l e k r (SEQ ID NO69)>>..mTf..>>
v p dSalI HindIII-+----- --+----actttccgtc gaccttaata agcttaattc (SEQ ID NO68)tgaaaggcag ctggaattat tcgaattaag>>........mTf........>>
t f r r p - - (SEQ ID NO70)mADHlt>>.....>>
这些构建体形成具有(5′到3′)酵母PRB1启动子、引导分泌到生长培养液中的前导序列、(N末端融合)、mTf序列、(C末端融合)、终止密码和ADH1终止子序列的表达盒。一旦被构建，该表达盒作为NotI片段被取出，并插入到NotI的消化大肠杆菌/酵母穿梭载体pSAC35中。
所用的胰岛素序列对应于Genbank登录号NM_000207，SEQ ID NOS71(DNA)和72(蛋白质)，如下所示。
1 gctgcatcag aagaggccat caagcacatc actgtccttc tgccatggcc ctgtggatgccgacgtagtc ttctccggta gttcgtgtag tgacaggaag acggtaccgg gacacctacg>>.....INS......>
>>..前导序列....>
m a l w m61 gcctcctgcc cctgctggcg ctgctggccc tctggggacc tgacccagcc gcagcctttgcggaggacgg ggacgaccgc gacgaccggg agacccctgg actgggtcgg cgtcggaaac>..............................INS..............................>
>.........................前导序列.........................>>
r l l p l l a l l a l w g p d p a a a>>.>
f121 tgaaccaaca cctgtgcggc tcacacctgg tggaagctct ctacctagtg tgcggggaacacttggttgt ggacacgccg agtgtggacc accttcgaga gatggatcac acgccccttg>..............................INS..............................>
>...............................B...............................>
v n q h l c g s h l v e a l y l v c g e181 gaggcttctt ctacacaccc aagacccgcc gggaggcaga ggacctgcag gtggggcaggctccgaagaa gatgtgtggg ttctgggcgg ccctccgtct cctggacgtc caccccgtcc>..............................INS..............................>
r r e a e d l q v g q>............B............>>
r g f f y t p k t241 tggagctggg cgggggccct ggtgcaggca gcctgcagcc cttggccctg gaggggtcccacctcgaccc gcccccggga ccacgtccgt cggacgtcgg gaaccgggac ctccccaggg>..............................INS..............................>
v e l g g g p g a g s l q p l a l e g s301 tgcagaagcg tggcattgtg gaacaatgct gtaccagcat ctgctccctc taccagctggacgtcttcgc accgtaacac cttgttacga catggtcgta gacgagggag atggtcgacc>..............................INS..............................>
l q k r>>........................A.........................>
g i v e q c c t s i c s l y q l361 agaactactg caactagacg cagcccgcag gcagcccccc acccgccgcc tcctgcaccgtcttgatgac gttgatctgc gtcgggcgtc cgtcgggggg tgggcggcgg aggacgtggc>......INS......>>
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e n y c n421 agagagatgg aataaagccc ttgaaccagctctctctacc ttatttcggg aacttggtcg上述序列的cDNA可通过多种方法制备，例如通过RT-PCR，从cDNA库中获得，或者通过重叠合成寡核苷酸。为了从cDNA库中制备克隆，合成两条引物，作为PCR引物。
5′端引物5′-tttgtgaaccaacacctgtgcggc-3′(SEQ ID NO73)3′端引物3′-gacgagggagatggtcgacctcttgatgacgttg-5′(SEQ ID NO74)为了进行N末端插入，使用5′诱变引物，以第一PCR产物作为模板来生成第二PCR产物。该引物插入了前导序列的最后5个氨基酸和XbaI位点。由于KpnI位点的形成会导致氨基酸改变，所以不能通过这种方法插入KpnI位点。作为替代，用XbaI/PvuII消化PCR产物。然后用具有PvuII5′末端和3′突出端的两个重叠寡聚物生成接头，3′突出端会连接到KpnI消化的pREX0052的KpnI突出端上。通过退火，并将该接头连接到被消化的PCR片段上，将生成的产物连接到用XbaI/KpnI消化的pREX0052上，生成质粒pREX0052N-胰岛素(SEQ ID NOS75和76分别为DNA和蛋白质)。
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c t s i c s l y q l e n y c n>>mTfv5′引物5′-gcttactctaggtctctagataagaggtttgtgaaccaacacctgtgcg-3′(SEQ IDNO77)接头5′-ctggagaactactgcaacgtac-3′(SEQ ID NO78)3′-gacctcttgatgacgttg-5′(SEQ ID NO79)为了进行C末端插入，以第一PCR产物作为模板，用5′和3′诱变引物来生成第二PCR产物。然后用SalI/HindIII消化，并连接到用SalI/HindIII消化的pREX0052中，生成质粒pREX0052C-胰岛素(SEQ ID NO80和81)。
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a -5′引物5′-tgcactttccgtcgaccttttgtgaaccaacacctgtgcg-3′(SEQ ID NO82)3引物3′-gacctcttgatgacgttgattattcgaattaa-5′(SEQ ID NO83)一旦检测并确定了N末端和C末端插入的DNA序列后，用NotI消化质粒pREX0052N-胰岛素和pREX0052C-胰岛素，取出表达盒。然后将表达盒连接到NotI消化的pSAC35中，生成pSAC35N-胰岛素和pSAC35C-胰岛素。然后这些质粒通过电穿孔进入到宿主酵母属酵母菌中，在极限培养基平板上筛选亮氨酸原养型的转化体。在液体极限培养基中培养，通过SDS-PAGE、western印迹、ELISA和BIAcore分析上清液来检测表达。
这些融合构建体生成连接到转铁蛋白上的胰岛素原。虽然最终的表达产物可能仅含有胰岛素原，但是酵母中的蛋白酶可能在胰岛素原生成和分泌时将其转化为胰岛素。在那种情况下，在表达后，可以用适当的纯化蛋白酶将胰岛素原转化为胰岛素。
将胰岛素/被修饰的转铁蛋白融合蛋白口服施用给大鼠为了检测胰岛素/mT融合蛋白的胰岛素活性，首先制备糖尿病大鼠。雌性Sprague-Dawley大鼠禁食24小时，用所测定的血糖含量建立基线。然后给大鼠腹膜内注射60mg/ml链脲霉素(STZ)溶液，继续以60mg/kg剂量I.p.注射STZ四天以上，具有300mg/dl以上的禁食血糖水平的大鼠被选择作为糖尿病大鼠。
在PBS或碳酸氢钠中制备单独的融合蛋白的溶液和胰岛素溶液，以当被施用给大鼠时提供7-80单位胰岛素/kg的剂量。作为对照，大鼠仅用PBS处理。在禁食12小时后，给大鼠口腔灌入所述溶液或将PBS，在0、30和60分钟后，然后以每2小时的间隔，从尾巴收集血液样本。在给药之后的0、0.5、1、3、5、7、9和11小时的血糖水平用设计用于糖尿病的血糖监控装置来测定，在给药之后11小时开始饲喂大鼠。
通过持续测定血糖水平下降来测定胰岛素活性，通过仅用PBS处理的样本的任何升高或下降来修正下降。比较融合蛋白的胰岛素活性与未被融合的胰岛素的活性。
为了检测肠道粘膜中的转铁蛋白受体对融合蛋白的结合，如上所述，将融合蛋白和作为对照的未被融合的胰岛素施用给诱发糖尿病的大鼠，采用标准的夹心ELISA和血清样本来测定转运。可替代地，如上所述，通过口腔强饲，以80U胰岛素/kg的剂量将125I标记的融合蛋白或125I标记的未被融合的胰岛素施用给诱发糖尿病的大鼠。再如上所述，在0、30和60分钟后，然后以每2小时的间隔，从尾巴收集血液样本，通过HPLC分析血清样本，采用例如Sephacryl柱，并用PBS洗脱样本。含有125I标记的转铁蛋白、125I标记的胰岛素、125I标记的融合蛋白的标准物也在Sephacryl柱上进行洗脱，确定它们的最大洗脱次数和馏分数量。用γ计数器测定各个馏分的放射性，并通过280nm下的吸光度来确定各个馏分的蛋白质含量。来自用融合蛋白处理的大鼠的血清样本不会立即出现融合蛋白，可能会延迟数小时。
实施例6制备铁亲合性升高的治疗性mTf融合蛋白制备铁亲合性升高的治疗性mTf融合蛋白。作为制备铁结合能力提高的被修饰的转铁蛋白融合蛋白的例子，对上述实施例5的操作进行如下改进。这些融合蛋白可以被用于方便融合蛋白跨越胃肠道上皮的摄取和转运。
上述含有mTf序列的克隆载体，例如pREX0052，用一种限制性酶或一对限制性酶进行酶切，取出mTf基因部分。采用本领域的标准技术，对该片段进行定点诱变，使用在对应于SEQ ID NO1的核苷酸723的位置上导入突变的引物，将密码子AAG(Lys)转化为CAG(Gln)或GAG(Glu)。类似地，使用在对应于SEQ ID NO1的核苷酸726和728的位置上导入突变的引物，将密码子CAC(His)转化为CAG(Gln)或GAG(Glu)。还可以使用在全部三个核苷酸位置上都导入突变的引物，取代两个邻近氨基酸。这些核苷酸位点对应于由前导序列编码的蛋白质的氨基酸225和226以及成熟蛋白质的氨基酸206和207。然后通过RT-PCR扩增突变片段，再连接到克隆载体中。含有突变的载体被用于后面的步骤，导入编码治疗性蛋白质的DNA分子。如上面的实施例5所述，可以将mTf融合蛋白序列导入酵母表达载体中，并转化到酵母属或其它酵母中来生产蛋白质。
如前面所讨论，可以突变其它氨基酸来获得铁亲合性升高的治疗性mTf蛋白。
实施例7可溶的毒素受体/转铁蛋白梭菌属神经毒素是有毒物质。突触结合蛋白I是肉毒梭杆菌神经毒素血清型的主要作用受体。突触结合蛋白I的氨基酸1-53(SEQ ID NO4)是导致结合到不同神经毒素血清型上的原因。如同其它肽，可溶的毒素受体的半衰期短，例如氨基酸1-53。本发明提供包含被融合到mTf上的氨基酸1-53的融合蛋白，与具有SEQ ID NO1-53序列的可溶毒素受体相比，其半衰期延长了。
本发明提供具有抗毒素活性和半衰期延长的融合蛋白。特别地，在本实施例中，融合蛋白包含被修饰的Tf和由突触结合蛋白I的氨基酸1-53(SEQID NO4)组成的肽，是通过将一个或多个拷贝的编码肽的核苷酸序列融合到Tf的核苷酸序列上来制备具有被融合到Tf的N末端或C末端上的肽的融合蛋白。
为了插入编码SEQ ID NO4的序列，具有被修饰的转铁蛋白cDNA的载体pREX0010用限制性酶XbaI/KpnI消化来在5′末端插入该序列，用SalI/HindIII消化来在3′端插入该序列。
对于5′端插入，合成两条重叠的寡聚物，在编码SEQ ID NO4的核酸的5′末端形成XbaI突出端，在3′末端形成KpnI突出端。然后将这些寡聚物一起退火，并连接到用XbaI/KpnI消化的pREX0010载体上。
然后在酵母中进行转化、选择和表达。
虽然，参照上面的实施例详细地描述了本发明，应当理解，在不偏离本发明的精神的前提下，可以进行各种改进。因此，本发明仅由下面的权利要求书来限定。在该说明书中提及的所有被引用的专利、专利申请和公开物在此完全引入作为参考。
序列表<110>比奥雷克西斯药物公司(BIOREXIS PHARMACEUTICAL CORPORATION)<120>被修饰的转铁蛋白的融合蛋白<130>54710-5001-01-WO<150>US 60/406,977<151>2002-08-30<150>US 10/378,094<151>2003-03-04<160>90<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2318<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(51)..(2147)<223>GenBank登录号NM_001063，转铁蛋白的基因和蛋白<220>
<221>信号肽<222>(51)..(107)<400>1gcacagaagc gagtccgact gtgctcgctg ctcagcgccg cacccggaag atg agg 56Met Arg1ctc gcc gtg gga gcc ctg ctg gtc tgc gcc gtc ctg ggg ctg tgt ctg 104Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu Cys Leu5 10 15gct gtc cct gat aaa act gtg aga tgg tgt gca gtg tcg gag cat gag 152Ala Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu20 25 30gcc act aag tgc cag agt ttc cgc gac cat atg aaa agc gtc att cca 200Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro35 40 45 50tcc gat ggt ccc agt gtt gct tgt gtg aag aaa gcc tcc tac ctt gat 248Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp55 60 65tgc atc agg gcc att gcg gca aac gaa gcg gat gct gtg aca ctg gat 296Cys Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp70 75 80gca ggt ttg gtg tat gat gct tac ctg gct ccc aat aac ctg aag cct 344Ala Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro85 90 95gtg gtg gca gag ttc tat ggg tca aaa gag gat cca cag act ttc tat 392Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr100 105 110tat gct gtt gct gtg gtg aag aag gat agt ggc ttc cag atg aac cag 440Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln115 120 125 130
