专利名称：抑制蛋白质和酶活性的具有配位的双(二苯基膦)二茂铁配体的环钯化合物和相关的疾病 ...的制作方法
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本发明涉及含有双二苯基膦-二茂铁配位配体的环钯化合物和其类似物，其作为肽和酶的活性抑制剂，这些肽和酶包括丝氨酸肽酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和肽链内切酶家族，其中的一些是恶性肿瘤生长和转移路线所必需的。通过作用于这些酶并参与DNA分子的插入，这些化合物调控免疫系统。
本发明的基础在制药领域，研究者特别关注无机化学的研究，因为其在治疗一系列疾病方面的用途比传统药物具有明显的优点。
得到最佳研究的无机药物是顺铂，一种临床用来治疗许多种肿瘤的药物。人们相信，其是以与DNA发生相互作用而抑制肿瘤细胞的增生的方式而发挥作用的(Lippard，Science 2181075-1082(1982)；Rosenberg，Nature 222385(1969)；Cleare等，Bioinorg.Chem.2187(1973))。这种化合物能有效地对抗不同种肿瘤，具有高细胞毒性，并广泛地作用于正常细胞(Ebert，U.，Loffler，H.，Kirch，W.，Pharmacology & Therapeutics，74(2)207-2201997；Spencer C.M.，Goa K.L.，Drugs，50(6)1001-1031 DEC 1995)。
基于金的复合体已用于治疗关节炎，其作用路径包括与蛋白质硫醇基团连接，从而抑制使其变性的二硫键桥(disulphite bridges)出现。
钴的金属复合体也已指出具有抗病毒、抗肿瘤和抗微生物活性及抗炎症属性。
能够改变或连接蛋白质的功能性位点，从而使其生物活性丧失的金属化合物在美国专利No.5,880,149中有描述。该文献公开了一些钯复合体(属于配位化合物)，作为半胱氨酸蛋白酶的不可逆性抑制剂，作为有效的抗肿瘤药物和作为对大量感染过程非常有效的药物，其中涉及到半胱氨酸蛋白酶的作用路径。例如，我们提到钯复合体对组织蛋白酶(Cathepsins)B、H、J、L、N、S、T和C及对白介素转化酶(白介素Converter Enzyme，ICE)的酶抑制作用，从而组成对抗阿米巴病、锥虫病和利什曼病的活性药物。该美国专利是已发表的关于抗肿瘤药物，包括化学元素钯化合物的作用的产生和路径的最新成果。
本发明的公开本发明提供了改良了的钯复合体(属于有机金属化合物家族)，其含有δC-PD键和配位键Y→Pd，形成有机环，因而将这些化合物命名为环钯，也称为钯环。
本发明所涵盖的上述化合物可以用如下示意
图1的通式A、B或C定义
示意图1 其中-X代表选自下列的元素卤素(Cl、F、Br、I)；拟卤素(N3、NCO、NCS、SCN)；或乙酸根；和-Y代表选自元素周期表V或VI族的元素，如N、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Te；-C代表sp2或sp3杂化的碳原子，其与钯原子共价连接。含有C、Y和D的所示的环可以由三到八个原子组成。
-C和Y之间，用曲线表示，具有连续的原子形成环钯的环，由三到八个原子组成，包括钯原子。典型地，非限制性地，所述原子选自碳、氮、氧或硫。另一方面，构成该环的每一个原子与其它原子或基团相连，形成该环的可变外部结构，线状或环状，本申请人对此不作特别限制。
-L代表配位配体，其是来源于元素周期表V组(N、P、As、Sb、Bi)的供体原子(donating atom)，位于双二苯基膦-二茂铁化合物中，具体如下示意图2所示，所示存在的L-L表明在所述的双二苯基膦-二茂铁化合物中存在两个连接子L，而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12分别代表了下列基团，可以任何顺序出现氢(H)、烷基、芳基、二烯基、烷氧基、硅氧基、羟基(OH)、氨基(-NH2)、亚胺基、卤素(F、Cl、Br、I)、亚氨基、硝基(-NO2)。
示意图2 依据用于合成的双二苯基膦-二茂铁配体的比例及溶剂的比例，可以产生单核分子化合物(结构1A，单齿环钯化合物)、单核离子(结构1B，鳌合的双齿环钯化合物)和双核分子(结构1C，桥状的双齿环钯化合物)。当使用2mol的双齿(bidentade)配体L-L与1mol的起始复合物时产生结构1A和1B的化合物，当使用的比例是1∶1时，获得结构1C所示的化合物。
在本申请中，[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl]代表示意图1A的具有单齿dppf配体的单核分子钯复合物，[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl]代表示意图1B的以dppf连接子作为双齿鳌合剂的离子型单核钯复合物，[Pd2(C2，N-R+dmpa)2(μ-dppf)Cl2]显示了以dppf连接子作为桥状双齿连接子的双核分子钯复合物。
在本发明的特定具体实施方案中，所获得环钯化合物如示意图3和4所示，分别来源于N，N-二甲基-苄胺(示意图3)和炔，即嘧啶基-苯基-乙炔(示意图4A)和1-苯基-3-N，N二甲胺-丙炔(propine)(示意图4B)。
示意图3 示意图4
本发明的更特定的具体实施方案是N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)，下面的示意图5由N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)-对映异构体R(+)和对映异构体S(-)形成的环金属环。
示意图5 仅作为说明，上文示意图3至5所示显示了环钯环，其应该理解为下面示意图6所解释的构象(以示意图3的结构为例)示意图6
在这个图中，所述环钯环含有5个原子，如A1至A5所示，如前文所述方式连接，即-碳原子(A1)通过δ键与钯(A5)连接；-氮原子(A4，在通式中一般定义为Y)通过共价的供体成键与钯(A5)连接；-原子A2是碳，其还与A1一起是环钯环“外部”苯环的一部分；-氮原子A4与环钯环“外部”的两个乙基连接；-原子A3是另一碳原子，其与环钯环“外部”的两个氢原子连接；-钯，即原子A5，与双二苯基膦-二茂铁连接，其中R1至R12是氢原子；-示意图6的点部分表明了与钯一起形成环钯环的原子。
作为对所述例子的补充，所述的环钯化合物与1，1’-双二苯基膦-二茂铁配体一起在某一情况下可以产生如下所示的复合结构。
根据本发明获得大量的环钯化合物，特别是来源于用(dmpa)表示的有机化合物N，N-二甲基-1-苯乙胺(三乙胺)的对映异构体R(+)和S(-)的化合物，其在其结构中含有配位的配体1，1’-双二苯基膦-二茂铁。这些化合物作为用来治疗许多疾病的药物具有许多优点。
这是因为所述的化合物具有抑制酶和蛋白质的能力，该酶和蛋白质包括属于半胱氨酸蛋白酶(组织蛋白酶B)和丝氨酸肽酶(脯氨酰基寡肽酶)家族的酶和蛋白质以及血管紧张素转化酶(ACE)和组织蛋白酶D。环钯复合体形式的这些酶和蛋白质的抑制剂以前没有描述，虽然该复合物是用已知的方法合成，但是含有双二苯基膦-二茂铁配体的这种化合物是全新的。
本发明的所述化合物对酶或蛋白质的作用路径主要以可逆的形式发生，尤其是对酶底物复合体。这种可逆性意味着给药时的低毒性和不良副作用的减少，而不会影响其药物效果。
所述环钯复合体对大量酶都表现出抑制效果，如属于组织蛋白酶B、脯氨酰基寡肽酶家族、组织蛋白酶D和血管紧张素转化酶(ACE)的酶，因而这些化合物具有免疫调节属性。抑制和免疫调节效果使待研究的环钯化合物具有抗转移、抗血管生成的属性并参与细胞的凋亡，从而使它们成为药物，特别是治疗与这些蛋白有关的疾病，更特别地是治疗实体或腹水恶性肿瘤(血液和淋巴系统)的药物。
对甲状腺癌至今还没有特别的化学治疗药物，本发明的环钯化合物是对抗甲状腺癌、成神经细胞瘤的药物。这主要是因为环钯化合物与免疫系统间的干扰，导致抑制组织蛋白酶D和保护骨髓细胞的能力丧失。这些性质使本发明所述的化合物具有免疫学保护作用以对抗放射疗法治疗中产生的不需要的次级效果。
附图的简要说明图1显示了所述环钯化合物对组织蛋白酶B的活性的影响；图2A和2B分别显示了CD光谱/与DNA分子相互作用；图3显示了在未接受治疗测试动物中的Walker’s肿瘤(10天)；图4显示了没有肿瘤痕迹(Walker’s肿瘤)的接受治疗的测试动物(10天)；图5显示了具有Walker’s肿瘤(10天)的测试动物，其中右边的没有接受治疗(12g肿瘤块)，左边的接受了局部治疗(2g肿瘤块)；图6显示了具有Ehrlich腹水瘤的动物的寿命，其中该动物用1mg/kg化合物[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl]或[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)(N3)2]连续治疗4天。用肿瘤细胞(1×106细胞/ml)接种该动物，并在所述步骤后72小时开始用所研究的化合物治疗(p＜0.05Kaplan-Meier，Cox-Mantel)；图7显示了粘附在长时间培养物上清中的细胞数目，该培养物加入1mg/kg的环钯化合物[Pd(C2N-(S-dmpa)(dppf)Cl]。除去非粘附细胞并每周计数(P＜0.05 ANOVA，Tukey)；图8显示了粒细胞/巨噬细胞(CFU-GM)的造血细胞前体的数量，其从来自正常动物的骨髓细胞的长时间培养物的上清中获得，该动物用1mg/kg的环钯化合物[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl)]处理。每周除去非粘附细胞，测定CFU-GM的数量(P＜0.05 ANOVA，Tukey)；
图9显示了来自正常动物的骨髓细胞的长时间培养物的粘附细胞的数量，该动物每周用1mg/kg的环钯化合物[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl)]处理。在培养的最后(第9周)除去粘附细胞(P＜0.05-Wilcoxon)；图10显示了HL60细胞的细胞寿命延长百分率，其用不同环钯化合物培养72小时；图11显示了K-562细胞的细胞寿命延长百分率，其用不同环钯化合物培养72小时；图12显示了HL60细胞的形态，其与环钯化合物[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl)]一起培养72小时。有可能可以清楚地观察到凋亡细胞，如核片断和形成固缩核(picnotic nuclei)(着色Harry’shematoxyline-400×放大率)；图13显示了所述环钯化合物的细胞毒性作用；图14显示了10uM环钯化合物的体内抗肿瘤活性；图15显示了30uM环钯化合物的体内抗肿瘤活性；图16显示了药品1的化合物类似物的体内抗肿瘤活性，其如今含有功能炔作为环状金属。
对半胱氨酸蛋白酶的抑制效果组织蛋白酶B半胱氨酸蛋白酶包括在其活性位点具有巯基(-SH)的酶家族，它们够通过活性位点中的特定半胱氨酸和组氨酸间的协同交互反应而以已知的方式切断酰胺键(美国专利No.5,880,149)。在具有四个或多个超级家族的细菌、病毒、真核微生物、植物和动物中能发现这些蛋白。本发明所述的环钯化合物对组织蛋白酶B的抑制作用被首先指出是这些化合物显示出抗肿瘤活性的主要原因。但是，本发明化合物的活性并不限于这种半胱氨酸蛋白酶，他们作为药物的用途也不限于对抗癌症。
本说明书所描述的环钯化合物是下列半胱氨酸蛋白酶的活性抑制剂组织蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基-肽酶-I)，白介素转化酶(ICE)，由钙激活的中性蛋白酶，钙蛋白酶I和II，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽链内切酶、腺病毒肽链内切酶和口疮病毒(aphthovirus)肽链内切酶，和寄生虫生命周期所必须的蛋白酶，如来自变形虫、阿米巴、盘尾丝虫、利什曼原虫、线虫、网柄菌、Therilerium、血吸虫和锥虫种(克氏锥虫，这些酶也称作cruzain或cruzipain)的蛋白酶。Rawlings等(J.Biochem.290205-218，1993)和Sajid M.等(Molecular and Biochem.Parasitology，120(1)1-21，2002)给出了这些化合物可以抑制的所有半胱氨酸蛋白酶。
因此，环钯化合物作为药物的用途涉及很大的范围。具体来说，其作为抑制剂对组织蛋白酶B、L、S、Cruzaine和白介素-1β转化酶发挥作用。这些酶是溶酶体蛋白酶，与组织退化所导致的许多疾病过程有关。这些疾病包括关节炎、肌肉萎缩、肿瘤入侵、肾小球肾炎(glomeronephritis)、寄生虫造成的骨质感染、牙周疾病和肿瘤转移等。
JBC中公开的Schotte等的工作(VOL.276，N°24，Issue of June15，pp.21153-21157，2001)证实了组织蛋白酶B抑制剂在转录水平防止白介素-1α、白介素-1β和肿瘤坏死因子的产生。由于基因表达，其也与核因子κB(NF-κB)的转录激活潜能的抑制有关。因此，对组织蛋白酶B和NF-κB表现出抑制活性的环钯化合物形成治疗大量炎性疾病如支气管炎、关节炎、风湿、骨质疏松、急性胰腺炎和癌扩散的药物。