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625 630 635 640Phe Arg Ser Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys645 650 655Leu Ala Lys Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu660 665 670Glu Tyr Val Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser675 680 685Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro690 695<210>3<211>679<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>未知特征<223>成熟的转铁蛋白<400>3Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala1 5 10 15Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser20 25 30Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys35 40 45Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala50 55 60Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val65 70 75 80Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr85 90 95Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu100 105 110Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp115 120 125Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys130 135 140Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro145 150 155 160Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly165 170 175Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe180 185 190Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser195 200 205Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu210 215 220Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp225 230 235 240
Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met245 250 255Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu260 265 270His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro275 280 285His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys290 295 300Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val305 310 315 320Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr325 330 335Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg340 345 350Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys355 360 365Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly370 375 380Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly385 390 395 400Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Asp405 410 415Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val420 425 430Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys435 440 445Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met450 455 460Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe465 470 475 480Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys485 490 495Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu500 505 510Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly515 520 525Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly530 535 540Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu545 550 555 560Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn565 570 575Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp580 585 590Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe
595 600 605Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser610 615 620Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys625 630 635 640Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val645 650 655Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu660 665 670Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro675<210>4<211>53<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>未知特征<223>突触结合蛋白I的氨基酸1-53<400>4Met Val Ser Glu Ser His His Glu Ala Leu Ala Ala Pro Pro Val Thr1 5 10 15Thr Val Ala Thr Val Leu Pro Ser Asn Ala Thr Glu Pro Ala Ser Pro20 25 30Gly Glu Gly Lys Glu Asp Ala Phe Ser Lys Leu Lys Glu Lys Phe Met35 40 45Asn Glu Leu His Lys50<210>5<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嗜中性乳铁蛋白剪切变体<400>5Glu Asp Cys Ile Ala Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala1 5 10<210>6<211>31<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>未知特征<223>胰高血糖素样肽<220>
<221>未知特征<222>(31)..(31)<223>Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221>未知特征<222>(37)..(37)<223>Xaa可以表示GLP-1中的Gly或GLP-2中的NH2<400>6His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa20 25 30<210>7<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有促胰岛素活性的GLP-1分子<400>7His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys20 25<210>8<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有促胰岛素活性的GLP-1分子<400>8His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly20 25<210>9<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GLP-1类似物<220>
<221>未知特征<222>(1)..(1)<223>Xaa可以是Ala，Gly，Val，Thr，Ile，或alpha-methyl-Ala<220>
<221>未知特征<222>(14)..(14)<223>Xaa可以是Glu，Gln，Ala，Thr，Ser，或Gly<220>
<221>未知特征<222>(20)..(20)<223>Xaa可以是Glu，Gln，Ala，Thr，Ser或Gly<400>9
Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Xaa Gly Gln1 5 10 15Ala Ala Lys Xaa Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25<210>10<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EPO结构域<400>10Cys Arg Ile Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys1 5 10<210>11<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EMP1肽<400>11Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15Pro Gln Gly Gly20<210>12<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EMP20肽<400>12Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lysl 5 10<210>13<211>47<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>未知特征<223>转铁蛋白的N1亚结构域<400>13Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro His Gly Lys Asp1 5 10 15Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys Val Pro Pro Arg20 25 30Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Thr Ala Ile35 40 45<210>14
<211>45<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>未知特征<223>转铁蛋白的N2亚结构域<400>14Pro Glu Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser1 5 10 15Gly Ser Cys Ala Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys20 25 30Gln Leu Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln35 40 45<210>15<211>42<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>未知特征<223>转铁蛋白的C1亚结构域<400>15Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly1 5 10 15Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu20 25 30Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu Gly35 40<210>16<211>49<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>未知特征<223>转铁蛋白的C2亚结构域<400>16Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser Glu Thr1 5 10 15Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys Leu His20 25 30Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val Lys Ala35 40 45Val<210>17<211>36<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<220>
<223>HIV T-20抗融合肽(antifusogenic peptide)
<400>17Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln1 5 10 15Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu20 25 30Trp Asn Trp Phe35<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0038<400>18ctagagaaaa ggtacactag cttaatacac 30<210>19<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0039<400>19tgcgattctt caattaagga gtgtattaag ctagtgtacc ttttct 46<210>20<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0040<400>20tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg40<210>21<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0041<400>21taattccaat aattcttgtt cattcttttc ttgctggttt40<210>22<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0042<400>22
aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt gtac54<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0043<400>23aaaccaattc cacaaacttg cccatttatc 30<210>24<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0044<400>24tcgaccttac actagcttaa tacac25<210>25<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0045<400>25tgcgattctt caattaagga gtgtattaag ctagtgtaag g 41<210>26<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0040<400>26tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg40<210>27<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0041<400>27taattccaat aattcttgtt cattcttttc ttgctggttt40<210>28<211>55<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物P0046<400>28aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt taata 55<210>29<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0047<400>29agcttattaa aaccaattcc acaaacttgc ccatttatc 39<210>30<211>175<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pREX0032插入物<400>30caaggctgtt ggtaacctga gaaaatgctc cacctcatca ctcctggaag cctgcacttt60ctacactagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 120acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggtttt aataa175<210>31<211>184<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pREX0017插入物<400>31caaggctgtt ggtaacctga gaaaatgctc cacctcatca ctcctggaag cctgcacttt60ccgtcgacct tacactagct taatacactc cttaattgaa gaatcgcaaa accagcaaga 120aaagaatgaa caagaattat tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggtttta 180ataa184<210>32<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0060<400>32tcatcactcc tggaagcctg cactttctac actagcttaa tacactcctt 50<210>33<211>50<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物P0061<400>33aaggagtgta ttaagctagt gtagaaagtg caggcttcca ggagtgatga 50<210>34<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0064<400>34ttgtctacat agcgggcaag ggtggtctgg tgcctgtctt g 41<210>35<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0065<400>35caagacaggc accagaccac ccttgcccgc tatgtagaca a 41<210>36<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0068<400>36tccacctcat cactcctgga agccggtact ttccgtcgac cttaa 45<210>37<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0069<400>37cttattaagg tcgacggaaa gtaccggctt ccaggagtga tgaggtgg 48<210>38<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>从1501开始的pREX0017质粒<400>38tagcgggcaa gtgtggtctg gtgcctgtct tggcagaaaa ctacaataag 50
<210>39<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>从1501开始的pREX0034质粒<400>39tagcgggcaa gggtggtctg gtgcctgtct tggcagaaaa ctacaataag 50<210>40<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>从2301开始的pREX0017质粒<400>40tgctccacct catcactcct ggaagcctgc actttccgtc gaccttacac 50<210>41<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>从2301开始的pREX0034质粒<400>41tgctccacct catcactcct ggaagccggt actttccgtc gaccttacac 50<210>42<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0066<400>42tccacctcat cactcctgga agccggcact ttctacacta gcttaata 48<210>43<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0067<400>43gtgtattaag ctagtgtaga aagtaccggc ttccaggagt gatgaggt 48<210>44<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>从2301开始的pREX0033质粒<400>44
tgctccacct catcactcct ggaagccggt actttctaca c41<210>45<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码具有EPO活性的肽的合成寡核苷酸<400>45ggtggtactt actcttgtca ttttggtcca ttgacttggg tttgtaagcc acaaggtggt60<210>46<211>140<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>His289-Gly290插入PCR产物<400>46agacaaatca aaagaatttc aactattcag ctctcctcat ggtggtactt actcttgtca60ttttggtcca ttgacttggg tttgtaagcc acaaggtggt gggaaggacc tgctgtttaa 120ggactctgcc cacgggtttt 140<210>47<211>210<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Glu625-Thr626插入PCR产物<400>47cctatttgga agcaacgtaa ctgactgctc gggcaacttt tgtttgttcc ggtcggaagg60tggtacttac tcttgtcatt ttggtccatt gacttgggtt tgtaagccac aaggtggtac 120caaggacctt ctgttcagag atgacacagt atgtttggcc aaacttcatg acagaaacac 180atatgaaaaa tacttaggag aagaatatgt210<210>48<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>胰高血糖素样肽-1<400>48His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>49<211>90<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>编码胰高血糖素样肽-1的序列<400>49catgctgaag gtacttttac ttctgatgtt tcttcttatt tggaaggtca agctgctaaa60gaatttattg cttggttggt taaaggtaga 90<210>50<211>118<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>顶端的链合成寡核苷酸<220>
<221>未知特征<222>(7)..(112)<223>顶端的链引物P0056<400>50aggtctctag agaaaaggca tgctgaaggt acttttactt ctgatgtttc ttcttatttg60gaaggtcaag ctgctaaaga atttattgct tggttggtta aaggtagggt acctgata 118<210>51<211>118<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>底端的链合成寡核苷酸<220>
<221>未知特征<222>(9)..(108)<223>底端的链引物P0057<400>51tatcaggtac cctaccttta accaaccaag caataaattc tttagcagct tgaccttcca60aataagaaga aacatcagaa gtaaaagtac cttcagcatg ccttttctct agagacct 118<210>52<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由pREX00052编码的N-末端侧翼肽<400>52Arg Ser Leu Glu Lys Arg1 5<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0070
<400>53gctatgacca acaagtgtct c 21<210>54<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0071<400>54cgcacctgtg gcgccggtga tg 22<210>55<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IFN β-1融合到mTf上的融合物的序列<220>
<221>未知特征<222>(18)..(48)<223>引物P0082序列<400>55ctgcttactc taggtctcta gagaaaacag ggtacctccg aaacgtacct gataaaactg60<210>56<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IFN β-1融合到mTf上的融合物的序列<220>
<221>未知特征<222>(17)..(39)<223>引物P0083序列<400>56cagttttatc aggtacgttt cggaggtacc ctgttttctc tagagaccta gagtaagcag60<210>57<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>MFa-l序列<400>57Ala Tyr Ser Arg Ser Leu Glu Lys1 5<210>58<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IFN-B-1序列<400>58Thr Gly Tyr Leu Arg Asn1 5<210>59<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>mTf序列<400>59Val Pro Asp Lys Thr1 5<210>60<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0084<400>60ctctaggtct ctagagaaaa ggagctacaa cttgcttgga ttc43<210>61<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0085<400>61gtctgaatgt cccatggagg ctttg25<210>62<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0086<400>62actttccgtc gacctagcta caacttgctt ggattc36<210>63<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0087<400>63tgaatgtcca atggaggctt tgattatttc gaattaagaa tactaaatac 50<210>64
<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GLP-1(7-37)氨基酸序列<400>64His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>65<211>757<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(564)<223>GenBank登录号NM_002176，干扰素-β1<400>65atg acc aac aag tgt ctc ctc caa att gct ctc ctg ttg tgc ttc tcc48Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser1 5 10 15act aca gct ctt tcc atg agc tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga96Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg20 25 30agc agc aat ttt cag tgt cag aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg 144Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg35 40 45ctt gaa tat tgc ctc aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag 192Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu50 55 60att aag cag ctg cag cag ttc cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc 240Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile65 70 75 80tat gag atg ctc cag aac atc ttt gct att ttc aga caa gat tca tct 288Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser85 90 95agc act ggc tgg aat gag act att gtt gag aac ctc ctg gct aat gtc 336Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val100 105 110tat cat cag ata aac cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag 384Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu115 120 125aaa gaa gat ttt acc agg gga aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa 432Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys130 135 140aga tat tat ggg agg att ctg cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt 480Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser145 150 155 160cac tgt gcc tgg acc ata gtc aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac 528His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr165 170 175