对丝氨酸肽酶的抑制效果脯氨酰基-寡肽酶脯氨酰基-寡肽酶组成了一个属于丝氨酸肽酶集团的酶家族，其不能水解30个以上残基的肽。这组酶包括二肽基-肽酶IV、酰氨酰基-肽酶和寡肽酶B及原型(prototype)脯氨酰基-寡肽酶。最近测试脯氨酰基-寡肽酶(80kDa)的晶体结构表明该酶具有一个肽酶决定基和折叠的α/β水解酶，其催化三元体由一具有不常见的含有七个侧页(blade)的β折叠结构的中间通道组成，该通道即作为大肽过滤器的决定基。这个家族的酶抑制剂是研制新药的重要来源，因为脯氨酰基-寡肽酶与大量的失调如健忘症，调节忧郁症和血压有关，并作为重要的分子伴侣发挥跨内质网膜和线粒体膜转运蛋白的作用(Sharova，E.I.；Russian Joumal of Plant Physiology，49(2)，255，2002)。
二肽基-肽酶IV与糖尿病有关，寡肽酶-B与锥虫病有关(PolgarL.，Cellular and Molecular Life Sciences，59(2)，349-62，2002and Folop，V.等，Cell，94(2)，161-70，1998)。另外，在Psychoneuroendocrinology，26(1)，17-26，2001中Maes，M.等证实了该酶与食物性失调、暴食症和厌食症有关。脯氨酰基-寡肽酶(PEP)和二肽基-肽酶IV(DPP IV)在酒精中毒中的活性也得到证实，对于生产细胞因子和细胞因子受体如白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(INFN-γ)、IL-1拮抗剂受体(IL-1RA)、IL-10和粒细胞-巨噬细胞克隆(GM-CSF)的生长刺激因子，PEP和DPPIV浓度的降低使这些因子的产量增加(Maes，M.等，Alcohol，17(1)，1-6，1999)。这些酶在人体中的高活性还与心理压力有关，参照Maes，M.和其同伴的Psychoneuroendocrinology，23(5)，485-495，1998。
DPP IV，也称作CD26、EC 3.4.14.5，是糖蛋白受体，具有多种特征，包括细胞粘附、通过细胞外基质的细胞转运子和在T细胞激活过程中的潜在的共刺激因子。由于它是肽链外切酶，因此其是调节激素肽的代谢的关键。其中，这些酶的选择性抑制已经用于治疗II型糖尿病，在其中该酶参与复杂的调控循环，如Hildebrandt与其同伴在Clinical Science，99(2)，93-104，2000中的描述。
一回顾性工作表明了DPP IV的属性和其抑制剂的药物潜能(Augustyns，K.；Bal，G.；Thonus，G.；Belyaev，A.等，Current MedicinalChemistry，6(4)，311-327，1999)，证明了其作为白细胞CD26的抗原的特征和其对新底物胰高血糖素化学因子的作用。该工作还讨论了其抑制剂对抗HIV病毒(AIDS)感染的药物学潜能和它们与免疫系统的相互关系。
在另一方面，Joyeau和其同伴证明了特定的脯氨酰基-寡肽酶Tc80是克氏锥虫代谢所必需的，其抑制剂是对抗查格斯氏病(Chagasdisease)的潜在药物(European Journal of Medicinal Chemistry，35(2)，257-266，2000)。
寡肽酶B是在革兰氏阴性细菌和锥体虫中发现的丝氨酸肽酶新家族中的一员(Juhasz，T.；Szeltner，Z.；Renner，V.；Polgar，L.，Biochemistry，4(12)，4096-4106，2002)。布鲁氏锥虫含有丝氨酸寡肽酶(OP-TB)，在非洲锥体虫(Tripanosoma africana)感染期间由宿主释放到血液中(Morty，R.E.；Lonsdale-Eccles，J.D.；Morehead，J.等，Journal of Biological Chemistry，274(37)，26149-156，1999)。
中性肽酶也具有血管紧张素II的调节属性(Maric，C.；Walther，T.，FASEB JOURNAL，16(4)，A93，Part 1，2002)，此类酶日益明显地表现出所描述的ACE的性质及其与免疫调节的关系。(Inguimbert，N.等；Journal of Medicinal Chemistry，45(7)，1477，2002)。
组织蛋白酶D组织蛋白酶D是酸性肽链内切酶，其是乳癌的先兆因子(Kraimps，J.L.，Metaye，T.，Millet，C.，Margerit，D.，Ingrand，P.，Goujon，J.M.，Levillain，P.，Babin，P.，Begon，F.，Barbier，J.，Surgery1995 Dec.，118(6)1036-40)，在骨髓癌和甲状腺肿瘤中高浓度表达(Holm，R.，Hoie，J.，Kaalhus，O.，Nesland，J.M.，Virchows Arch1995；427(3)289-94)。组织蛋白酶D位于肿瘤和正常细胞中，分别地，其在癌细胞、腺瘤和严重的甲状腺疾病中比在正常细胞中具有更高的活性(Metaye，T.，Kraimps，J.L.，Goujon，J.M.，Fernandez，B.，Quellard，N.，Ingrand，P.，Barbier，J.，Begon，F.，J.Clin.Endocrinol.Metab.1997 Oct；82(10)3383-8)。组织蛋白酶B和L在皮肤癌(黑素瘤和神经瘤)中活性很高，组织蛋白酶D仅在黑素瘤中高水平表达，相反，组织蛋白酶H与损伤的侵入潜能有关(Frohlich，E.，Schlagenhauff，B.，Mohrle，M.，Weber，E.，Klessen，C.，Rassner，G.，Cancer，2001Mar 1；91(5)972-82)。组织蛋白酶D、nm23、EGFR和LR(通过免疫组织化学方法检测)是阴性瘤乳癌转移扩散距离的潜在标记，其中前三个酶的结合是更有把握的方法(Niu，Y.，Fu，X.，Lv，A.，Fan，Y.，Wang，Y.，Int J.Cancer，2002Apr 10；98(5)754-60)。免疫组织化学表明癌细胞表达的组织蛋白酶D与胃和肠肿瘤侵入的深度相关联(Ikeguchi，M.，Fukuda，K.，Oka，S.，Yamaguchi，K.，Hisamitsu，K.，Tsujitani，S.，Sakatani，T.，Ueda，T.，Kaibara，N.，Oncology 2001；61(1)71-8)。根据免疫组织化学分析，在食道癌细胞中组织蛋白酶D的表达与蛋白p53的表达相关联。在发声食道(sound gullet)细胞中检测不到组织蛋白酶D。很明显，组织蛋白酶D的高度表达与所述肿瘤的侵入性生长有关系(Ikeguchi，M.，Sakatani，T.，Ueta，T.，Fukuda，K.，Oka，S.，Hisamitsu，K.，Yamaguchi，K.，Tsujitani，S.，Kaibara，N.，J.Clin.Pathol.2002Feb；55(2)121-6)。通过人组织蛋白酶D的表达载体在乳癌中的转移对大鼠进行检测表明，组织蛋白酶D与肿瘤的转移过程直接相关。该酶的抑制剂，其中含有待研究的环钯化合物，直接影响肿瘤转移的减少和抑制(Marcel Garcia，Nadine Platet，Emmanuelle Liaudet，Volerie Laurent，Danielle Derocq，Jean-Paul Brouille，HenriRochefort，Stem Cells 1996；14642-650)。
本发明的钯化合物是组织蛋白酶D的有效抑制剂，在剂量1-10ug时还是甲状腺肿瘤的有效抑制剂。对这些肿瘤的三个细胞系WRO、NPA、ARO进行研究，结果表明本说明书所描述的化合物可以用于制备抗肿瘤的药物，所述肿瘤在实践中不能通过化学治疗药物治疗。该环钯化合物的免疫调节作用、抑制进入细胞分裂(S期)的幼骨髓细胞的作用使这些可能的药物化合物可以用来联合治疗甲状腺肿瘤，包括放射治疗及抑制不需要的副作用，如白血病。
已经证实用酶抑制剂抑制溶酶体蛋白酶导致神经母细胞瘤细胞死亡(Castino，R.，Pace，D.，Demoz，M.，Gargiulo，M.，Ariatta，C.，Raiteri，E.，Isidoro，C.，Int J.Cancer 2002 Feb 20；97(6)775-9)。在这一方面，本发明的环钯化合物对于治疗这种癌症提供了一个选择，主要是在儿童中，在其中，该化合物是非常有效的，不存在使用已知化合物所产生的问题。
对金属蛋白酶的抑制效果血管紧张素转化酶(ACE)
血管紧张素转化酶是金属蛋白酶组的一部分，在其一个位点中含有锌，与血管紧张素I向血管紧张素II的转化有关。该酶有两个决定基，命名为决定基C和决定基N，即其有两个活性中心。血管紧张素II诱导造血系统(HPC)中的祖细胞增生，而血管紧张素I抑制该增生。另外，乙酰基-N-Ser-Asp-Lys-Pro(AcSDKP)肽也是该ECA酶的底物，其是造血系统母细胞增生的调节子。
在文献中我们能找到大量的有关这些底物(血管紧张素I、血管紧张素II和肽AcSDKP)在调节免疫系统方面的效果和路径的报道，如下文所述 Chisi等(Inhibitory Action of the PeptideAcSDKP...，Stem Cells 1997；15455-460)描述了组合使用AcSDKP与合适的ACE抑制剂来体外调节造血细胞增生。在巯甲脯氨酸(Captopryl)，一种有效的ACE抑制剂存在的情况下，所述肽AcDSKP的作用明显抑制了该幼细胞的循环，其对该酶的活性位点N产生了作用。
在另一文章中，Chisi(Captopryl Inhibits TheProliferation of Hematopoietic Stem and progenitorCells...，Stem Cells 1999；17339-344)也揭露了用ACE抑制剂治疗高血压可能会导致全血细胞减少(pancitopeny)，但该原因仍不清楚。研究表明巯甲脯氨酸对骨髓细胞并不具有毒性，但其减少S阶段巨噬细胞的比例。这些结果表明巯甲脯氨酸导致骨髓抑制(mielosuppression)。
Azizi等(Angiotensin I-converting Enzyme...，Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.2001 Dec；28(12)1066-9)描述了AcSDKP在体外被ACE水解，其是该酶活性位点的N末端的优选底物，但也是天然肽，该肽在体内被ACE活性位点的N末端水解。于是，ACE能通过永久地降解在S阶段细胞中循环的天然抑制剂而调节造血。该次瞵酸肽(phosphinic peptide)RXP407(ACE的N决定基的体外选择性抑制剂)并不影响血压调节。
Aidoudi和其同伴(The Tetrapeptide AcSDKPReduces...，Int.J.Hematol.1998 Aug；68(2)145-55)测试了在用低剂量的胞核嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)处理过的鼠中CFU-MK和CFU-GM祖细胞中的AcSDKP保护作用，包括体内和体外。这表明了在开始用Ara-C处理之前给药AcSDKP，第一次注射Ara-C之后6到8天之间，CFU-GM、CFU-MK和MK成熟细胞数量出现明显增加。结果表明在Ara-C处理期间AcSDKP对祖细胞具有保护作用。
Rousseau-Plasse(Lisinopryl，an angiotensinI-converting Enzyme Inhibitor...Exp.Hematol.1998 Oct；26(11)1074-9)报道了向人口服给药ACE抑制剂增加了血浆中的AcSDKP浓度。通过放射对lisinopryl在鼠造血细胞S阶段的增生阶段的体内效果进行研究，放射后1小时用lisinopryl给药。由于AcSDKP的内源血浆水平升高，因此100％的ACE鼠血浆活性受到抑制。
Li等(Production and Consumption Of theTetrapeptide AcSDKP...，Exp.Hematol.1997 Feb；25(2)140-6)利用长期骨髓培养(LTMC)分析了在AcSDKP代谢中人细胞微环境的作用。获得的结果表明巨噬细胞在上清中合成并释放AcSDKP；基质细胞的该肽遭ACE降解和细胞外基质和LTMC的成分起到储存该肽的作用。
在检测本发明的化合物在长效液态培养系统中的效果(延长体外暴露时间)，即检测该化合物对负责维持幼骨髓细胞(干细胞)的骨髓基质(由成纤维细胞、脂信号细胞和内皮细胞等形成)形成的效果时，发现与对照相比较，延长对这些化合物的暴露时间，特别是含有配位配体1，1’-双二苯基膦-二茂铁的化合物，如通式A和B所示，的暴露时间，会明显增加骨髓基质的粘附细胞。另一方面，发现在液体培养基上清中非粘附细胞数目的减少，且从这些培养基上清中获得的细胞克隆(CRU-GM)数目减少。使用抑制血管紧张素转化酶(ACE)的药物，如巯甲脯氨酸观察到这种反应标准。上述这些研究表明这种药物抑制ACE，并增加四肽AcSDKP(ACE的底物)的浓度，该AcSDKP由骨髓基质细胞产生并抑制骨髓中的全能细胞进入细胞循环。这个事实是特别有利的，因为化学治疗性药物在细胞循环的S阶段(DNA合成)发生显著作用，其不仅作用于恶性细胞，而且还作用于来自迅速更新组织，如骨髓的细胞。所述环钯化合物所产生的该短暂的细胞循环中断与骨髓细胞的更高保护相关联，从而对抗常规化学治疗的髓毒性作用。
本发明的所述化合物是免疫调节子，因为骨髓细胞增生(粒细胞和巨噬细胞)的可逆性减少与噬菌细胞的活性降低和巨噬细胞释放的白介素-1减少及相应的淋巴细胞刺激的减少有关，另外，所述的刺激还参与自体免疫疾病的进程，因此，本发明所述的化合物可以用作免疫抑制剂。
途径本发明中化合物的作用途径主要以可逆方式发生，因此具有低细胞毒性且不良副作用减少。