ttc att aac aga ctt aca ggt tac ctc cga aac tga agatctccta 574Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn180 185gcctgtccct ctgggactgg acaattgctt caagcattct tcaaccagca gatgctgttt634aagtgactga tggctaatgt actgcaaatg aaaggacact agaagatttt gaaattttta694ttaaattatg agttattttt atttatttaa attttatttt ggaaaataaa ttatttttgg754tgc 757<210>66<211>187<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>66Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser1 5 10 15Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg20 25 30Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg35 40 45Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu50 55 60Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile65 70 75 80Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser85 90 95Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val100 105 110Tyr His Gln lle Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu115 120 125Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys130 135 140Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser145 150 155 160His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr165 170 175Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn180 185<210>67<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pREX0052X的baI/KpnI区域<400>67aggtctctag agaagagggt acctgata 28
<210>68<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pREX0052的SalI/HindIII区域<400>68actttccgtc gaccttaata agcttaattc 30<210>69<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述由pREX0052的XbaI/KpnI区域编码的氨基酸序列<400>69Arg Ser Leu Glu Lys Arg Val Pro Asp1 5<210>70<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述由pREX0052的SalI/HindIII区域编码的氨基酸序列<400>70Thr Phe Arg Arg Pro1 5<210>71<211>450<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(45)..(377)<223>GenBank登录号NM_000207，人胰岛素<400>71gctgcatcag aagaggccat caagcacatc actgtccttc tgcc atg gcc ctg tgg 56Met Ala Leu Trp1atg cgc ctc ctg ccc ctg ctg gcg ctg ctg gcc ctc tgg gga cct gac 104Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Trp Gly Pro Asp5 10 15 20cca gcc gca gcc ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc tca cac ctg gtg 152Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val25 30 35gaa gct ctc tac cta gtg tgc ggg gaa cga ggc ttc ttc tac aca ccc 200Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro40 45 50aag acc cgc cgg gag gca gag gac ctg cag gtg ggg cag gtg gag ctg 248Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu55 60 65
ggc ggg ggc cct ggt gca ggc agc ctg cag ccc ttg gcc ctg gag ggg296Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly70 75 80tcc ctg cag aag cgt ggc att gtg gaa caa tgc tgt acc agc atc tgc344Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys85 90 95 100tcc ctc tac cag ctg gag aac tac tgc aac tag acgcagcccg caggcagccc 397Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn105 110cccacccgcc gcctcctgca ccgagagaga tggaataaag cccttgaacc agc 450<210>72<211>110<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>72Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu1 5 10 15Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly20 25 30Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe35 40 45Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly50 55 60Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu65 70 75 80Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys85 90 95Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn100 105 110<210>73<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于克隆胰岛素序列的5’引物<400>73tttgtgaacc aacacctgtg cggc 24<210>74<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于克隆胰岛素序列的3’引物<400>74gttgcagtag ttctccagct ggtagaggga gcag 34<210>75<211>289
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述质粒pREX0052N-胰岛素<220>
<221>CDS<222>(1)..(288)<400>75gct tac tct agg tct cta gat aag agg ttt gtg aac caa cac ctg tgc48Ala Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys1 5 10 15ggc tca cac ctg gtg gaa gct ctc tac cta gtg tgc ggg gaa cga ggc96Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly20 25 30ttc ttc tac aca ccc aag acc cgc cgg gag gca gag gac ctg cag gtg 144Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val35 40 45ggg cag gtg gag ctg ggc ggg ggc cct ggt gca ggc agc ctg cag ccc 192Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro50 55 60ttg gcc ctg gag ggg tcc ctg cag aag cgt ggc att gtg gaa caa tgc 240Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys65 70 75 80tgt acc agc atc tgc tcc ctc tac cag ctg gag aac tac tgc aac gta c 289Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Val85 90 95<210>76<211>96<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述质粒pREX0052N-胰岛素<400>76Ala Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys1 5 10 15Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly20 25 30Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val35 40 45Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro50 55 60Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys65 70 75 80Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Val85 90 95<210>77<211>49<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5’胰岛素克隆引物<400>77gcttactcta ggtctctaga taagaggttt gtgaaccaac acctgtgcg 49<210>78<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于克隆胰岛素的接头<400>78ctggagaact actgcaacgt ac 22<210>79<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于克隆胰岛素的接头<400>79gttgcagtag ttctccag18<210>80<211>290<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述质粒pREX0052 C-胰岛素<220>
<221>CDS<222>(1)..(276)<400>80tgc act ttc cgt cga cct ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc tca cac48Cys Thr Phe Arg Arg Pro Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His1 5 10 15ctg gtg gaa gct ctc tac cta gtg tgc ggg gaa cga ggc ttc ttc tac96Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr20 25 30aca ccc aag acc cgc cgg gag gca gag gac ctg cag gtg ggg cag gtg 144Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val35 40 45gag ctg ggc ggg ggc cct ggt gca ggc agc ctg cag ccc ttg gcc ctg 192Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu50 55 60gag ggg tcc ctg cag aag cgt ggc att gtg gaa caa tgc tgt acc agc 240Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser65 70 75 80
atc tgc tcc crc tac cag ctg gag aac tac tgc aac taataagctt aatt290Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn85 90<210>81<211>92<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述质粒pREX0052C-胰岛素<400>81Cys Thr Phe Arg Arg Pro Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His1 5 10 15Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr20 25 30Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val35 40 45Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu50 55 60Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser65 70 75 80Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn85 90<210>82<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5’胰岛素克隆引物<400>82tgcactttcc gtcgaccttt tgtgaaccaa cacctgtgcg40<210>83<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述3’胰岛素克隆引物<400>83aattaagctt attagttgca gtagttctcc ag32<210>84<211>676<212>PRT<213>Oryctolagus cuniculus<400>84Val Thr Glu Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Asn Asp His Glu Ala1 5 10 15