不考虑与之相关的理论方面，酶的抑制途径可以用包含[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)]X型二齿dppf配体的离子化环钯复合物为例进行解释。首先，二膦连接中的磷原子与离子Pd(II)间的配位键发生断裂，同时与溶剂分子DMSO配位生成复合物[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)(DMSO)]X。同样地包含DMSO的复合物(或其他配位溶剂，如二甲基甲酰胺、嘧啶、THF及其他)还可以通过[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)X]分子型的环钯复合物形成，其中溶液中的X-离子迁移到金属配位层的外面。对于含有[Pd2(C2，N-dmpa)2(dppf)2X2]型桥式dpf连接的环钯复合物，该复合物[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)(DMSO)]X很可能是由于环钯复合物在DMSO溶液中缺乏稳定性而在DMSO/水的混合溶液中发生部分降解形成的。该复合物在DMSO中溶解数分钟后生成Pd(0)使此事实进一步清晰化。[Pd2(C2，N-dmpa)2(μ-dppf)2(N3)2]的硝基甲烷溶液在加入若干滴DMSO后，其在25℃的摩尔电导率从9.3S.cm2增加到60S.cm2。
接下来，通过断开配位键N-Pd并与新的DMSO分子配位，所述复合物[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)(DMSO)]X可能会生成复合物[Pd(C2-dmpa)(dppf)(DMSO)2]X。溶液中最终生成的该有机金属分子最有可能是酶作用的抑制剂。
鉴于游离的dppf配体和由其它类型的二膦配体形成的其他复合物均不能抑制酶活性的事实，我们可以得出结论酶活抑制现象极大地依赖于dppf二膦配体以及钯复合物的化学结构。在此方式中，我们认为溶液中产生的有机金属抑制剂，即复合物[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)(DMSO)]X，与四面体中间复合物之间达到动态平衡，该中间复合体由巯基咪唑离子对与底物聚合形成。此反应的发生需要该复合物中存在的两个金属中心(Pd、Fe)的参与。在此模型中，高密度的带负电荷的酰基基团与离子Pd(II)相互作用，同时取代DMSO分子并与半胱氨酸中高度活化的硫原子配位。另一方面，该硫原子与dppf配体中的铁原子相互作用。溶液中各物质之间的平衡产生可逆抑制途径。
本发明涉及作为蛋白质活性抑制，特别是酶抑制剂的环钯化合物，该化合物含有双二苯基膦-二茂铁连接或其它由相同的磷基团作为供体原子的类似连接。这些化合物通过对相关酶产生作用以及插入DNA分子而调节免疫系统。
在特定的具体实施方案中，本发明涉及的化合物可抑制属于丝氨酸肽酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶以及肽链内切酶家族的酶的活性。
在本发明的其它具体实施方案中，由本发明所揭露的化合物抑制的半胱氨酸蛋白酶是组织蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基肽酶-I)，白介素转化酶(ICE)，钙激活的中性蛋白酶，钙蛋白酶(Calpaine)I和II，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽链内切酶，腺病毒肽链内切酶和口疮病毒肽链内切酶，以及寄生虫生命周期中必需的蛋白酶，如来自变形虫、阿米巴虫、盘尾丝虫、利什曼原虫、线虫、网柄菌、Therilerium、血吸虫和锥虫(T.cruzi，该酶也被称为cruzaine或cruzipain)种中的蛋白酶。
在本发明更特定的具体实施方案中，本发明的化合物抑制的半胱氨酸蛋白酶为组织蛋白酶B，Cruzipain和白介素-1β转化酶。
在更特定的具体实施方案中，本发明的化合物抑制的丝氨酸肽酶包括二肽基肽酶IV，酰氨酰基(acylaminacyl)肽酶，寡肽酶B和脯氨酰基-寡肽酶。
在本发明更特定的具体实施方案中，本发明的化合物抑制的金属蛋白酶是血管紧张素转化酶(ACE)。四类基质金属蛋白酶(MMP)，即胶原酶，基质裂解素(Stromelisines)，膜型(membrane-type)金属蛋白酶和Genatinases可以由本发明中的化合物抑制。因此，本发明中的化合物可有效地治疗引起髓鞘(mieline)退化的中枢神经系统炎症，包括多发性硬化症以及自身免疫性脑脊髓炎(Cuzner，M.L.，Opdenakker，G；Journal of Neuroimmunology；94，1-14，1999)。
在另一特定的具体实施方案中，本发明的化合物抑制的肽链内切酶是组织蛋白酶D。脑啡肽酶(Encephalinase)或肽链内切酶24.11同样受到所述化合物的抑制。因此，所述化合物可用于与心房利钠因子(ANF)降解有关的心脏疾病。Varin，J.，Duboc，D.，Weber，S.，Fouchard，J.，Schwartz，J.C.，Muffatjoly，M.，Guerin，F；ArchivesDes Maladies Du Coeur Et Des Vaisseaux；84，1465-1471，1991。
在特定的具体实施方案中，可采用本发明中的化合物治疗的疾病包括由于组织退化造成的疾病如关节炎、肌肉萎缩、肿瘤入侵、肾小球肾炎(glomerulonephrithis)、寄生虫造成的骨质感染、parasitomies、牙周病和肿瘤转移及其他；心房利钠因子的降解有关的心脏疾病；炎性疾病如支气管炎、风湿性关节炎、骨质疏松症、急性胰腺炎和癌扩散；失调如健忘症，抑郁症和血压的调控；糖尿病，锥虫病，查格斯氏病，食物性失调，暴食症和厌食症；酒精中毒，与细胞因子和细胞因子受体如白介素-6(IL-6)、肿瘤死亡因子α(TNF-α)、干扰素-γ(INFN-γ)、IL-1拮抗剂受体(IL-1RA)、IL-10和粒细胞-巨噬细胞克隆的生长促进因子(GM-CSF)的产生有关的疾病相关的疾病，心理紧张，对抗HIV病毒(AIDS)引起的感染；引起髓鞘(mieline)退化的中枢神经系统炎性疾病，包括多发性硬化症以及自身免疫性脑脊髓炎(Encephalomielitis)。除了参与与免疫系统调节有关的ACE抑制外，本发明的化合物还调节造血系统母细胞的增殖并显著抑制幼细胞周期，缺乏骨髓抑制的高血压。本发明所公开的环钯化合物的作用可抑制肿瘤的入侵性生长，比如乳房，骨髓，腺瘤，甲状腺，黑素瘤，胃，肠，食道以及甲状腺肿瘤。在甲状腺癌的治疗中，当与放射性治疗同时运用时，环钯化合物可抑制不良副作用，比如白血病。环钯化合物也可用于对抗成神经细胞瘤。所述环钯化合物在恶性肿瘤的治疗中体现出抗血管生长和抗肿瘤转移的性质。
通过对酶作用和参予插入DNA分子，这些化合物调节免疫系统，因此不仅可以组成有效的主要用以对抗恶性肿瘤的抗肿瘤制剂，也可以作为其他组织退化相关疾病，炎症过程引起的疾病和/或由病毒、细菌或寄生虫引起的疾病，自身免疫性疾病，糖尿病，健忘症，神经和食物性紊乱，压力过大，酒精中毒和高血压以及其他疾病治疗中的活性成分。除了作为免疫调节剂和免疫抑制剂具有高度有效性外，本发明药品可在低浓度下发挥作用，细胞毒性低，且在癌症特定病例的治疗中呈现抗血管生长和抗肿瘤转移的性质。
合成本发明的钯复合物含有叠氮基团(N3-)，合成复合物以在红外区构成一个“光谱探针”，用以对复合物的离子或分子特征，其单核或二核性质进行更准确的结构描述。该基团在2040-2060CM-1区间(非对称性伸展)和1400-1500CM-1区间(对称性伸展)IV内具有正常的振动模式，，从而实现所述属性。尽管此类化合物作为抗肿瘤剂和酶抑制剂具有生物效果，但由于它们呈现出的不良细胞毒性和副作用，影响细胞呼吸周期，因此此类化合物不用作药品的最合适化合物。对于所有合成的含有叠氮基团的复合物，所获的含氯离子(Cl-)的类似物不呈现所述的次级效应，可组成具有同等活性的药物。
上述化合物的合成在常温下进行，所用试剂为从商业供应商处购买的高纯度试剂，不需要进一步纯化。元素分析在IQ-USP-SP-Brazil分析中心完成。FT-IR光谱用Perkin-Elmer Spectrum-One分光光度计在4000-400cm-1范围内测定用片状KBr样品获取。1H和31P{1H}NMR谱由多核光谱仪Bruker Avance DPX-300分别于300和81MHz处获取。质子NMR数据以ppm标记，采用0.00ppm的TMS作为参照。31P{1H}的化学置换以H3PO4为参照测量。所有的NMR测量在溶剂CDCl3中进行。复合物摩尔电导率以硝基甲烷为溶剂，用电导仪Metrohmmod.712测量。实施例1中说明了起始复合物。本发明的特定具体实施方案可在起始复合物的制备和进一步的实施例中得到说明。
用二膦配体制备复合物从实施例1中描述的起始复合物出发，根据本发明的特定具体实施方案，通过与1，1’-双二苯基膦-二茂铁(dPPf)进行反应，可合成大量的环钯复合物。生成的产物决定于所用的化学计量比以及溶剂。分离得到的分子和离子复合物含有1或2个金属中心，并含有单齿或二齿的与钯离子(II)配位的二膦配体。
一般流程含有[Pd(C2，N-dmpa)(L)]X(L＝二齿配体)型螯合的二膦配体的离子化合物通过起始环钯复合物与二膦连接(L-L)反应合成。二膦连接与相应的钯复合物之间的摩尔比为2∶1。因此，将0.2mmol的环钯化合物二聚体部分溶解于锥形瓶中的50ml丙酮中。随后，将0.4mmol(L-L)加入所得到的悬浮液中。在室温下持续摇晃混合溶液1小时。终溶液的溶剂在近干燥压力下蒸发，加入正己烷使生成的固体沉淀析出。该固体随即用乙醚洗涤，在真空中干燥。
含有[Pd(C2，N-dmpa)(L)X](L＝单齿配体)型的二膦单齿配体的分子化合物以二氯甲烷为溶剂，用类似流程合成。
含有[Pd2(C2，N-dmpa)2(μ-L)X2](L＝桥式二膦连接子)型的桥式二膦连接的二核环钯复合物的合成以二氯甲烷为溶剂，二膦连接子和相应的钯复合物的摩尔比为1∶1。本发明的所述优选具体实施方案在实施例2至4中予以说明。
化合物和酶的相互作用组织蛋白酶B和木瓜蛋白酶由Calbiochem Co.公司提供，酶活浓度用半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64通过滴定(titulation)来测定。组织蛋白酶B和木瓜蛋白酶于4℃保存于含有10μM的MMTS的50mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)中。荧光底物氨甲基香豆基Z-PHE-ARG-MCA，Tripsin和不可逆木瓜蛋白酶抑制剂E-64由Sigma公司提供。
有机金属化合物对肽链内切酶组织蛋白酶B活性的影响运用荧光底物Z-Phe-Arg-MCA，由荧光分光光度计测定。此肽为组织蛋白酶B的优选底物，Kcat/Ks＝4.5×105M-1.s-1，其中的苯丙氨酸和精氨酸分别落在P2和P1位。该底物覆盖了与木瓜蛋白酶类似半胱氨酸蛋白酶的主要连接位点S2，S1和S1’(Turk，D.et al，Revised definition ofsubstrate binding sites of papain-like cysteine proteases，J.Biol.Chem.；1998，379，137-147)。
荧光信号的强度由可控温的荧光分光光度计Hitachi F-2000检测。校准激发波长为380nm，发射波长为440nm。将酶置于含有200mMNaCl，1mM EDTA和2mM DTT的50mM磷酸钠缓冲液中(pH6.4)中，于37℃放置5分钟活化。测量在组织蛋白酶B的相同活化缓冲液中进行，动力学标准通过在不同浓度有机金属化合物存在或不存在的情况下，测量不同浓度的底物的起始水解速率来确立。其结果采用软件GraFit 3.01进行非线性回归分析(Erithacus Software Ltd.)。
图解1的动力学模型描述了肝磷脂对组织蛋白酶B水解Z-Phe-Arg-MCA的影响。
图解1 其中，S代表底物Z-Phe-Arg-MCA；I代表环化金属化合物；E代表组织蛋白酶B；Ks代表底物的解离常数；KI代表有机金属的表观解离常数；α是Ks的干扰系数(disturbance standard)；β是Vmax(Kcat)的干扰系数，这些干扰系数与下列等式中的一致
v=Vmax.[S]Ks(1+[I]KI)(1+β.[I]α.KI)+[S](1+[I]α.KI)(1+β.[I]α.KI)]]>动力学研究针对环钯复合物[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)N3]进行。如图1A所示，在组织蛋白酶B的动力学测试中有机金属的存在导致Z-Phe-Arg-MCA水解Kcat值减小。另一方面，图1B显示化合物同时显著提高了组织蛋白酶B和底物Z-Phe-Arg-MCA的亲和力。该有机金属对肽链内切酶组织蛋白酶B的作用可描述为如图解1所示的抑制标准的一混合性双曲线。该底物水解系统的效率可通过改变Ks(参数α)或Vmax(参数β)而改变。数据根据等式1进行非线性回归处理，计算常数值。结果显示[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)]N3与组织蛋白酶B(E)结合，其解离常数KH＝12±1μM，该化合物与酶-底物复合物(ES)结合，其解离常数为αKH＝2.4±0.3μM。该复合物还诱导组织蛋白酶B和底物Z-Phe-Arg-MCA的亲和力提高了5.3倍；在有机金属化合物存在的情况下，Ks值从110±15降低到21±2μM，α＝0.19±0.02(图1B)，同时Kcat值在存在[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)]N3的情况下也降低了5.6倍，β＝0.18±0.02。该环钯化合物降低产物形成常数至36(β＝0.18±0.02)，同时以相同比例提高组织蛋白酶B与底物Z-Phe-Arg-MCA的亲和力(a＝0.19±0.02)，即a＝β。尽管有机金属复合物强有力地抑制了组织蛋白酶B(81％抑制率)，但它的存在并不改变酶对底物的催化效率，β/α＝1.1±0.1。二级底物的水解效率在[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)]N3存在或不存在的情况下不变，Kcat/Ks＝4.5×105M-1.S-1。
从属于木瓜蛋白酶超级家族的组织蛋白酶B和其它半胱氨酸蛋白酶有着高度保守的折叠结构(Turk，V.；Bode，W.，Lysosomal cysteineProteinases and their inhibitors cystatins.Innovations inProteases and their Inhibitors.Aviles，F.X.(编)，Walter deGruyter & Co.，Berlin，Germany，1993)。这些酶与肽链底物相连通过巯基咪唑离子对实现其蛋白质水解活性。半胱氨酸残基和组氨酸之间的关联保证了对半胱氨酸活性位点处的高度亲核性(Michaud，S；Gour，B.J.，Cathepsin B inhibitors as potential anti-metastaticagents.Exp.Opin.Patents.，1998，8，645-672)。底物酰氨连接断裂的同时形成酰基酶中间体。在形成米氏非共价复合物后，活性位点的巯基攻击肽链生成氧化阴离子，该离子在所谓的由谷氨酰胺残基形成的“氧化阴离子通道”中稳定。该四面体中间体的解体生成酰基酶，释放出产物。随后，酰基酶水解生成催化离子对，释放出新的产物，即羧酸。实施例5以本发明化合物的方式显示了酶活抑制分析。
这些结果证实了有关本发明化合物的作用的声明，特别是在酶-底物复合物中的可逆作用。
化合物和DNA的相互作用(插入)
通过运用圆二色性技术进行研究(图2)表明环钯化合物引起DNA分子的结构变化，该变化具有时间和药物浓度依赖性。这表明这些变化与细胞凋亡和细胞周期调控过程有关。
抗肿瘤效应本发明中的化合物在体内模型中进行了测试，采用大鼠作为实验动物，用Walker-256乳房肿瘤，即″Walker’s肿瘤″作为实体的、入侵的、转移性的肿瘤的模型，对这些模型上述化合物显示出了很强的活性。实施例6和图3、4和5显示了实验及所获得的结果。
我们注意到化合物除了抑制肿瘤生长外，在90％的病例中成功地逆转了肿瘤的生长。对上述Walker’s肿瘤，在体内模型中，上述化合物体现出对肿瘤细胞的选择性细胞毒性，而在将药物施加到正常组织上时未出现任何慢性炎症信号。该化合物的另一个重要作用是其在细胞培养中对内皮细胞增殖的抑制效应，说明其重要的抗血管生长的作用。该化合物在体内模型中还显示了对组织蛋白酶B和组织蛋白酶D强大的抑制作用，使其成为有效的抗转移试剂，避免了肿瘤在骨骼肌中的转移。
值得强调的是，在所有的动物治疗试验中均未发现任何副作用，这显示了药物高度专一性。以下的图3，4和5显示了所获得的一部分实验结果。
对免疫系统的效果
Ehrlich’s腹水性肿瘤(Ehrlich’s Ascitic Tumor)(EAT)为了观察本发明的化合物对接受治疗的动物可能产生的保护作用，对于接受或未接受治疗的患有Ehrlich’s腹水性肿瘤的动物，绘制寿命曲线。
运用Kaplan-Meier寿命曲线对存活率进行分析。组间对比(肿瘤患者vs.肿瘤患者/接受治疗)通过Log-Rank法-非常系数程序(non-parametrical procedures)(Cox-Mantel)进行。用ANOVA偏差分析对各组进行分析。差异明显时，采用Tukey’s测试。对于两组样品数目较少的情况，采用Wilcoxon’s非常系数测试。
实施例7和图6所示的测试显示用本发明的化合物进行动物治疗可延长患有Ehrlich’s腹水性肿瘤的动物寿命，这表明这类药可以干扰肿瘤的升级。
毒性小鼠骨髓造血细胞前体(CFU-C)的克隆培养按照示意图C(一般结构)及在实施例8中说明的流程，在对动物骨髓粒细胞和巨噬细胞的造血前体(CFU-GM)连续4天用以1∶2的结构含有1，1’-双二苯基膦-二茂铁配体的环钯化合物治疗后，对其数目进行测定，1mg/kg的剂量被证实没有骨髓毒性。因为和对照组比较，接受治疗的动物的骨髓粒细胞和巨噬细胞的造血前体(CFU-GM)的数量没有显示出显著的差异，因而证明该剂量对骨髓没有毒性。相同的剂量在体外试验中得到了相似的结果(将所述化合物和正常动物细胞一起培育)。另一方面，当剂量高于5mg/L时，导致剂量依赖性CFU-GM的数量减少，这表明化合物对骨髓效应是剂量依赖的。
在长效液体培养系统中骨髓基质的形成按照示意图C(一般结构)以及可以用来评估化合物在骨髓基质形成中的效果的实施例9所示的程序，在长效液体培养系统中检测以1∶2的结构含有1，1’-双二苯基膦-二茂铁配体的环钯化合物的效果，我们证实了延长细胞暴露于化合物的时间可以同时减少液体培养基上清液中的非粘附细胞的数量(图7)和从这些培养的上清液中可以获得的细胞克隆数(图8)。另一方面，和对照相比，在环钯产物存在的情况下，骨髓基质中的粘附细胞的数量有了显著的增加(图9)。此反应标准在使用抑制血管紧张缩素转化酶(ECA)的药物，如巯甲脯氨酸时也可观察到，该药物抑制骨髓全能细胞(干细胞)进入细胞周期。因此，暂时性地中断细胞周期可能与更好地保护骨髓细胞免受化疗产生的骨髓毒性作用有关系。
考虑到示意图C(一般结构)的以1∶2的结构含有1，1’-双二苯基膦-二茂铁配体的环钯化合物是一个ECA的抑制剂，以及考虑到在长效液体培养系统中的骨髓基质的形成的相关结果，比如粘附细胞的增加与母细胞克隆CFU-GM的减少的有关联，这表明药物即使在低浓度(1mg/kg)下仍具有抑制幼骨髓细胞进入细胞周期的能力。
由于可逆地减少骨髓细胞(粒细胞和噬菌细胞)增殖与降低噬菌细胞活性和减少由噬菌细胞释放的白介素-1有关，进而与淋巴细胞刺激的减少有关，该淋巴刺激与自身免疫性疾病的升级有关，因而这些结果还说明本发明的化合物是免疫调节剂。因此本发明的化合物可用作免疫抑制剂。
这些结果证实的另一个方面是骨髓基质中的很多群落呈现微红的特征，意味着所述化合物对微红系列具有刺激活性，该刺激源于铁的存在，铁可以干扰细胞的新陈代谢。
急性毒性的检测通过进行固定剂量试验，本研究中使用的本发明的环钯化合物浓度得以确定。在该试验中，将待检测物质以特定剂量施予小鼠，该特定剂量是根据法规部门的分类选择的预定剂量，其最高浓度不得超过2000mg/kg。相比LD50试验，该固定剂量试验的优点在于该试验中的评估标准并不需要动物死亡，因此用于每次试验的动物的数量以及其承受的痛苦可以达到最小化(Barros & Davino，1996)。
给药之后紧接14天的观察期。在急性毒性的症状出现时，如毛发、黏膜和皮肤的变化，以及腹泻和抽搐的发生，结膜炎，骚动或动作迟缓出现时所用的剂量用来对被测材料进行分级和分类。
依照实施例10所示方案获得的结果显示，由对映异构体S(-)dmpa和配体dppf以1∶1或1∶2的比例按照结构A，B和C(一般结构)生成的环钯化合物分别在剂量增加到500和200mg/kg时仍没有急性毒性，这标志着它们的低毒潜力以及随后副作用的较低发生率。由于目前市场上可用药品的系统毒性时常在个人化疗的初始阶段致死，因此本结果特别具有意义。
对白血病株HL-60和K-562的体外细胞毒性和原癌基因BCL-2的表达细胞毒性评估采用MTT-四唑还原法进行(二苯基四唑3-(4，5-二甲噻唑-2-基-2，5-溴))，该方法可通过线粒体氧化还原系统对细胞增殖和细胞毒性进行评估。在该方法中，四唑通过活细胞还原，形成甲臢(Formazan)盐，可溶解该盐(Mosmman，1983)，以通过ELISA在560nm处读取。
根据实施例11所示的试验所得到的结果，我们用两种相似化合物所获得的结果(图10和11)证明了所述环钯化合物在两细胞株中都具有细胞毒性。结果显示这些药物为抗白血病药，因为试验所用的细胞株代表了对目前市场上提供的化学治疗性药物具有很强的耐受性的细胞。此外，其中的一个被测定的化合物，由对映异构体S(-)dmpa和配位配体dppf按照结构A(一般结构)以1∶2的比例合成的环钯化合物，在12.5μg/ml的剂量下可以减少原癌基因bcl-2在白血病细胞HL60中的表达。鉴于bcl-2的大量表达会干扰细胞程序性死亡或凋亡进而干扰细胞对化疗的反应过程，因而该结果表明该药可诱导白血病细胞凋亡。当测试细胞在接受含叠氮基的化合物治疗后其形态学方面的变化时，观察到大量细胞的死亡(玻片上有破碎的细胞膜和细胞碎片)，这表明含叠氮的化合物会干扰氧化代谢过程。这与急性毒性研究中的结果一致。另一方面，接受环钯化合物治疗的白血病细胞HL60的形态学特征如图12所示表现为细胞的程序性死亡或细胞凋亡。
黑素瘤的生物学分析在体外生物学分析中，将鼠黑素瘤细胞B16F10-Nex2与环钯化合物共同培养24小时以证实药物的细胞毒效应。体内分析在母鼠C57BI/6中进行，在其皮下植入105肿瘤细胞。在肿瘤植入后，用10μM的环钯化合物每周3次进行腹膜腔内注射治疗。
试验结果见实施例12和图13、14、15和16。
细胞培养分析甲状腺肿瘤甲状腺肿瘤细胞培养物进行分析，该细胞培养物来源于细胞株WRO、NPA和ARO。[Pd(C2，N-(S(-)dmpa)(L)X]型的分子化合物对细胞株WRO、NPA、ARO的抑制剂量(IC50)分别为0.48μg、0.59μg、0.60μg。化合物[Pd2(C2，N-(S(-)dmpa)2(μ-L)X2]呈现相似的抑制剂量(IC50)。由对映异构体R(+)dmpa合成的环钯化合物类似物得到以下的抑制剂量(IC50)细胞株WRO为5.56μg，NPA为6.04μg，ARO为7.57μg。我们同样观察到对于[Pd2(C2，N-(R(+)dmpa)2(μ-L)X2]型化合物抑制剂量没有显著变化。所获的结果清楚地显示R(+)对映异构体的抑制剂量(IC50)比S(-)对映异构体高出10倍。该事实表明，由该化合物引起的细胞毒性过程具有对映体选择依赖性，同时显示结构中含有S(-)dmpa异构体的化合物具有更高的效率。
所得结果显示这些化合物可成功地用于甲状腺肿瘤的治疗。此类肿瘤属于过量表达组织蛋白酶D且目前尚没有专一有效的化学疗法对其进行治疗的肿瘤。如果我们考虑到本发明的钯复合物如同所证明的那样可调节免疫系统，那么这些复合物对所述疾病的对抗能力甚至会更高。这意味着，除了给治疗这类肿瘤带来希望外，在此呈现的环钯化合物还可以成为放疗中的重要辅助药用以抑制许多不良副作用，如白血病，脱发和对中枢神经系统细胞的破坏。
本发明中的环钯化合物，特别是由N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)和配位配体1，1’-双二苯基膦-二茂铁(dppf)合成的R(+)和S(-)对映异体构形式的环钯化合物，其呈现出显著的抗癌潜力，特别是对白血病株和一些黑素瘤株，该化合物可以使细胞进入凋亡程序。
本发明中的化合物显示出低毒潜力和副作用的低发生率。我们证实，和绝大部分具有骨髓毒性的化学疗法相反，本发明中的化合物没有骨髓毒性迹象。结果显示这些药物对造血功能具有作用，该作用是剂量依赖性的。在低剂量下，该环钯化合物比传统的化学疗法对正常细胞产生的毒性低。
在测定此药对长效液体培养系统的效果时，得到用药物抑制血管紧张缩素转化酶(ACE)观察到的反应标准，因此产生细胞周期的暂时性干扰，于是更好地保护骨髓细胞对抗由传统化疗造成的骨髓毒性效应。
这些结果还显示出了本发明的化合物作为免疫调节剂和免疫抑制剂的活性。
在同样的测定中，我们证实了骨髓基质细胞群微红系列呈现出的特征，这表明药物对微红系列可能存在刺激活性。
剂量与配方为实现本发明的目的，所述受体是动物或人，特别是人。
本发明中的环钯化合物和含有至少一种本发明的化合物的组合物可以通过口服方式，注射方式，特别是腹膜腔注射方式，以本领域公知的药物学上可接受的剂量给药。在特定的具体实施方案中，该化合物以及含有本发明的化合物的组合物作为注射剂提供，其不会被消化系统改变。
该活性成分可以以固态剂型提供，如干粉，颗粒，片剂或胶囊，或以液态剂型提供，如糖浆或水悬浮剂。本发明的化合物的给药还可以通过但不局限于诸如口服、皮下、静脉内，鼻腔、跨皮肤、腹腔内、局部、肌肉内、肺内、阴道、直肠、眼部或舌下方式进行。在某些情况下，该化合物可以局部地应用，如通过喷雾或溶液应用。
该活性成分可以以独立的形式给药，但通常与药物载体一同给药。本发明的目标包括含有至少一种当前所揭示的环钯化合物的组合物。Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing中提供了检测药物剂型有用方法。
本发明中的化合物和基于这些化合物的组合物可以以口服剂型给药，如片剂、胶囊(每种分别包括定时释放或延迟释放配方)、丸剂、粉末、颗粒、西也剂、香精、悬浮剂、糖浆和乳剂。以同样的方式，其给药可以通过静脉内(以混合液或灌输液)、腹腔内，皮下或肌肉内进行。所有方式均采用制药领域专家所熟知的剂型。使化合物产生理想效应的有效但非毒性的剂量可用于肿瘤的避免或治疗，主要用于抵抗恶性肿瘤，与组织退化相关的疾病，由炎症过程引起的和/或源自病毒、细菌或寄生虫的疾病，自身免疫性疾病，糖尿病，健忘症，精神和食物性疾病，紧张，酒精中毒和高血压等。