Ser Lys Cys Ala Asn Phe Arg Asp Ser Met Lys Lys Val Leu Pro Glu20 25 30Asp Gly Pro Arg Ile Ile Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys35 40 45Ile Lys Ala Ile Ala Ala His Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala50 55 60Gly Leu Val His Glu Ala Gly Leu Thr Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val65 70 75 80Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asn Pro Lys Thr Phe Tyr Tyr85 90 95Ala Val Ala Leu Val Lys Lys Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asn Glu Leu100 105 110Gln Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp115 120 125Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys130 135 140Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Ser Phe Phe Ser Gly Ser Cys Val Pro145 150 155 160Cys Ala Asp Gly Ala Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly165 170 175Cys Gly Cys Ser Ser Val Gln Pro Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe180 185 190Lys Cys Leu Lys Asp Gly Leu Gly Asp Val Ala Phe Val Lys Gln Glu195 200 205Thr Ile Phe Glu Asn Leu Pro Ser Lys Asp Glu Arg Asp Gln Tyr Glu210 215 220Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Glu Gln225 230 235 240Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser His Ala Val Val Ala Arg Ser Val245 250 255Asp Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu260 265 270His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Gly Asp Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro275 280 285His Gly Lys Asn Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Tyr Gly Phe Phe Lys290 295 300Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Asn Leu Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val305 310 315 320Thr Ala Val Arg Asn Leu Arg Glu Gly Ile Cys Pro Asp Pro Leu Gln325 330 335Asp Glu Cys Lys Ala Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg340 345 350Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly Gly Leu Ile Glu Cys355 360 365Glu Ser Ala Glu Thr Pro Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly370 375 380
Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Val Tyr Ile Ala Gly385 390 395 400Gln Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Glu Ser Thr Asp405 410 415Cys Lys Lys Ala Pro Glu Glu Gly Tyr Leu Ser Val Ala Val Val Lys420 425 430Lys Ser Asn Pro Asp Ile Asn Trp Asn Asn Leu Glu Gly Lys Lys Ser435 440 445Cys His Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly450 455 460Leu Leu Tyr Asn Arg Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe Arg465 470 475 480Gln Gly Cys Ala Pro Gly Ser Gln Lys Asn Ser Ser Leu Cys Glu Leu485 490 495Cys Ile Gly Pro Ser Val Cys Ala Pro Asn Asn Arg Glu Gly Tyr Tyr500 505 510Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala515 520 525Phe Val Lys Ser Gln Thr Val Leu Gln Asn Thr Gly Gly Arg Asn Ser530 535 540Glu Pro Trp Ala Lys Asp Leu Lys Glu Glu Asp Phe Glu Leu Leu Cys545 550 555 560Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Ser Glu Ala His Asn Cys His Leu565 570 575Ala Lys Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Lys Asp Lys Ala Ala580 585 590Cys Val Lys Gln Lys Leu Leu Asp Leu Gln Val Glu Tyr Gly Asn Thr595 600 605Val Ala Asp Cys Ser Ser Lys Phe Cys Met Phe His Ser Lys Thr Lys610 615 620Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Lys Cys Leu Val Asp Leu Arg Gly625 630 635 640Lys Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Asp Tyr Ile Lys Ala Val645 650 655Ser Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Arg Leu Leu Glu Ala Cys Thr660 665 670Phe His Lys His675<210>85<211>676<212>PRT<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>85Val Pro Asp Lys Thr Val Lys Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Asn1 5 10 15Thr Lys Cys Ile Ser Phe Arg Asp His Met Lys Thr Val Leu Pro Ala20 25 30
Asp Gly Pro Arg Leu Pro Cys Val Lys Lys Thr Ser Tyr Gln Asp Cys35 40 45Ile Lys Ala Ile Ser Gly Gly Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly50 55 60Gly Trp Val Tyr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val65 70 75 80Ala Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Leu Glu His Arg Gln Thr His Tyr Leu85 90 95Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Thr Asp Phe Gln Leu Asn Gln Leu100 105 110Gln Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp115 120 125Ile Ile Pro Ile Gly Leu Leu Phe Cys Asn Leu Pro Glu Pro Arg Lys130 135 140Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Ser Phe Phe Ser Gly Ser Cys Val Pro145 150 155 160Cys Ala Asp Pro Val Ala Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly165 170 175Cys Gly Cys Ser Pro Thr Gln Pro Phe Phe Gly Tyr Val Gly Ala Phe180 185 190Lys Cys Leu Arg Asp Gly Gly Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Thr195 200 205Thr Ile Phe Glu Val Leu Pro Gln Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu210 215 220Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Gln Tyr Glu Asp225 230 235 240Cys Tyr Leu Ala Arg Ile Pro Ser His Ala Val Val Ala Arg Asn Gly245 250 255Asp Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Ile Leu Lys Val Ala Gln Glu260 265 270His Phe Gly Lys Gly Lys Ser Lys Asp Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro275 280 285Leu Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Arg Phe Gly Leu Leu Arg290 295 300Ala Pro Lys Asp Gly Leu Gln Ala Val Pro Arg Pro Gln Leu Cys His305 310 315 320Cys His Ser Lys Ser Ala Gly Ser Cys Pro Asp Ala Ile Asp Ser Ala325 330 335Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His Gln Glu Arg Ala Lys Cys Asp340 345 350Glu Trp Ser Val Thr Gly Asn Gly Gln Ile Glu Cys Glu Ser Ala Glu355 360 365Ser Thr Glu Asp Cys Ile Asp Lys Ile Val Asn Gly Glu Ala Asp Ala370 375 380Met Ser Leu Asp Gly Gly His Ala Tyr Ile Ala Gly Gln Cys Gly Leu385 390 395 400
Val Pro Val Met Ala Glu Asn Tyr Asp Ile Ser Ser Cys Thr Asn Pro405 410 415Gln Ser Asp Val Phe Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys420 425 430Ala Ser Asp Ser Ser Ile Asn Trp Asn Asn Leu Lys Gly Lys Lys Ser435 440 445Cys His Thr Gly Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly450 455 460Leu Leu Phe Ser Arg Ile Asn His Cys Lys Phe Asp Glu Phe Phe Ser465 470 475 480Gln Gly Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Lys Asn Ser Thr Leu Cys Asp Leu485 490 495Cys Ile Gly Pro Ala Lys Cys Ala Pro Asn Asn Arg Glu Gly Tyr Asn500 505 510Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Gln Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala515 520 525Phe Val Lys His Gln Thr Val Leu Glu Asn Thr Asn Gly Lys Asn Thr530 535 540Ala Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Gln Glu Asp Phe Gln Leu Leu Cys545 550 555 560Pro Asp Gly Thr Lys Lys Pro Val Thr Glu Phe Ala Thr Cys His Leu565 570 575Ala Gln Ala Pro Asn His Val Val Val Ser Arg Lys Glu Lys Ala Ala580 585 590Arg Val Ser Thr Val Leu Thr Ala Gln Lys Asp Leu Phe Trp Lys Gly595 600 605Asp Lys Asp Cys Thr Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser Ser Thr Lys610 615 620Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Lys Cys Leu Thr Lys Leu Pro Glu625 630 635 640Gly Thr Thr Tyr Glu Glu Tyr Leu Gly Ala Glu Tyr Leu Gln Ala Val645 650 655Gly Asn Ile Arg Lys Cys Ser Thr Ser Arg Leu Leu Glu Ala Cys Thr660 665 670Phe His Lys Ser675<210>86<211>677<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>86Val Pro Asp Lys Thr Val Lys Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Asn1 5 10 15Thr Lys Cys Ile Ser Phe Arg Asp His Met Lys Thr Val Leu Pro Pro20 25 30Asp Gly Pro Arg Leu Ala Cys Val Lys Lys Thr Ser Tyr Pro Asp Cys