本发明中的化合物的给药方案自然地根据已知因素变动，比如特定制剂的药效特征及其给药的方式和途径；物种，年龄，性别，健康状况，医疗条件以及受体体重；症状的性质和范围；正在进行的治疗的类型；治疗的频率；给药的途径；受体的一般状态以及需要达到的效果。具有常识的医生或兽医可以容易地根据预防，抵抗或延缓病情升级的需要决定药物的有效用量，并开出处方。
本发明中的化合物可以方便地进行给药，每日一次，或者每日的全药量通过每日两次、三次、四次或多次而部分地给予。在有些情况下，隔日给药是合适的，循环或非循环给药。
本发明中的化合物可以通过局部使用合适的鼻内载体的方式鼻内给药，或者通过该领域专家熟知的各种跨皮肤路径给药。当采用跨皮肤路径给药系统时，按照给药方案的给药剂量应该是连续的而不是间断性的。
对于以片剂或胶囊口服给药，例如，可以将上述药物活性成分与药物学上可接受的口服惰性载体结合，该载体如乳糖，淀粉，蔗糖，葡萄糖，甲基纤维素，硬脂酸镁，磷酸二钙，硫酸钙，甘露醇，山梨醇和类似物。对于以液态剂型口服给药，口腔药物成分可以与任何一种药物学上可接受的口服惰性载体结合，该载体比如乙醇，甘油，水及类似物。此外，如果希望或需要，合适的胶合剂，润滑剂，裂解剂和着色剂可以加入到混合物中。合适的胶合剂包括淀粉，凝胶，天然糖如葡萄糖或β-乳糖，玉米甜料，天然或合成的胶如阿拉伯树胶，黄芪胶或藻酸钠，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蜡及类似物。在这些剂型中可以使用的润滑剂包括油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，醋酸钠，氯化钠及类似物。裂解剂包括但于限于淀粉，甲基纤维素，琼脂，皂土，黄原胶及类似物。
本发明中的化合物也可以通过脂质体给药系统给药，该系统如小的单层膜囊泡，大的单层膜囊泡和多层膜囊泡。脂质体也可以由一系列磷脂组成，如胆固醇，硬脂胺或卵磷脂。
本发明中的化合物也可以与可作为药物载体的可溶性多聚体偶合。这些多聚体可以包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃(piran)共聚体，聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚，聚羟乙基天冬酰胺苯酚或棕榈酸基取代的聚乙烯氧化聚赖氨酸。此外，本发明的化合物可以与生物可降解类多聚体偶合从而实现药物的可控释放，如聚乳酸，聚葡糖酸，聚乳酸与聚葡糖酸的共聚体，聚ε-己内酯，聚羟基丁酸，聚原酸酯，聚缩醛，聚二氢吡喃(polydi-hydropirans)，聚氰基丙烯酸酯和交联的或两性分子阻断(amphypathic block)的水凝胶共聚体。
明胶胶囊可以含有粉状的活性成分和载体，比如乳糖，淀粉，纤维素衍生物，硬脂酸镁，硬脂酸及类似物。类似的稀释液可以用于制作压片。片剂和胶囊均可制成缓释产品的形式，以实现在数小时内药物的连续释放。压片可在表面覆盖糖或薄膜以掩盖其不良味道并保护药片不受空气影响，或者可以以肠膜覆裹以实现在胃肠系统中的选择性裂解。
口服给药的液态剂型可含有着色剂和风味剂以提高受体的接受性。通常，除了DMSO或其他包括水在内的配位溶剂外，水，合适的油，盐溶液，水溶的右旋糖(葡萄糖)，糖相关溶液和二元醇，如丙二醇或聚乙二醇，磷酸盐缓冲液均是用于液态剂型，肠胃外给药溶液或腹膜腔内给药的合适载体。
特别地，用于肠胃外给药的溶液包含活性成分的水溶性盐和DMSO，或另一配位溶剂，如需要，还包含合适的稳定剂和缓冲物质。抗氧化剂，如亚硫酸氢钠，亚硫酸钠或抗坏血酸，分离或混合形式的，均是合适的稳定剂。柠檬酸和柠檬酸盐以及EDTA钠盐也用作稳定剂。此外，肠胃外溶液可含有防腐剂，如杀藻胺，甲基丙基对羟基苯甲酸酯和氯丁醇。
用于腹膜内应用的组合物特定地包含水，盐溶液和/或pH7.4的磷酸盐缓冲液和0.1到30％的DMSO，如果需要，更特定地包含重量占该组合物1到10％的稳定剂或防腐剂。
合适的药物载体在Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company中有所描述，该书为本领域内的标准参考文献，其内容在此引为参考。
活性成分的每日剂量约为0.0001到500mg/kg体重，特定地约为0.0001到100mg/kg体重，更特定地约为0.0001到30mg/kg体重。每日剂量也可以依据受药患者血药终浓度来计算，该终浓度应为0.01到200μM，特定地为0.1到50μM，更特定地为10到25μM。
用于合适组合物给药的剂型每单位可包含0.0001到250mg，更特定地为0.1到100mg活性成分。在这些药物组合物中，该活性成分的含量通常为配方总重量的0.001到99％，特定地为0.1到70％，更特定地为0.1到40％。该组合物还可包含至少一种药物学上可接受的载体。该活性成分可以以固态剂型口服给药，如胶囊，片剂或粉末，也可以采用诸如西也剂，糖浆，溶液和悬浮剂的液态剂型给药。该活性成分还可采用消毒的液态剂型肠胃外或腹膜内给药。
本发明的优选药物剂型是用于注射给药，特别是腹膜内给药的液态组合物。合适的用于肠胃外注射给药的组合物可用如下方法制备，如将质量百分比为1.5％的活性成分在含有体积百分比为10％ DMSO的pH 7.4磷酸盐缓冲液中摇匀。该溶液采用惯常方法消毒。
本发明的复合产物剂型可以是片剂，其中的一种活性成分用肠膜覆盖，于是用肠膜覆盖的成分和其他活性成分就不会混合在一起，然后压制成片剂或类似物。因此，用肠膜覆盖的成分压在一个片剂层中，而其它活性成分压在另一片剂层中。可选择性地，为了进一步分离这两层，可加入一层或多层隔离层(placebo)，使隔离层存在于活性物质层之间。此外，本发明中的药物剂型可以以胶囊的形式存在，其中一种活性成分压成片剂或许多微小片剂，颗粒，丸剂或非球状颗粒，然后用肠膜覆盖。这些用肠膜覆盖的微小片剂，颗粒，丸剂或非球状颗粒和其他活性成分颗粒一起被装入或压入胶囊中。
在以单一剂型或独立剂型同时给药或同时同一方式给药时，为了尽可能减少本发明的复合产物各组分之间的接触，根据本说明书，本领域的专业人员可以清楚容易地决定各种剂型。
定义“造血系统”指与血细胞形成相关的系统。
“免疫系统”指由白细胞形成的生物体的防御细胞系统，其通过产生抗体直接或间接地帮助生物体抵抗陌生化学或生物源。
“蛋白质抑制剂”指能够抑制蛋白质行使其生物学功能的制剂，通常通过对蛋白质活性位点的二级或三级结构的破坏实现抑制作用。
“选择性抑制剂”指在大量分子(如蛋白质)中只抑制特定分子和/或拥有相似活性位点的特定家族的抑制剂。
“幼细胞周期”指在细胞快速生长如组织培养中发生的循环结构和生化过程。该循环可分为Go期，间歇期1(G1)，合成期(S)，间歇期2(G2)和有丝分裂期(M)。当其产生如粒细胞系列的幼细胞，骨髓单核细胞时，该周期被称为幼细胞周期。
“骨髓抑制(Myelosuppression)”指对髓细胞，即粒细胞系列的幼细胞的生成的抑制，通常发生在骨髓中，而不发生在循环血液中(某些疾病除外)。
“骨髓毒性”指制剂能够对骨髓细胞产生毒性作用。
“自身免疫性疾病”指各种由于生物体免疫系统的防御细胞不能识别自身的生物体组成器官和/或组织的正常细胞而引起的各种疾病。
“免疫抑制剂”指各种能够引起免疫抑制的制剂，即阻止或干扰免疫应答的进程；其可以是缺乏免疫应答(耐受)的结果，可以由化学，生物或物理制剂人工诱导或由疾病引起。
“免疫调节剂”指在免疫系统细胞应答细胞环境状况变化时能引起其功能和形态波动的各种试剂。
″螯合的二膦配体″指各种含有两个磷原子的有机连接，磷原子带有自由电子对，通过提供配位键和同一金属中心连接。
“DNA插入”指化学分子在形成DNA分子双螺旋的碱基对间的插入。
“类似连接”指所有的同构连接，即具有相似的空间结构。本发明中指以化学元素周期表第V族的任何元素替代磷原子与1，1’-双二苯基膦-二茂铁的环戊二烯环连接，该元素可以是N，As，Sb或Bi。
“受体血液总量”指接受药物的生物体循环血液的总体积。就人体而言，该体积在6到8升范围间变动。
本领域的普通技术人员能够理解，根据以上指导，可以对本发明进行大量的改进和变化。因此应该清楚，在所附权利要求书的范围之内，本发明除了本说明书所作的具体描述外还可以通过其他途径实施。
以下仅提供了本发明的特定具体实施方案的解释性实施例，这些实施例对所附权利要求书范围不产生任何限定。
实施例1起始复合物的制备2；dmpa＝依据Ryabov等(Reaction paths inthe cyclopalladated NN-dialkylbenzylamine-substituted styrenesystem in acetic acid as solvent.The structure of palladated2-dialkylaminomethylstilbenes.J.Chem.Soc.，Perkin Trans；1983，2，1503-1509)和(Enantioselective cleavage of activatedamino acid esters promoted by chiralpalladacycles.Inorg.Chim.Acta；1988，280，57-61)制备的N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)的R(+)和S(-)对映异构体。百分比分析(calcd.C20H28N2Cl2Pd2)a)R(+)C，40.4(40.6)；H，4.8(4.7)；N，4.8(4.4)。b)S(-)C，40.4(40.9)；H，4.8(4.2)；N，4.8(4.3)。2-这些化合物通过离子交换反应用[Pd(C2，N-dmpa)μ-Cl]2的R(+)和S(-)对映异构二聚体制备。在含有[Pd(C2，N-dmpa)μ-Cl]2(1.740g，3.0mmol)的THF(100mL)溶液中加入含有NaN3(0.390g，6.00mmol)的甲醇(20mL)。所获的黄色固体经过过滤，用乙醚洗涤之后在真空中干燥。从甲苯中重结晶获得微晶体产物(95％R(+)；87％S(-))。百分比分析(Calcd.C20H28N8Pd2)a)R(+)C，40.6(40.2)；H，4.7(4.4)；N，18.9(18.3).IRvasN32066cm-1，vsimN31447cm-1；B)S(-)C，40.6(41.1)；H，4.7(4.5)；N，18.9(18.4).IRvasN32058cm-1，vsimN31443cm-1。
实施例2含有PD(C2，N-DMPA)(L)]X(X＝Cl，N3，L＝二齿配体)型螯合二膦配体的离子化合物说明这些化合物有时用文字描述为PdR(+)或S(-)dmpa dppf 1:2(带有N3或Cl)。
(2a)[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)]N3百分比分析(calcd.)C，60.9(62.1)；H，4.8(5.0)，N，6.1(6.6)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，d，1.55)；-N(CH3)2(3H，s，2.16)；Cp(5H，m，3.99)Cp(5H，m，4.25)-CH*-CH3(2H，q，3.99)；H-芳香环35)。31P{1H}-NMR(ppm)2个信号23.0，32.1.ΛM＝44.5S.cm2.mol-1。Cl(相同)。
(2b)[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)N3百分比分析(calcd.)C，61.9(62.1)；H，5.5(5.0)，N，5.9(6.6)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，D，1.55)；-N(CH3)2(3H，S，2.16)；Cp(5H，M，4.21)Cp(5H，M，4.49)-CH*-CH3(2H，q，3.97)；H-芳香环(24，m，7.25-7.32。31P{1H)-NMR(ppm)2个信号23.0，32.1.ΛM＝51.1S.cm2.mol-1。Cl(相同)。
实施例3含有[PD(C2，N-DMPA)(L)]X(X＝Cl，N3，L＝二齿配体)型螯合二膦配体的分子化合物说明这些化合物有时以文字描述为PdR(+)或S(-)dmpa dppf 1:2(带有N3或Cl)。
(3a)[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)N3]百分比分析(calcd.)C，61.3(62.1)；H，4.9(5.0)，N，6.1(6.6)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，D，1.55)；-N(CH3)2(3H，S，2.16)；Cp(5H，Q，3.99)Cp(5H，t，4.25)-CH*-CH3(2H，Q，3.77)；H-芳香环(24，m，7.25-7.32。31P{1H}-NMR(ppm)2个信号31.9；-16.0.ΛM＝15.5S.cm2.mol-1。(相同)。
(3b)[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)N3]百分比分析(calcd.)C，61.9(62.1)；H，4.5(5.0)，N，5.9(6.6)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，D，1.55)；-N(CH3)2(3H，S，2.16)；Cp(5H，Q，3.99)Cp(5H，t，4.25)-CH*-CH3(2H，Q，3.77)；H-芳香环(24，m，7.25-7.32。31P{1H}-NMR(ppm)2个信号31.9；-16.0.ΛM＝15.5S.cm2.mol-1。(相同)。