35 40 45Ile Lys Ala Ile Ser Ala Ser Glu Ala Asp Ala Met Thr Leu Asp Gly50 55 60Gly Trp Val Tyr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val65 70 75 80Ala Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Val Glu His Pro Gln Thr Tyr Tyr Tyr85 90 95Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Thr Asp Phe Gln Leu Asn Gln Leu100 105 110Glu Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp115 120 125Val Ile Pro Ile Gly Leu Leu Phe Cys Lys Leu Ser Glu Pro Arg Ser130 135 140Pro Leu Glu Lys Ala Val Ser Ser Phe Phe Ser Gly Ser Cys Val Pro145 150 155 160Cys Ala Asp Pro Val Ala Phe Pro Lys Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly165 170 175Cys Gly Cys Ser Ser Thr Gln Pro Phe Phe Gly Tyr Val Gly Ala Phe180 185 190Lys Cys Leu Lys Asp Gly Gly Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Thr195 200 205Thr Ile Phe Glu Val Leu Pro Glu Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu210 215 220Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Gln Tyr Glu Asp225 230 235 240Cys Tyr Leu Ala Arg Ile Pro Ser His Ala Val Val Ala Arg Lys Asn245 250 255Asn Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Ile Leu Lys Val Ala Gln Glu260 265 270His Phe Gly Lys Gly Lys Ser Lys Asp Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro275 280 285Leu Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Phe Gly Leu Leu Arg290 295 300Val Pro Pro Arg Met Asp Tyr Arg Leu Tyr Leu Gly His Asn Tyr Val305 310 315 320Thr Ala Ile Arg Asn Gln Gln Glu Gly Val Cys Pro Glu Gly Ser Ile325 330 335Asp Asn Ser Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His Leu Glu Arg Thr340 345 350Lys Cys Asp Glu Trp Ser Ile Ile Ser Glu Gly Lys Ile Glu Cys Glu355 360 365Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Glu Lys Ile Val Asn Gly Glu370 375 380Ala Asp Ala Met Thr Leu Asp Gly Gly His Ala Tyr Ile Ala Gly Gln385 390 395 400
Cys Gly Leu Val Pro Val Met Ala Glu Tyr Tyr Glu Ser Ser Asn Cys405 410 415Ala Ile Pro Ser Gln Gln Gly Ile Phe Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Val420 425 430Ala Val Val Lys Ala Ser Asp Thr Ser Ile Thr Trp Asn Asn Leu Lys435 440 445Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn450 455 460Ile Pro Met Gly Met Leu Tyr Asn Arg Ile Asn His Cys Lys Phe Asp465 470 475 480Glu Phe Phe Ser Gln Gly Cys Ala Pro Gly Tyr Glu Lys Asn Ser Thr485 490 495Leu Cys Asp Leu Cys Ile Gly Pro Leu Lys Cys Ala Pro Asn Asn Lys500 505 510Glu Glu Tyr Asn Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys515 520 525Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Leu Asp Asn Thr Glu530 535 540Gly Lys Asn Pro Ala Glu Trp Ala Lys Asn Leu Lys Gln Glu Asp Phe545 550 555 560Glu Leu Leu Cys Pro Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Lys Asp Phe Ala565 570 575Ser Cys His Leu Ala Gln Ala Pro Asn His Val Val Val Ser Arg Lys580 585 590Glu Lys Ala Ala Arg Val Lys Ala Val Leu Thr Ser Gln Glu Thr Leu595 600 605Phe Gly Gly Ser Asp Cys Thr Gly Asn Phe Cys Leu Phe Lys Ser Thr6l0 615 620Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Lys Cys Phe Val Lys Leu625 630 635 640Pro Glu Gly Thr Thr Pro Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Glu Tyr Met Gln645 650 655Ser Val Gly Asn Met Arg Lys Cys Ser Thr Ser Arg Leu Leu Glu Ala660 665 670Cys Thr Phe His Lys675<210>87<211>688<212>PRT<213>马(Equus caballus)<400>87Ala Glu Gln Thr Val Arg Trp Cys Thr Val Ser Asn His Glu Val Ser1 5 10 15Lys Cys Ala Ser Phe Arg Asp Ser Met Lys Ser Ile Val Pro Ala Pro20 25 30Pro Leu Val Ala Cys Val Lys Arg Thr Ser Tyr Leu Glu Cys Ile Lys
35 40 45Ala Ile Ala Asp Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala Gly Leu50 55 60Val Phe Glu Ala Gly Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Lys Pro Val Val Ala65 70 75 80Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Thr Glu Pro Gln Thr His Tyr Tyr Ala Val85 90 95Ala Val Val Lys Lys Asn Ser Asn Phe Gln Leu Asn Gln Leu Gln Gly100 105 110Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Asn Ile115 120 125Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Trp Gln Leu Pro Glu Pro Arg Glu Ser Leu130 135 140Gln Lys Ala Val Ser Asn Phe Phe Ala Gly Ser Cys Val Pro Cys Ala145 150 155 160Asp Arg Thr Ala Val Pro Asn Leu Cys Gln Leu Cys Val Gly Lys Gly165 170 175Thr Asp Lys Cys Ala Cys Ser Asn His Glu Pro Tyr Phe Gly Tyr Ser180 185 190Gly Ala Phe Lys Cys Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val195 200 205Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Leu Pro Gln Glu Ala Asp Arg Asp210 215 220Glu Tyr Gln Leu Leu Cys Arg Asp Asn Thr Arg Lys Ser Val Asp Glu225 230 235 240Tyr Lys Asp Cys Tyr Leu Ala Ser Ile Pro Ser His Ala Val Val Ala245 250 255Arg Ser Val Asp Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Gly Leu Leu Asn Gln260 265 270Ala Gln Glu His Phe Gly Thr Glu Lys Ser Lys Asp Phe His Leu Phe275 280 285Ser Ser Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Leu Gly290 295 300Phe Leu Arg Ile Pro Pro Ala Met Asp Thr Trp Leu Tyr Leu Gly Tyr305 310 315 320Glu Tyr Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Asp Ile Arg Pro Glu325 330 335Val Pro Lys Asp Glu Cys Lys Lys Val Lys Trp Cys Ala Ile Gly His340 345 350His Glu Lys Val Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Gly Gly Asn355 360 365Ile Glu Cys Glu Ser Ala Gln Ser Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile370 375 380Val Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Ile Tyr385 390 395 400Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
405 410 415Thr Arg Ser Gly Ser Ala Cys Val Asp Thr Pro Glu Glu Gly Tyr His420 425 430Ala Val Ala Val Val Lys Ser Ser Ser Asp Pro Asp Leu Thr Trp Asn435 440 445Ser Leu Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Val Asp Arg Thr Ala450 455 460Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Ser Glu Ile Lys His Cys465 470 475 480Glu Phe Asp Lys Phe Phe Arg Glu Gly Cys Ala Pro Gly Tyr Arg Arg485 490 495Asn Ser Thr Leu Cys Asn Leu Cys Ile Gly Ser Ala Ser Gly Pro Gly500 505 510Arg Glu Cys Glu Pro Asn Asn His Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly515 520 525Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His530 535 540Gln Thr Val Glu Gln Asn Thr Asp Gly Arg Asn Pro Asp Asp Trp Ala545 550 555 560Lys Asp Leu Lys Ser Glu Asn Phe Lys Leu Leu Cys Pro Asp Gly Thr565 570 575Arg Lys Ser Val Thr Glu Phe Lys Ser Cys Tyr Leu Ala Arg Ala Pro580 585 590Asn His Ala Val Val Ser Arg Lys Glu Lys Ala Ala Cys Val Cys Gln595 600 605Glu Leu His Asn Gln Gln Ala Ser Tyr Gly Lys Asn Gly Ser His Cys610 615 620Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser Ala Thr Lys Asp Leu Leu Phe625 630 635 640Arg Asp Asp Thr Gln Cys Leu Ala Asn Leu Gln Pro Thr Thr Thr Tyr645 650 655Lys Thr Tyr Leu Gly Glu Lys Tyr Leu Thr Ala Val Ala Asn Leu Arg660 665 670Gln Cys Ser Thr Ser Arg Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe His Arg Val675 680 685<210>88<211>685<212>PRT<213>牛(Bos taurus)<400>88Asp Pro Glu Arg Thr Val Arg Trp Cys Thr Ile Ser Thr His Glu Ala1 5 10 15Asn Lys Cys Ala Ser Phe Arg Glu Asn Val Leu Arg Ile Leu Glu Ser20 25 30Gly Pro Phe Val Ser Cys Val Lys Lys Thr Ser His Met Asp Cys Ile35 40 45
Lys Ala Ile Ser Asn Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Gly Gly50 55 60Leu Val Tyr Glu Ala Gly Leu Lys Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val Val65 70 75 80Ala Glu Phe His Gly Thr Lys Asp Asn Pro Gln Thr His Tyr Tyr Ala85 90 95Val Ala Val Val Lys Lys Asp Thr Asp Phe Lys Leu Asn Glu Leu Arg100 105 110Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Asn115 120 125Ile Pro Met Ala Lys Leu Tyr Lys Glu Leu Pro Asp Pro Gln Glu Ser130 135 140Ile Gln Arg Ala Ala Ala Asn Phe Phe Ser Ala Ser Cys Val Pro Cys145 150 155 160Ala Asp Gln Ser Ser Phe Pro Lys Leu Cys Gln Leu Cys Ala Gly Lys165 170 175Gly Thr Asp Lys Cys Ala Cys Ser Asn His Glu Pro Tyr Phe Gly Tyr180 185 190Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Met Glu Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe195 200 205Val Lys His Ser Thr Val Phe Asp Asn Leu Pro Asn Pro Glu Asp Arg210 215 220Lys Asn Tyr Glu Leu Leu Cys Gly Asp Asn Thr Arg Lys Ser Val Asp225 230 235 240Asp Tyr Gln Glu Cys Tyr Leu Ala Met Val Pro Ser His Ala Val Val245 250 255Ala Arg Thr Val Gly Gly Lys Glu Asp Val Ile Trp Glu Leu Leu Asn260 265 270His Ala Gln Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Pro Asp Asn Phe Gln Leu275 280 285Phe Gln Ser Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Asp290 295 300Gly Phe Leu Lys Ile Pro Ser Lys Met Asp Phe Glu Leu Tyr Leu Gly305 310 315 320Tyr Glu Tyr Val Thr Ala Leu Gln Asn Leu Arg Glu Ser Lys Pro Pro325 330 335Asp Ser Ser Lys Asp Glu Cys Met Val Lys Trp Cys Ala Ile Gly His340 345 350Gln Glu Arg Thr Lys Cys Asp Arg Trp Ser Gly Phe Ser Gly Gly Ala355 360 365Ile Glu Cys Glu Thr Ala Glu Asn Thr Glu Glu Cys Ile Ala Lys Ile370 375 380Met Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr385 390 395 400Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Lys405 410 415