实施例4含有[Pd2(C2，N-DMPA)2(μ-L)X2](X＝Cl，N3，L＝二齿配体)型螯合二膦配体的分子化合物说明这些化合物有时以文字描述为PdR(+)或S(-)dmpa dppf 1:1(带有N3或Cl)。
(4a)[Pd2(C2，N-S-dmpa)2(μ-dppf)Cl2]百分比分析(calcd.)C，56.7(57.1)；H，5.2(5.0)，N，2.4(2.5)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，d，2.60)；-CH-CH3*(6H，d，2.90)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.61)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.63)；P(CH2)2-P(4H，m，2.57-2.85)；Cp(2H，sr-br，4.23)，Cp(2H，sr-br，4.57)，Cp(3H，m，4.96)，Cp(3H，m，5.00)，-CH*-CH3(2H，q，4.10)；H-芳香环(24，m，6.25-7.57。31P{1H}-NMR(ppm)1个信号32.7.ΛM＝9.3S.cm2.mol-1。(相同)。
(4b)[Pd2(C2，N-R+dmpa)2(μ-dppf)Cl2]百分比分析(calcd.)C，54.3(57.1)；H，4.9(5.0)，N，2.3(2.5)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，d，2.60)；-CH-CH3*(6H，d，2.90)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.61)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.63)；P(CH2)2-P(4H，m，2.57-2.85)；Cp(2H，sr-br，4.23)，Cp(2H，sr-br，4.57)，Cp(3H，m，4.96)，Cp(3H，m，5.00)，-CH*-CH3(2H，q，4.10)；H-芳香环(24，m，6.25-7.57。31P{1H}-NMR(ppm)1个信号32.7.ΛM＝2.4S.cm2.mol-1。(相同)(4c)[Pd2(C2，N-S-dmpa)2(μ-dppf)(N3)2]百分比分析(calcd.)C，55.1(55.9)；H，4.0(4.5)，N，9.5(10.0)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，D，2.70)；-CH-CH3*(6H，D，3.00)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.61)；-N(CH3)2(6H，S-BR，1.65)；P(CH2)2-P(4H，m，2.60-2.90)；Cp(2H，sr-br，4.20)，Cp(2H，sr-br，4.61)，Cp(3H，m，4.93)，Cp(3H，m，5.10)，-CH*-CH3(2H，q，4.20)；H-芳香环(24，m，6.05-7.77。31P{1H}-NMR(ppm)1个信号32.7.ΛM＝7.5S.cm2.mol-1。(相同)。
(4d)[Pd2(C2，N-R+dmpa)2(μ-dppf)(N3)2]百分比分析(calcd.)C，54.8(55.9)；H，4.1(4.5)，N，9.7(10.0)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，D，2.70)；-CH-CH3*(6H，D，3.00)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.61)；-N(CH3)2(6H，S-BR，1.65)；P(CH2)2-P(4H，m，2.60-2.90)；Cp(2H，sr-br，4.20)，Cp(2H，sr-br，4.61)，Cp(3H，m，4.93)，Cp(3H，m，5.10)，-CH*-CH3(2H，q，4.20)；H-芳香环(24，m，6.05-7.77。31P{1H}-NMR(ppm)1个信号32.7.ΛM＝4.4S.cm2.mol-1。(相同)实施例5对丝氨酸肽酶，金属蛋白酶家族的酶抑制分析我们以下包括了用具有A，B和C结构的复合物进行的分析。这些钯复合物由通过N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)的R(+)和S(-)异构体形成的环金属环和配位配体1’-双二苯基膦-二茂铁(dppf)组成。酶抑制常数通过经典方法，荧光光谱测定法和间接计算获得。在分析中，根据分析需要采用1ml的酶溶液，其中含有已知质量为2-5ng的酶。计算所得的酶抑制常数值陈列如下丝氨酸肽酶脯氨酰基寡肽酶(POP)及两种变体(一为Cys255，β螺旋第四片的突变体以及功能性突变体Tyr473Phe)。对于POP，缓冲液采用Tris/HCl 20mM，pH7.5。标准底物是Abz-GFSPFRQ-EDDnp(Km 0.38μM)。
(5a)带有dmpa R(+)异构体的复合物(以1∶1的结构)1/Kiapp＝0.0977//Kiapp＝10.24ng//Ki＝4.51ng，突变体Cys255The。1/Kiapp＝0.1234//Kiapp＝8.10ng//Ki＝3.57ng，突变体Try473Phe。
(5b)带有dmpa R(+)异构体的复合物(以2∶1的结构)1/Kiapp＝8.7242//Kiapp＝0.1146ng//Ki＝34.01pg，突变体Cys255The。1/Kiapp＝14.1677//Kiapp＝0.0706ng//Ki＝20.94pg，突变体Tyr473Phe。
(5c)带有dmpa S(-)异构体得到的复合物(以1∶1的结构)1/Kiapp＝6.9164//Kiapp＝0.1496ng//Ki＝42.90pg，突变体Cys255The。1/K，APP＝9.891411app＝0.1011ng//Ki＝30pg，突变体Tyr473Phe。
(5d)带有dmpa S(-)异构体得到的复合物(以2∶1的结构)1/Kiapp＝180.3018HKLAPP＝0.004982ng//Ki＝1.65pg，突变体Cys255The。1/Kiapp＝4.4990//Kiapp＝0.2223ng//Ki＝65.96pg，突变体Tyr473Phe。
金属蛋白酶ACE(血管紧张缩素转化酶)-使用浓度0.1-1.0nM。缓冲液采用0.1M，pH8.0磷酸钠缓冲液+200mM NaCl。标准底物为Abz-YRK(Dnp)-P-OH(Km7.0μM)。
(5e)带有dmpa R(+)异构体的复合物(以1∶1的结构)1Kiapp＝18.7138//Kiapp＝0.05344ng//Ki＝22.27pg。
(5f)带有dmpa R(+)异构体的复合物(以2∶1的结构)1/Kiapp＝1.1578//Kiapp＝0.8637ng//Ki＝0.36ng。
(5g)带有dmpa S(-)异构体的复合物(以1∶1的结构)1/Kiapp＝2.0989//Kiapp＝0.4764ng//Ki＝198.51pg。
(5h)带有dmpa S(-)异构体的复合物(以2∶1的结构)1/Kiapp＝3.3136//Kiapp＝0.3018ng//Ki＝112.28pg。
肽链内切酶CATD(组织蛋白酶D)-使用浓度0.05-0.5nM.缓冲液采用0.1mM，pH4.0柠檬酸缓冲液。标准底物为Abz-AIAFFSRQ-EDDnp(Km0.17μM)。
(5i)带有dmpa S(-)异构体的复合物(以1∶1的结构)1/Kiapp＝3.3136//Kiapp＝0.3018ng//Ki＝122.98pg。
(5j)带有dmpa S(-)异构体的复合物(以2∶1的结构)1/Kiapp＝3.5696//Kiapp＝0.2801ng//KI＝104.22pg。
实施例6抗肿瘤分析-Walker’s肿瘤进行抗肿瘤活性分析时，将化合物分别稀释在水溶液，盐溶液和pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，所有溶液中均含有1％二甲基亚砜(DMSO)。分析中使用等量的所述化合物，以使得试验动物血液总体积(约30ml)中的活体药物浓度达到15μM，该浓度对于动力学步骤非常有利。
试验包括将本发明中的钯化合物在腹膜内，皮下和在肿瘤移植部位直接使用以及通过肿瘤细胞进行的肿瘤移植。
据观察，在90％病例中，肿瘤生长得到逆转(试验动物总计60只)。皮下接种106个癌细胞12天后试验动物体内生长出质量为4.0(+/-)1.0g的实体瘤。通过给药，肿瘤的质量降低到0.3(+/-)0.1g。除了抑制肿瘤生长，在85％的病例中，化合物逆转了先前存在的肿瘤。对于上述的Walker’s肿瘤，化合物在体内模型中显示了对该肿瘤细胞的选择性细胞毒性，而在对正常组织给药后没有任何慢性炎症症状。在这些分析中，连续10天按15μM/大鼠×天的剂量通过注射给药。另一个重要作用是其在细胞培养中表现出了对内皮细胞增殖的抑制效应，显示重要的抗血管生长作用。化合物在体内模型中也显示出巨大的对组织蛋白酶B和组织蛋白酶D的抑制活性，使其成为抗肿瘤转移的有效试剂，避免肿瘤在骨骼肌中的转移。
在对所有试验动物的所有治疗中没有观察到任何副作用，这显示了药物具有极高的专一性。以下图3、4和5显示了所得结果。
实施例7为了培育Ehrlich’s腹水性肿瘤，用0.1ml含有106个取自患病小鼠的腹膜内的癌细胞悬浮液对小鼠进行腹膜内接种。在从Ehrlich肿瘤患病小鼠的腹膜中取出腹水液后，细胞的数目和活力在Neubauer盘中用锥虫蓝(Trypan blue)染液确定。
为了观察化合物[Pd2(C2，N-S-dmpa)2(μ-dppf)Cl2]e[Pd2(C2，N-S-dmpa)2(μ-dppf)(N3)2](根据示意图C的一般结构)对接受治疗动物的保护作用，绘制寿命延长曲线。含有12只动物的三个试验组如下Ehrlich’s腹水性肿瘤的患病动物；连续接受四次环钯化合物(1mg/kg)皮下给药的肿瘤患病动物。
试验进行如下Ehrlich肿瘤细胞从患病动物的腹膜腔内取出，然后稀释(1∶100)在锥虫蓝溶液确定细胞活力。将细胞在盐溶液中的浓度调至1×106细胞/动物。此后，用0.2ml该溶液(包含1×106个细胞)接种被研究动物。肿瘤接种72小时后开始环钯化合物的治疗并持续4天。每天观察动物以控制死亡率。
在体内分析中，剂量为1mg/kg的化合物[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl]和[Pd2(C2，N-S-dmpa)2(μ-dppf)(N3)2]均延长了Ehrlich腹水性肿瘤患病动物的寿命，标志这些药能够干扰肿瘤的升级(图6)。
实施例8小鼠骨髓细胞造血前体(CFU-C)的克隆培养为了对克隆生成(clogenical)细胞的计数，关键要确保培养基中存在的所有全能细胞得到诱导而增殖和调节培养条件，以避免在Petri盘中不会含有过多数量的细胞群落而之后发生重叠，从而使每一个群落能够得到识别。同样重要的是使用最高浓度以上的生长刺激因子(GSF)。我们将使用针对粒细胞和巨噬细胞的重组造血生长因子-GM-CSF。此外，由于发现当前市场上供应的不同批次和品牌的胎(phoetal)小牛血清的活性存在差异，对胎小牛血清的选择应该慎重。
将正常小鼠或连续接受4天用由dmpa和配体dppf以1∶2的比例(按照图解A和B-一般结构)合成的环钯化合物进行皮下治疗的小鼠通过断颈法处死，小鼠皮肤用碘酒清洁。将小鼠大腿骨暴露，去除末端孔部软骨，将骨头从其上方关节处切断。骨髓在针头和注射器的帮助下被转移至含有培养基或平衡盐溶液的试管中。悬浮液中的细胞数在将细胞以1∶10稀释于10％的曙红中后在血细胞计数皿中计数。随后，制备更多的琼脂培养基(bacto-agar，Difco)，其中包含30％的2倍浓缩的IMDM培养基(Sigma)，20％ phoetal小牛血清和50％琼脂(0.6％)。此后，将适量体积的细胞加入到37℃的该更多琼脂培养基中。将细胞重悬，以1.0ml的体积分配到每个已经含有合适的刺激因子的Petri盘中。在体外分析中，加入系列浓度的由dmpa和配体dppf以1∶2的比例(按照示意图A和B-一般结构)合成的环钯化合物。培养物在Petri盘表面分布形成胶状。在37℃，含有5％CO2的空气中连续培养7天后，细胞群落在40×放大的解剖显微镜下计数(Metcalf，1984)。
实施例9对通过长效骨髓细胞液体培养过程形成的骨髓基质的评估本培养完全依赖于由骨髓基质细胞衍生出的粘附细胞层的形成。粘附细胞层的形成的发生依赖于造血生长因子的合成和分泌，该因子负责基质细胞胞外基质的形成。因此，更多的非成熟细胞保留在粘附细胞层内并释放到培养基中以保持造血功能。因此，在外源性造血生长因子存在的情况下，在进行克隆培养之后，对液体培养基中的母细胞数目进行定量。(Spoonceretal，1993)在用断颈法处死动物(约8只)后，暴露大腿骨，骨头于上方关节处切开。骨髓和骨髓基质细胞在针头和注射器的帮助下转移至含有补充了2mmI-谷氨酰胺，20％马血清(cult-lab)和10-2M氢化可的松的rpmi-1640(Sigma)培养基的试管中。将细胞及培养基分配到培养瓶(t25)中(每瓶10ml培养基及细胞)。随后，将该培养瓶在含有5％CO2的空气的湿培养箱中培养。15天后，由于骨髓基质已经开始群集，将从8只小鼠骨髓中衍生出的新一代细胞加入到培养瓶中诱导母细胞的增殖。在培养瓶中传代15天后，我们进行克隆培养(cfu-c)，目的在于计算从体外培养骨髓基质衍生出的粘附细胞所生成的造血前体的数目。为了确定非粘附细胞和母细胞的数目，每周移除50％的饱和培养基并加入新鲜培养基，该新鲜培养基已含有1mg/l的由dmpa和配体dppf以1∶2的比例(按照示意图A和B-一般结构)合成的环钯化合物。
由长效液体培养基中获得的母细胞生成的造血前体(CFU-C)的克隆培养从长效液体培养基中获得非粘附细胞后，将细胞用培养基RPMI1640(Sigma)清洗并重悬至终浓度为2×105细胞/ml。随后这些细胞按照之前说明的克隆培养方法(CFU-C)进行培养。
实施例10急性毒性评估将待分析化合物稀释于含有10％DMSO的盐溶液中，然后将0.2ml该盐溶液以腹膜内方式施予动物。因此，每10只动物(5公5母)组成的组接受不同剂量的化合物的治疗。对照动物接受只含有10％DMSO的盐溶液。治疗结束之后，动物持续观察14天。
表1环钯化合物的急性毒性评估。动物通过腹膜内方式接受一剂下述化合物并在此过程之后观察14天。
含有叠氮的化合物在10mg/kg的剂量下具有毒性及10％的致死率，表明该药具有更高的副作用率。
实施例11白血病株HL-60和K-562的体外细胞毒性和原癌基因BCL-2的表达细胞株HL-60和K-562的细胞保存于补充了2mML-谷氨酰胺和20％phoetal小牛血清的培养基RPMI-1640(Sigma)中，细胞此前被清洗(三次)并重悬于RPMI培养基。随后，它们与九种浓度的被研究化合物(160、80、40、20、10、5、2.5、1.25和0.65μg/ml)共同培养于96孔培养板(1×106细胞/孔)中。之后它们在湿培养箱中培养72小时(含5％CO2的空气)。在此之后，加入MTT溶液(5mg/ml)(Sigma)，培养板继续培养4小时。随后，加入MTT稳定液(0.04N异丙酸(isopropylicacid))，30分钟后，于560nm处重复3次读取ELISA值(Mosmann，1983)。在所研究的化合物存在的情况下细胞的存活百分比如下计算活细胞％＝每孔吸收值(给药)×100/对照吸收值(未给药)实施例12黑素瘤的生物学分析体外分析体外分析用来证实环钯化合物对鼠黑素瘤细胞B16F10-Nex2的细胞毒性效应。细胞在不同化合物浓度下培养24小时。细胞活力由MTT分析法确定。如图13所示，观察到1.25uM含有乙烷二膦(药物1，2和3)的药物具有100％有效率。相同的效率在含有双二苯基膦-二茂铁的药物中也被观察到，但是在更高浓度下，10μM(药6)以及含有官能炔的环钯化合物(药10)，大约20μM。图13显示了所述的细胞毒效应，与未给药细胞对照组相比其细胞存活百分比的降低以直方图表示。
体内分析体内分析在母性小鼠C57BI/6上进行。105肿瘤细胞通过皮下植入。植入后4天，动物开始接受治疗。一组接受10μM，另一组接受30μM如下最有效的药物药物1，2，3，6和10腹膜腔内给药，一周3次，在这段时期，肿瘤体积被定量。当肿瘤体积达到3000mm3时，动物被处死。在下图中，(A)中注射药物的动物和对照动物的死亡曲线，(B)，每组患肿瘤动物肿瘤的体积。
图14中，给药浓度为10μM时，从A中观察到接受药物1，3，6和10的动物寿命延长了10天。在B中，我们注意到，在所有的药物中，药物1和6对于肿瘤的发展具有高出其他药物60％的抑制效应。
在图15中，给药浓度为30μM时，所有药物均使接受治疗的动物寿命延长了7天，同时接受药物6治疗的动物组死亡数更低。在图B中，我们可看出药物1最有效地抑制肿瘤发展。药物6，18天时表现处显著的抑制效应，但是该效应在23天后出现逆转。
含有官能炔的药物按照同样的方法进行了体外测试(图16)，在100μM时显示出100％的细胞毒效应。该效应在下图中呈现，同时显示，其中药物11和14在大约1μM时显示出40到50％的显著抑制活性。
结果分析提供了一些重要的化学结构和药物活性之间的关联。1.25μM的含有乙烷二膦(药物1，2和3)的药物被观察到100％的有效率。同样的效率在含有官能炔的环钯化合物没有发生，该化合物需要20μM。在所有被测药物中，我们注意到药物1和6具有高于其他药物60％的抑制肿瘤发展的效应。我们可以看到药物1是最有效的抑制肿瘤发展的药物，而接受药物6治疗的试验动物体现出更少的死亡数。对于包含关官能炔的复合物，药物11和14呈现出显著的抑制效应，在大约1μM时有40-50％的抑制效应。
应该承认，本说明书对本发明的说明以及所述实施例能够使本领域的普通技术人员实施本发明，包括在不超出所附的权利书所要求保护的范围的情况下上运用本领域的常识进行修改。
权利要求
1.环钯化合物或其药物学上可接受的盐或络合物，该化合物是有机金属化合物，其含有钯、δC-PD键和配位键Y→Pd，形成具有如下结构的有机环 其中-X代表选自下列的元素卤素(Cl、F、Br、I)；拟卤素(N3、NCO、NCS、SCN)；或乙酸根(H3C-COO-)；和-Y代表选自元素周期表V或VI族的元素，如N、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Te；-C代表sp2或sp3杂化的碳原子，其与钯原子共价连接，含有C、Y和D的所示的环可以由三到八个原子组成。-C和Y之间，用曲线表示，具有连续的原子形成环钯的环，由三到八个原子组成，包括钯原子；典型地，非限制性地所述原子选自碳、氮、氧或硫；另一方面，构成该环的每一个原子与其它原子或基团相连，形成该环的可变外部结构，线状或环状，本申请人对此不作特别限制；-L代表配位配体，其是来源于元素周期表V组(N、P、As、Sb、Bi)的供体原子，位于双二苯基膦-二茂铁化合物中，具体如下示意图2所示，所示存在的L-L表明在所述的双二苯基膦-二茂铁化合物中存在两个连接子L，而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12分别代表了下列基团，可以以任何顺序出现氢(H)、烷基、芳基、二烯基、烷氧基、硅氧基、羟基(OH)、氨基(-NH2)、亚胺基、卤素(F、Cl、Br、I)、亚氨基、硝基(-NO2)。示意图2
2.环钯化合物或其药物学上可接受的盐或络合物，该化合物是有机金属化合物，其含有钯、δC-PD键和配位键Y→Pd，形成具有如下结构的有机环 其中-X代表选自下列的元素卤素(Cl、F、Br、I)；拟卤素(N3、NCO、NCS、SCN)；或乙酸根(H3C-COO-)；和-Y代表选自元素周期表V或VI族的元素，如N、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Te；-C代表sp2或sp3杂化的碳原子，其与钯原子共价连接，含有C、Y和D的所示的环可以由三到八个原子组成。-C和Y之间，用曲线表示，具有连续的原子形成环钯的环，由三到八个原子组成，包括钯原子；典型地，非限制性地所述原子选自碳、氮、氧或硫；另一方面，构成该环的每一个原子与其它原子或基团相连，形成该环的可变外部结构，线状或环状，本申请人对此不作特别限制；-L代表配位配体，其是来源于元素周期表V组(N、P、As、Sb、Bi)的供体原子，位于双二苯基膦-二茂铁化合物中，具体如下示意图2所示，所示存在的L-L表明在所述的双二苯基膦-二茂铁化合物中存在两个连接子L，而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12分别代表了下列基团，可以以任何顺序出现氢(H)、烷基、芳基、二烯基、烷氧基、硅氧基、羟基(OH)、氨基(-NH2)、亚胺基、卤素(F、Cl、Br、I)、亚氨基、硝基(-NO2)。示意图2
3.环钯化合物或其药物学上可接受的盐或络合物，该化合物是有机金属化合物，其含有钯、δC-PD键和配位键Y→Pd，形成具有如下结构的有机环 其中-X代表选自下列的元素卤素(Cl、F、Br、I)；拟卤素(N3、NCO、NCS、SCN)；或乙酸根(H3C-COO-)；和-Y代表选自元素周期表V或VI族的元素，如N、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Te；-C代表sp2或sp3杂化的碳原子，其与钯原子共价连接，含有C、Y和D的所示的环可以由三到八个原子组成。-C和Y之间，用曲线表示，具有连续的原子形成环钯的环，由三到八个原子组成，包括钯原子；典型地，非限制性地所述原子选自碳、氮、氧或硫；另一方面，构成该环的每一个原子与其它原子或基团相连，形成该环的可变外部结构，线状或环状，本申请人对此不作特别限制；-L代表配位配体，其是来源于元素周期表V组(N、P、As、Sb、Bi)的供体原子，位于双二苯基膦-二茂铁化合物中，具体如下示意图2所示，所示存在的L-L表明在所述的双二苯基膦-二茂铁化合物中存在两个连接子L，而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12分别代表了下列基团，可以以任何顺序出现氢(H)、烷基、芳基、二烯基、烷氧基、硅氧基、羟基(OH)、氨基(-NH2)、亚胺基、卤素(F、Cl、Br、I)、亚氨基、硝基(-NO2)。示意图2
4.如权利要求1-3任一项所述的环钯化合物或其药物学上可接受的盐或络合物，该化合物选自N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)和N，N-二甲基-苄胺衍生物，炔，即嘧啶基-苯基-乙炔或1-苯基-3-N，N二甲胺-丙炔。
5.如权利要求4所述的环钯化合物，该化合物是N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)。
6.如权利要求1-5任一项所述的化合物，该化合物抑制与失调或疾病有关的蛋白的活性。
7.如权利要求6所述的化合物，其中所述的蛋白是酶。
8.如权利要求7所述的化合物，其中所述的酶包括来自半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸肽酶和金属蛋白酶家族的酶。
9.如权利要求8所述的化合物，其中所述的半胱氨酸蛋白酶包括组织蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基-肽酶-I)，白介素转化酶(ICE)，由钙激活的中性蛋白酶，钙蛋白酶I和II，肽链内切酶，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽链内切酶、腺病毒肽链内切酶和口疮病毒肽链内切酶，和寄生虫生命周期所必需的蛋白酶，如来自变形虫、阿米巴虫、盘尾丝虫、利什曼原虫、线虫、网柄菌、Therilerium、血吸虫和锥虫种的蛋白酶。
10.如权利要求9所述的化合物，其中所述的酶是组织蛋白酶B、Cruzaine和白介素-1β转化酶。
11.如权利要求8所述的化合物，其中丝氨酸肽酶包括二肽基-肽酶IV、酰氨酰基-肽酶和寡肽酶B、脯氨酰基-寡肽酶和组织蛋白酶D。
12.如权利要求11所述的化合物，其中所述的酶是组织蛋白酶D。
13.如权利要求8所述的化合物，其中金属蛋白酶包括血管紧张素转化酶、胶原酶、基质裂解素、膜型金属蛋白酶和genatinases。
14.如权利要求1-3任一项所述的化合物，该化合物可以治疗与蛋白质和酶有关的失调与疾病。
15.如权利要求14所述的化合物，其中所述疾病包括由组织退化所导致的疾病如关节炎、肌肉萎缩、肿瘤入侵、肾小球肾炎(glomeronephritis)、寄生虫造成的骨质感染、parasitomies、牙周疾病和肿瘤转移；与心房利钠因子的降解有关的心脏疾病；炎性疾病如支气管炎、风湿性关节炎、骨质疏松症、急性胰腺炎和癌扩散；失调如健忘症、抑郁症和血压的调控；糖尿病，锥虫病，查格斯氏病，食物性失调，暴食症和厌食症；酒精中毒，与细胞因子和细胞因子受体如白介素-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(INFN-γ)、IL-1拮抗剂受体(IL-1RA)、IL-10和粒细胞-巨噬细胞克隆(GM-CSF)的生长刺激因子的产生有关的疾病；心理紧张，对抗由HIV病毒(AIDS)引起的感染；引起髓鞘(mieline)退化的中枢神经系统炎性疾病，包括多发性硬化症和自体免疫性脑脊髓炎；癌肿瘤，自体免疫性疾病，肿瘤包括乳房、骨髓、腺瘤、甲状腺、黑素瘤、胃、肠、食道和甲状腺肿瘤和成神经细胞瘤。
16.如权利要求15所要求保护的化合物，其中所述的疾病是腹水和实体肿瘤，特别地是乳房、骨髓、腺瘤、甲状腺、胃、肠、食道、甲状腺肿瘤和成神经细胞瘤。
17.如权利要求1-6任一项所述的化合物，该化合物抑制幼骨髓细胞进入细胞分裂(S期)。
18.如权利要求1-6任一项所述的化合物，该化合物是抗血管生成的。
19.如权利要求1-6任一项所述的化合物，该化合物是抗转移的。
20.如权利要求1-6任一项所述的化合物，该化合物可用于辅助放射治疗处理。
21.如权利要求1所述的化合物，该化合物与DNA发生反应。
22.如权利要求1所述的化合物，该化合物是免疫调节子。
23.含有如权利要求1-22任一项所述的化合物的至少一种和其药物学上可接受的盐和络合物的组合物。
24.如权利要求23所述的组合物，该组合物含有约占其总重量0.001-99％的所述化合物或一种其盐或络合物，和至少一种药物学上可接受的载体。
25.如权利要求23所述的组合物，该组合物含有约占其总重量0.01-70％的所述化合物或一种其盐或络合物，和至少一种药物学上可接受的载体。
26.如权利要求23所述的组合物，该组合物含有约占其总重量0.1-40％的所述化合物或一种其盐或络合物，和至少一种药物学上可接受的载体。
27.如权利要求23所述的组合物，该组合物还含有溶剂。
28.如权利要求27所述的组合物，其中所述溶剂是DMSO。
29.如权利要求23所述的组合物，该组合物呈现为固体剂量的形式，如胶囊、片剂或粉末，或液体剂量的形式，如西也剂、糖浆、乳剂、溶液、悬液、混合物和灌输剂。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述的制剂是预定或延迟释放的。