Thr Glu Gly Glu Ser Cys Lys Asn Thr Pro Glu Lys Gly Tyr Leu Ala420 425 430Val Ala Val Val Lys Thr Ser Asp Ala Asn Ile Asn Trp Asn Asn Leu435 440 445Lys Asp Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp450 455 460Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Ser Lys Ile Asn Asn Cys Lys Phe465 470 475 480Asp Glu Phe Phe Ser Ala Gly Cys Ala Pro Gly Ser Pro Arg Asn Ser485 490 495Ser Leu Cys Ala Leu Cys Ile Gly Ser Glu Lys Gly Thr Gly Lys Glu500 505 510Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe515 520 525Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Gln Thr530 535 540Val Ile Gln Asn Thr Asp Gly Asn Asn Asn Glu Ala Trp Ala Lys Asn545 550 555 560Leu Lys Lys Glu Asn Phe Glu Val Leu Cys Lys Asp Gly Thr Arg Lys565 570 575Pro Val Thr Asp Ala Glu Asn Cys His Leu Ala Arg Gly Pro Asn His580 585 590Ala Val Val Ser Arg Lys Asp Lys Ala Thr Cys Val Glu Lys Ile Leu595 600 605Asn Lys Gln Gln Asp Asp Phe Gly Lys Ser Val Thr Asp Cys Thr Ser610 615 620Asn Phe Cys Leu Phe Gln Ser Asn Ser Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp625 630 635 640Asp Thr Lys Cys Leu Ala Ser Ile Ala Lys Lys Thr Tyr Asp Ser Tyr645 650 655Leu Gly Asp Asp Tyr Val Arg Ala Met Thr Asn Leu Arg Gln Cys Ser660 665 670Thr Ser Lys Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe His Lys Pro675 680 685<210>89<211>696<212>PRT<213>Sus scrofa<220>
<221>未知特征<222>(308)..(308)<223>Xaa可以是任何天然氨基酸<400>89Val Ala Gln Lys Thr Val Arg Trp Cys Thr Ile Ser Asn Gln Glu Ala1 5 10 15Asn Lys Cys Ser Ser Phe Arg Glu Asn Met Ser Lys Ala Val Lys Asn20 25 30
Gly Pro Leu Val Ser Cys Val Lys Lys Ser Ser Tyr Leu Asp Cys Ile35 40 45Lys Ala Ile Arg Asp Lys Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala Gly50 55 60Leu Val Phe Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Asn Leu Lys Pro Val Val65 70 75 80Ala Glu Phe Tyr Gly Gln Lys Asp Asn Pro Gln Thr His Tyr Tyr Ala85 90 95Val Ala Val Val Lys Lys Gly Ser Asn Phe Gln Trp Asn Gln Leu Gln100 105 110Gly Lys Arg Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Ile115 120 125Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Asp Gln Leu Pro Glu Pro Arg Lys Pro130 135 140Ile Glu Lys Ala Val Ala Ser Phe Phe Ser Ser Ser Cys Val Pro Cys145 150 155 160Ala Asp Pro Val Asn Phe Pro Lys Leu Cys Gln Gln Cys Ala Gly Lys165 170 175Gly Ala Glu Lys Cys Ala Cys Ser Asn His Glu Pro Tyr Phe Gly Tyr180 185 190Ala Gly Ala Phe Asn Cys Leu Lys Glu Asp Ala Gly Asp Val Ala Phe195 200 205Val Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Leu Pro Asp Lys Ala Asp Arg210 215 220Asp Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Arg Asp Asn Thr Arg Arg Pro Val Asp225 230 235 240Asp Tyr Glu Asn Cys Tyr Leu Ala Gln Val Pro Ser His Ala Val Val245 250 255Ala Arg Ser Val Asp Gly Gln Glu Asp Ser Ile Trp Glu Leu Leu Asn260 265 270Gln Ala Gln Glu His Phe Gly Arg Asp Lys Ser Pro Asp Phe Gln Leu275 280 285Phe Ser Ser Ser His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Asn290 295 300Gly Phe Leu Xaa Ile Pro Ser Lys Met Asp Ser Ser Leu Tyr Leu Gly305 310 315 320Tyr Gln Tyr Val Thr Ala Leu Arg Asn Leu Arg Glu Glu Ile Ser Pro325 330 335Asp Ser Ser Lys Asn Glu Cys Lys Lys Val Arg Trp Cys Ala Ile Gly340 345 350His Glu Glu Thr Gln Lys Cys Asp Ala Trp Ser Ile Asn Ser Gly Gly355 360 365Lys Ile Glu Cys Val Ser Ala Glu Asn Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys370 375 380Ile Val Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Ile385 390 395 400
Tyr Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr405 410 415Lys Thr Glu Gly Glu Asn Cys Val Asn Thr Pro Glu Lys Gly Tyr Leu420 425 430Ala Val Ala Val Val Lys Lys Ser Ser Gly Pro Asp Leu Asn Trp Asn435 440 445Asn Leu Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala450 455 460Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn Ser Cys465 470 475 480Lys Phe Asp Gln Phe Phe Gly Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Gln Arg485 490 495Asn Ser Ser Leu Cys Ala Leu Cys Ile Gly Ser Glu Arg Ala Pro Gly500 505 510Arg Glu Cys Leu Ala Asn Asn His Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly515 520 525Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys Asp530 535 540Gln Val Val Gln Gln Asn Thr Asp Gly Lys Asn Lys Asp Asp Trp Ala545 550 555 560Lys Asp Leu Lys Gln Met Asp Phe Glu Leu Leu Cys Gln Asn Gly Ala565 570 575Arg Glu Pro Val Asp Asn Ala Glu Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro580 585 590Asn His Ala Val Val Ala Arg Asp Asp Lys Val Thr Cys Val Ala Glu595 600 605Glu Leu Leu Lys Gln Gln Ala Gln Phe Gly Arg His Val Thr Asp Cys610 615 620Ser Ser Ser Phe Cys Met Phe Lys Ser Asn Thr Lys Asp Leu Leu Phe625 630 635 640Arg Asp Asp Thr Gln Cys Leu Ala Arg Val Gly Lys Thr Thr Tyr Glu645 650 655Ser Tyr Leu Gly Ala Asp Tyr Ile Thr Ala Val Ala Asn Leu Arg Lys660 665 670Cys Ser Thr Ser Lys Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe His Ser Ala Lys675 680 685Asn Pro Arg Val Glu Thr Thr Thr690 695<210>90<211>686<212>PRT<213>原鸡(Gallus gallus)<400>90Ala Pro Pro Lys Ser Val Ile Arg Trp Cys Thr Ile Ser Ser Pro Glu1 5 10 15Glu Lys Lys Cys Asn Asn Leu Arg Asp Leu Thr Gln Gln Glu Arg Ile
20 25 30Ser Leu Thr Cys Val Gln Lys Ala Thr Tyr Leu Asp Cys Ile Lys Ala35 40 45Ile Ala Asn Asn Glu Ala Asp Ala Ile Ser Leu Asp Gly Gly Gln Ala50 55 60Phe Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Lys Pro Ile Ala Ala Glu65 70 75 80Val Tyr Glu His Thr Glu Gly Ser Thr Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala85 90 95Val Val Lys Lys Gly Thr Glu Phe Thr Val Asn Asp Leu Gln Gly Lys100 105 110Thr Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Asn Ile Pro115 120 125Ile Gly Thr Leu Leu His Arg Gly Ala Ile Glu Trp Glu Gly Ile Glu130 135 140Ser Gly Ser Val Glu Gln Ala Val Ala Lys Phe Phe Ser Ala Ser Cys145 150 155 160Val Pro Gly Ala Thr Ile Glu Gln Lys Leu Cys Arg Gln Cys Lys Gly165 170 175Asp Pro Lys Thr Lys Cys Ala Arg Asn Ala Pro Tyr Ser Gly Tyr Ser180 185 190Gly Ala Phe His Cys Leu Lys Asp Gly Lys Gly Asp Val Ala Phe Val195 200 205Lys His Thr Thr Val Asn Glu Asn Ala Pro Asp Gln Lys Asp Glu Tyr210 215 220Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Ser Arg Gln Pro Val Asp Asn Tyr Lys225 230 235 240Thr Cys Asn Trp Ala Arg Val Ala Ala His Ala Val Val Ala Arg Asp245 250 255Asp Asn Lys Val Glu Asp Ile Trp Ser Phe Leu Ser Lys Ala Gln Ser260 265 270Asp Phe Gly Val Asp Thr Lys Ser Asp Phe His Leu Phe Gly Pro Pro275 280 285Gly Lys Lys Asp Pro Val Leu Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala290 295 300Ile Met Leu Lys Arg Val Pro Ser Leu Met Asp Ser Gln Leu Tyr Leu305 310 315 320Gly Phe Glu Tyr Tyr Ser Ala Ile Gln Ser Met Arg Lys Asp Gln Leu325 330 335Thr Pro Ser Pro Arg Glu Asn Arg Ile Gln Trp Cys Ala Val Gly Lys340 345 350Asp Glu Lys Ser Lys Cys Asp Arg Trp Ser Val Val Ser Asn Gly Asp355 360 365Val Glu Cys Thr Val Val Asp Glu Thr Lys Asp Cys Ile Ile Lys Ile370 375 380
Met Lys Gly Glu Ala Asp Ala Val Ala Leu Asp Gly Gly Leu Val Tyr385 390 395 400Thr Ala Gly Val Cys Gly Leu Val Pro Val Met Ala Glu Arg Tyr Asp405 410 415Asp Glu Ser Gln Cys Ser Lys Thr Asp Glu Arg Pro Ala Ser Tyr Phe420 425 430Ala Val Ala Val Ala Arg Lys Asp Ser Asn Val Asn Trp Asn Asn Leu435 440 445Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp450 455 460Val Ile Pro Met Gly Leu Ile His Asn Arg Thr Gly Thr Cys Asn Phe465 470 475 480Asp Glu Tyr Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Pro Pro Asn Ser485 490 495Arg Leu Cys Gln Leu Cys Gln Gly Ser Gly Gly Ile Pro Pro Glu Lys500 505 510Cys Val Ala Ser Ser His Glu Lys Tyr Phe Gly Tyr Thr Gly Ala Leu515 520 525Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Ile Gln His Ser Thr530 535 540Val Glu Glu Asn Thr Gly Gly Lys Asn Lys Ala Asp Trp Ala Lys Asn545 550 555 560Leu Gln Met Asp Asp Phe Glu Leu Leu Cys Thr Asp Gly Arg Arg Ala565 570 575Asn Val Met Asp Tyr Arg Glu Cys Asn Leu Ala Glu Val Pro Thr His580 585 590Ala Val Val Val Arg Pro Glu Lys Ala Asn Lys Ile Arg Asp Leu Leu595 600 605Glu Arg Gln Glu Lys Arg Phe Gly Val Asn Gly Ser Glu Lys Ser Lys610 615 620Phe Met Met Phe Glu Ser Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Leu625 630 635 640Thr Lys Cys Leu Phe Lys Val Arg Glu Gly Thr Thr Tyr Lys Glu Phe645 650 655Leu Gly Asp Lys Phe Tyr Thr Val Ile Ser Ser Leu Lys Thr Cys Asn660 665 670Pro Ser Asp Ile Leu Gln Met Cys Ser Phe Leu Glu Gly Lys675 680 68权利要求
1.包含被融合到治疗性蛋白质或肽上的被修饰的转铁蛋白(Tf)的融合蛋白，其中Tf蛋白的糖基化减少，金属结合降低或受体结合降低。
2.权利要求1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽选自包含β-干扰素(IFN)、胰高血糖素样肽(GLP-1)、促红细胞生成素模拟肽(EMP1)、T-20、胰岛素和可溶的毒素受体的组。
3.权利要求2的融合蛋白，其中可溶的毒素受体是突触结合蛋白I。
4.权利要求1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽或者可溶的毒素受体被融合到Tf的C末端。
5.权利要求1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽或者可溶的毒素受体被融合到Tf的N末端。
6.权利要求1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽或者可溶的毒素受体被插入到Tf的至少一个环中。
7.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白质对转铁蛋白受体(TfR)的亲合性下降。
8.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳铁蛋白。
9.权利要求7的融合蛋白，其中Tf蛋白不结合TfR。
10.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白对铁的亲合性下降。
11.权利要求10的融合蛋白，其中Tf蛋白不结合铁。
12.权利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含至少一个防止糖基化的突变。
13.权利要求12的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳铁蛋白。
14.权利要求1的融合蛋白，其在存在衣霉素时被表达。
15.权利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含Tf蛋白质的N-结构域的部分、桥连肽和Tf蛋白质的C-结构域的部分。
16.权利要求15的融合蛋白，其中桥连肽将治疗性蛋白质或肽连接到Tf上。
17.权利要求15的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽被插入到Tf蛋白质的N末端和C-结构域之间。
18.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白质在铰链区包含至少一个氨基酸取代、删除或添加。
19.权利要求18的融合蛋白，其中所述铰链区选自SEQ ID NO3的约残基94到约残基96、SEQ ID NO3的约残基245到约残基247、SEQ IDNO3的约残基316到约残基318、SEQ ID NO3的约残基425到约残基427、SEQ ID NO3的约残基581到约残基582或SEQ ID NO3的约残基652到约残基658。
20.权利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白质在SEQ ID NO3中的选自Asp 63、Gly 65、Tyr 95、Tyr 188、Lys 206、His 207、His 249、Asp 392、Tyr 426、Tyr 514、Tyr 517、His 585、Thr 120、Arg 124、Ala 126、Gly 127、Thr 452、Arg 456、Ala 458或Gly 459的位置上具有至少一个氨基酸取代、删除或添加。
21.权利要求6的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽替换Tf的至少一个环。
22.权利要求12的融合蛋白，其中糖基化位点选自对应于SEQ ID NO3的氨基酸N413和SEQ ID NO3的N611的氨基酸残基组成的组。
23.权利要求7或9的融合蛋白，其中所述Tf蛋白质在SEQ ID NO3的选自Asp 63、Gly 65、Tyr 95、Tyr 188、Lys 206、His 207、His 249、Asp 392、Tyr 426、Tyr 514、Tyr 517、His 585、Thr 120、Arg 124、Ala 126、Gly 127、Thr 452、Arg 456、Ala 458或Gly 459的位置上具有至少一个氨基酸取代、删除或添加。
24.权利要求4的融合蛋白，其中TfC末端的脯氨酸残基被删除。
25.权利要求4的融合蛋白，其中TfC末端的半胱氨酸环被删除。
26.权利要求1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽的血清半衰期被延长，超过了未被融合的治疗性蛋白质或肽或可溶的毒性受体的血清半衰期。
27.权利要求1的融合蛋白，其中Tf融合蛋白不结合TfR。
28.权利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白的糖基化减少或无糖基化。
29.权利要求28的融合蛋白，包含至少一个防止糖基化的突变。
30.编码权利要求1的融合蛋白的核酸分子。
31.包含权利要求30的核酸分子的载体。
32.包含权利要求31的载体的宿主细胞。
33.包含权利要求30的核酸分子的宿主细胞。
34.表达Tf融合蛋白的方法，包括在表达被编码的融合蛋白的条件下培养权利要求32的宿主细胞。
35.表达Tf融合蛋白的方法，包括在表达被编码的融合蛋白的条件下培养权利要求33的宿主细胞。
36.权利要求32的宿主细胞，其中该细胞是原核细胞或真核细胞。
37.权利要求33的宿主细胞，其中该细胞是原核细胞或真核细胞。
38.权利要求36的宿主细胞，其中该细胞是酵母细胞。
39.权利要求37的宿主细胞，其中该细胞是酵母细胞。
40.包含权利要求30的核酸分子的转基因动物。
41.制备Tf融合蛋白的方法，包括从权利要求40的转基因动物中分离融合蛋白。
42.权利要求41的方法，其中Tf融合蛋白包含乳铁蛋白。
43.权利要求42的方法，其中融合蛋白从来自转基因动物的生物体液中分离。
44.权利要求42的方法，其中体液是血清或乳汁。
45.在患者中治疗疾病或疾病病症的方法，包括施用权利要求1的融合蛋白的步骤。
46.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白在该蛋白的各端具有N-结构域。
47.权利要求46的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽或可溶的毒素受体与Tf蛋白的各个N-结构域融合。
48.权利要求2的融合蛋白，其中可溶的毒素受体特异地结合毒素。
49.权利要求2的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽是β-IFN、GLP-1、促红细胞生成素模拟肽(EMP1)、T-20、胰岛素或可溶的毒素受体的类似物，其中该类似物可有效用于治疗、预防或缓解疾病、病症或紊乱。
50.药物组合物，包含权利要求1、2或3的融合蛋白以及载体。
51.治疗个体的方法，包括给个体施用治疗有效量的权利要求1的融合蛋白。
52.权利要求51的方法，其中该个体患有多发性硬化、脑瘤、皮肤癌、乙型肝炎或丙型肝炎，并且其中融合蛋白包含β-IFN或其类似物。
53.权利要求52的方法，其中该个体患有多发性硬化。
54.权利要求51的方法，其中该个体患与健康个体相比的高水平的葡萄糖，并且其中融合蛋白包含GLP-1或其类似物。
55.权利要求54的方法，其中高水平的葡萄糖与糖尿病相关。
56.权利要求55的方法，其中糖尿病是II型糖尿病。
57.权利要求51的方法，其中个体遭受与健康个体相比的低或缺乏红细胞生成，其中融合蛋白包含EMP1或其类似物。
58.权利要求57的方法，其中低或缺乏红细胞生成与贫血、β-地中海贫血、妊娠或月经紊乱、类风湿性关节炎、AIDS或癌症有关。
59.权利要求51的方法，其中个体患有由逆转录病毒传播引起的疾病，并且其中治疗性肽是病毒侵入的抑制剂。
60.权利要求59的方法，其中逆转录病毒是人逆转录病毒。
61.权利要求60的方法，其中人逆转录病毒选自HIV-1、HIV-2和人T-淋巴细胞病毒I(HTLV-1)、HTLV-II和HTLV-III组成的组。
62.权利要求59的方法，其中逆转录病毒是非人类逆转录病毒。
63.权利要求62的方法，其中非人类逆转录病毒选自牛白血性增生病毒、猫科肉瘤和白血病病毒、猿肉瘤和白血病病毒以及绵羊渐进性肺炎病毒组成的组。
64.权利要求59的方法，其中抑制剂是T-20、T-1249或其类似物。
65.权利要求59的方法，其中疾病是AIDS。
66.预防或治疗与毒素相关的疾病或病症的方法，包括给个体施用治疗有效量的包含被融合到可溶的毒素受体的被修饰Tf蛋白的融合蛋白，其中被修饰的Tf蛋白的糖基化减少、金属结合下降或受体结合下降。
67.权利要求66的方法，其中可溶的毒素受体选自炭疽毒素受体、肉毒杆菌毒素受体和白喉毒素受体。
68.权利要求67的方法，其中可溶的肉毒杆菌毒素受体是突触结合蛋白的氨基酸1-53(SEQ ID NO4)。
69.权利要求1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽被插入到一个或多个转铁蛋白的环中。
70.权利要求69的融合蛋白，其中治疗性蛋白质被插入到5个转铁蛋白环的每一个中。
71.权利要求2的融合蛋白，其中GLP-1在N末端还包含其它氨基酸。
72.权利要求71的融合蛋白，其中氨基酸是Gly。
73.权利要求71的融合蛋白，其中GLP-1类似物被融合到被修饰的转铁蛋白的N末端。
74.调节个体中的葡萄糖水平的方法，包括给个体施用治疗有效量的包含被融合到GLP-1或其类似物上的被修饰的Tf蛋白的融合蛋白，其中被修饰的Tf蛋白的糖基化减少、金属结合下降或者受体结合下降。
75.权利要求1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽在SEQ ID NO3中的选自Asp33、Asn55、Asn75、Asp90、Gly257、Lys280、His289、Ser298、Ser105、Glu141、Asp166、Gln184、asp197、Lys217、Thr231和Cys241组成的组的一个或多个位点上被插入到mTf的N-结构域中。
76.权利要求1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽在SEQ ID NO3中的对应于Asp33、Asn55、Asn75、Asp90、Gly257、Lys280、His289、Ser298、Ser105、Glu141、Asp166、Gln184、asp197、Lys217、Thr231或Cys241的一个或多个位点上被插入到mTf的C-结构域。
77.权利要求75的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽还在SEQ ID NO3中的对应于Asp33、Asn55、Asn75，、Asp90、Gly257、Lys280、His289、Ser298、Ser105、Glu141、Asp166、Gln184、asp197、Lys217、Thr231或Cys241的一个或多个位点上被插入到mTf中。
78.权利要求2的融合蛋白，其中治疗性肽是EMP1，而其中EMP1在选自SEQ ID NO3的His289和SEQ ID NO3的Asp166的一个或多个位点上被插入到mTf的N-结构域中。
79.权利要求2的融合蛋白，其中治疗性肽是EMP1，而其中EMP1在选自SEQ ID NO3的His289和SEQ ID NO3的Asp166的一个或多个位点上被插入到mTf的C-结构域中。
80.权利要求78的融合蛋白，其中治疗性肽还在对应于SEQ ID NO3的His289和SEQ ID NO3的Asp166的一个或多个位点上被插入到mTf的C-结构域中。
81.权利要求1融合蛋白，其中mTf还通过删除C末端的Pro来被修饰。
82.权利要求81的融合蛋白，其中mTf还通过删除与C末端的Pro相邻的Arg-Arg来修饰。
83.权利要求1的融合蛋白，其中mTf还通过去除SEQ ID NO3的Cys402和Cys674之间的二硫键来修饰。
84.权利要求83的融合蛋白，其中通过将SEQ ID NO3的Cys402和Cys674突变为Gly残基来去除二硫键。
85.权利要求82的融合蛋白，其中mTf还通过将SEQ ID NO3的Cys402和Cys674突变为Gly残基来修饰。
86.权利要求1融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽被插入到一个或多个选自N1(286-292)、N2(162-170)、C1(489-495)和C2(623-628)的SEQ ID NO3的环中。
87.权利要求1融合蛋白，其中被修饰的Tf蛋白包含单一的N-结构域。
88.权利要求51的方法，其中该个体患与健康个体相比的高水平的葡萄糖，并且其中融合蛋白包含胰岛素或其类似物。
89.权利要求88的方法，其中高水平的葡萄糖是与糖尿病相关。
全文摘要
公开了转铁蛋白与包括可溶的毒素受体的治疗性蛋白或肽的被修饰的融合蛋白，其血清半衰期或者血清稳定性被提高。优选的融合蛋白包括那些使转铁蛋白部分不发生或减少糖基化，结合铁和/或结合转铁蛋白受体的修饰。
文档编号C07K7/06GK1713920SQ03824739
公开日2005年12月28日 申请日期2003年8月28日 优先权日2002年8月30日
发明者克里斯托弗·P·普里奥尔, 查尔－休伊·莱, 霍马扬·萨德吉, 安德鲁·J·特纳 申请人:比奥雷克西斯药物公司