31.如权利要求29所述的组合物，其中它们给药的方式包括口服、皮下、静脉内、鼻内、跨皮肤、腹膜内、局部、肌肉内、肺内、阴道、直肠、眼内或舌下的方式、系统来提供脂质体。
32.如权利要求31所述的组合物，其中它们给药的方式是注射，具体地是腹膜内注射。
33.如权利要求32所述的组合物，该组合物特定地包括水、盐溶液和/或pH7.4的磷酸盐缓冲液和0.1-30％的DMSO，更特定地，如果需要，该组合物含有占其重量1-10％的稳定剂或防腐剂。
34.如权利要求23所述的组合物，该组合物包括约0.0001-250mg，更特定地约0.1-100mg至少一种如权利要求1-22所述化合物或一种其药学上接受的盐或络合物。
35.如权利要求23所述的组合物，该组合物抑制与紊乱或疾病有关的蛋白质的活性。
36.如权利要求35所述的组合物，其中所述的蛋白质是酶。
37.如权利要求36所述的组合物，其中所述的酶包括来自半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶家族的酶。
38.如权利要求37所述的组合物，其中所述的半胱氨酸蛋白酶包括组织蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基-肽酶-I)，白介素转化酶(ICE)，由钙激活的中性蛋白酶，钙蛋白酶I和II，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽链内切酶、腺病毒肽链内切酶和口疮病毒肽链内切酶，和寄生虫生命周期所必须的蛋白酶，如来自变形虫、阿米巴、盘尾丝虫、利什曼原虫、线虫、网柄菌、Therilerium、血吸虫和锥虫种的蛋白酶。
39.如权利要求38所述的组合物，其中所述的酶是组织蛋白酶B、Cruzaine和白介素-1β转化酶。
40.如权利要求37所述的组合物，其中丝氨酸肽酶包括二肽基-肽酶IV、酰氨酰基-肽酶和寡肽酶B和脯氨酰基-寡肽酶。
41.如权利要求37所述的组合物，其中所述的酶是组织蛋白酶D。
42.如权利要求37所述的组合物，其中金属蛋白酶包括血管紧张素转化酶、胶原酶、基质裂解素、膜型金属蛋白酶和genatinases。
43.如权利要求37所述的组合物，该组合物可以治疗与蛋白质和酶有关的失调与疾病。
44.如权利要求43所述的组合物，其中所述的疾病包括由组织退化所导致的疾病如关节炎、肌肉萎缩、肿瘤入侵、肾小球肾炎(glomeronephritis)、寄生虫造成的骨质感染、Parasitomies、牙周疾病和肿瘤转移；与心房利钠因子的退化有关的心脏疾病；炎性疾病如支气管炎、风湿性关节炎、骨质疏松、急性胰腺炎和癌扩散；失调如健忘症、忧郁症和血压的调控；糖尿病，锥虫病，查格斯氏病，食物性失调，暴食症和厌食症；酒精中毒，与细胞因子和细胞因子受体如白介素-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(INFN-γ)、IL-1拮抗剂受体(IL-1RA)、IL-10和粒细胞-巨噬细胞克隆(GM-CSF)的生长刺激因子的产生有关的疾病；心理紧张，对抗由HIV病毒(AIDS)引起的感染；导致髓鞘(mieline)退化的中枢神经系统炎性疾病，包括多发性硬化症和自体免疫性脑脊髓炎；癌肿瘤，自体免疫性疾病，肿瘤包括乳房、骨髓、腺瘤、甲状腺、黑素瘤、胃、肠、食道和甲状腺肿瘤和成神经细胞瘤。
45.如权利要求44所述的组合物，其中所述的疾病是腹水和实体肿瘤，特别地是乳房、骨髓、腺瘤、甲状腺、胃、肠、食道、甲状腺肿瘤和成神经细胞瘤。
46.如权利要求23-37任一项所述的组合物，该组合物抑制幼骨髓细胞进入细胞分裂(S期)。
47.如权利要求23-37任一项所述的组合物，该组合物是抗血管生成的。
48.如权利要求23-37任一项所述的组合物，该组合物是抗转移的。
49.如权利要求23-37任一项所述的组合物，该组合物可用于辅助放射治疗处理。
50.如权利要求23所述的组合物，该组合物与DNA发生反应。
51.如权利要求23所述的组合物，该组合物是免疫调节子。
52.如权利要求23-37任一项所述的组合物，该组合物含有受体的全体积血液和浓度约为0.01-200uM，更特定地0.1-50uM，更特定地10-25uM的活性试剂。
53.含有至少一种如权利要求1-22任一项所述的化合物或一种其药物学上可接受的盐或络合剂的剂量单位。
54.含有至少一种如权利要求23-52任一项所述的组合物的剂量单位。
55.如权利要求53或54所述的剂量单位，其中化合物或组合物的量足够使受体全体积血液中的活性成分的浓度约为0.01-200uM，特别地为0.1-50uM，更特别地为10-25uM。
56.如权利要求53-55任一项所述的剂量单位，该单位包括固体和液体形式。
57.如权利要求56所述的剂量单位，该单位包括剂量形式，如胶囊、片剂或粉末，或溶于西也剂、糖浆、乳剂、溶液、悬液、混合物和灌输剂。
58.如权利要求53所述的剂量单位，其中所述的制剂是预定或延迟释放的。
59.如权利要求53所述的剂量单位，该单位含有至少一覆盖层。
60.抑制与失调或疾病有关的肽的活性的方法，该方法包括用有效量的如权利要求1-22任一项所述的化合物，如权利要求23-52任一项所述的组合物或如权利要求53-59任一项所述的剂量单位给药。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述蛋白是酶。
62.治疗失调和疾病的方法，该方法包括用有效量的如权利要求1-22任一项所述的化合物，如权利要求23-52任一项所述的组合物或如权利要求53-59任一项所述的剂量单位给药。
63.如权利要求62所述的治疗方法，该方法可以用于与蛋白质或酶活性有关的失调和疾病。
64.如权利要求60或62所述的方法，其中所述的酶包括半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶家族的酶。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述的半胱氨酸蛋白酶包括组织蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基-肽酶-I)，白介素转化酶(ICE)，由钙激活的中性蛋白酶，钙蛋白酶I和II，肽链内切酶，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽链内切酶、腺病毒肽链内切酶和口疮病毒肽链内切酶，和寄生虫生命周期所必须的蛋白酶，如来自变形虫、阿米巴、盘尾丝虫、利什曼原虫、线虫、网柄菌、Therilerium、血吸虫和锥虫种的蛋白酶。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述的酶是组织蛋白酶B、Cruzaine和白介素-1β转化酶。
67.如权利要求64所述的方法，其中所述的丝氨酸肽酶包括二肽基-肽酶IV、酰氨酰基-肽酶和寡肽酶B和脯氨酰基-寡肽酶。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述的酶是组织蛋白酶D。
69.如权利要求64所述的方法，其中所述的金属蛋白酶包括血管紧张素转化酶、胶原酶、基质裂解素、膜型金属蛋白酶和genatinases。
70.如权利要求63所述的方法，其中所述的疾病包括由组织退化所导致的疾病如关节炎、肌肉萎缩、肿瘤入侵、肾小球肾炎(glomeronephritis)、寄生虫造成的骨质感染、parasitomies、牙周疾病和肿瘤转移；与心房利钠因子的退化有关的心脏疾病；炎性疾病如支气管炎、风湿性关节炎、骨质疏松、急性胰腺炎和癌扩散；失调如健忘症、忧郁症和血压的调控；糖尿病，锥虫病，查格斯氏病，食物性失调，暴食症和厌食症；酒精中毒，与细胞因子和细胞因子受体如白介素-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(INFN-γ)、IL-1拮抗剂受体(IL-1RA)、IL-10和粒细胞-巨噬细胞克隆(GM-CSF)的生长刺激因子的产生有关的疾病；心理紧张，对抗由HIV病毒(AIDS)引起的感染；导致髓鞘(mieline)退化的中枢神经系统炎性疾病，包括多发性硬化症和自体免疫性脑脊髓炎；癌肿瘤，自体免疫性疾病，肿瘤包括乳房、骨髓、腺瘤、甲状腺、黑素瘤、胃肠瘤、食道和甲状腺肿瘤和成神经细胞瘤。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述的疾病是腹水和实体肿瘤，特别地是乳房、骨髓、腺瘤、甲状腺、胃、肠、食道、甲状腺肿瘤和成神经细胞瘤。
72.如权利要求60-63任一项所述的方法，该方法抑制幼骨髓细胞进入细胞分裂(S期)。
73.如权利要求60-63任一项所述的方法，其是抗血管生成的。
74.如权利要求60-63任一项所述的方法，其是抗转移的。
75.如权利要求60-63任一项所述的方法，其可用于辅助放射治疗处理。
76.如权利要求60-63任一项所述的方法，该方法包括用活性成分给药，剂量约为0.0001-500mg/kg体重，特定地为0.0001-100mg/kg体重和更特定地约为0.0001-30mg/kg体重。
77.如权利要求60-63任一项所述的方法，该方法包括用足够量的活性成分给药而使受体全体积血液中的活性成分的浓度约为0.01-200uM，特别地为0.1-50uM，更特别地为10-25uM。
78.如权利要求60-63任一项所述的方法，其中所述的给药是通过如权利要求53-59任一项所述的剂量单位的方式进行的。
79.如权利要求60-63任一项所述的方法，其中所述的给药是连续的、非连续的或循环的。
80.调节免疫系统的方法，该方法包括用有效量的如权利要求1-22任一项所述的化合物，如权利要求23-52任一项所述的组合物或如权利要求53-59任一项所述的剂量单位给药。
81.如权利要求1-22任一项所述的化合物用于制备组合物的用途。
82.如权利要求81所述的用于制备药品以抑制蛋白质和酶活性的用途。
83.如权利要求23-52任一项所述的组合物用于制备药品以抑制蛋白质和酶活性的用途。
84.如权利要求81-83任一项所述的用途，其中所述的酶包括来自半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸肽酶和金属蛋白酶家族的酶。
85.如权利要求84所述的用途，其中所述的酶包括组织蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基-肽酶-I)，白介素转化酶(ICE)，由钙激活的中性蛋白酶，钙蛋白酶I和II，肽链内切酶，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽链内切酶、腺病毒肽链内切酶和口疮病毒肽链内切酶，和寄生虫生命周期所必须的蛋白酶，如来自变形虫、阿米巴、盘尾丝虫、利什曼原虫、线虫、网柄菌、Therilerium、血吸虫和锥虫种的蛋白酶，组织蛋白酶D或脑啡肽酶(Encephalinase)，二肽基-肽酶IV，酰氨酰基-肽酶和寡肽酶B和脯氨酰基-寡肽酶，血管紧张素转化酶，胶原酶，基质裂解素，膜型金属蛋白酶和genatinases。
86.如权利要求83所述的用途，其中所述的疾病包括由组织退化所导致的疾病如关节炎、肌肉萎缩、肿瘤入侵、肾小球肾炎(glomeronephritis)、寄生虫造成的骨质感染、parasitomies、牙周疾病和肿瘤转移；与心房利钠因子的退化有关的心脏疾病；炎性疾病如支气管炎、关节炎、风湿、骨质疏松、急性胰腺炎和癌扩散；失调如健忘症、忧郁症和血压的调控；糖尿病，锥虫病，查格斯氏病，食物性失调，暴食症和厌食症；酒精中毒，与细胞因子和细胞因子受体如白介素-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(INFN-γ)、IL-1拮抗剂受体(IL-1RA)、IL-10和粒细胞-巨噬细胞克隆(GM-CSF)的生长刺激因子的产生有关的疾病；心理紧张，对抗由HIV病毒(AIDS)导致的感染；导致髓鞘(mieline)退化的中枢神经系统炎性疾病，包括多发性硬化症和自体免疫性脑脊髓炎；癌肿瘤，自体免疫性疾病，肿瘤包括乳房、骨髓、腺瘤、甲状腺、黑素瘤、胃肠瘤、食道和甲状腺肿瘤和成神经细胞瘤。
87.如权利要求81或83所述的用于制备药物以治疗与蛋白或酶活性有关的失调和疾病的用途。
88.如权利要求81或83所述的用途，其抑制抑制幼骨髓细胞进入细胞分裂(S期)。
89.如权利要求81或83所述的用途，其是抗血管生成的。
90.如权利要求81或83所述的用途，其是抗转移的。
91.如权利要求81或83所述的用于辅助放射治疗处理的用途。
92.如权利要求81或83所述的用途，其与DNA反应。
93.如权利要求81或83所述的用途，其是免疫调节子。
全文摘要
本发明涉及含有双二苯基膦－二茂铁配位配体的环钯化合物和其类似物，其作为肽和酶的活性抑制剂，如丝氨酸肽酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和肽链内切酶家族的酶，这些酶的其中一些与恶性肿瘤，如甲状腺肿瘤的生长和转移有关。该化合物的例子如图所示。通过作用于上述酶并参与DNA分子的插入，这些化合物调控免疫系统。
文档编号C07F15/00GK1741797SQ03824724
公开日2006年3月1日 申请日期2003年8月22日 优先权日2002年8月30日
发明者安东尼奥·卡洛斯·法韦罗·凯雷斯, 克罗迪娅·宾科莱托·特林达德, 伊瓦尔·路易斯·多斯·桑托斯·泰尔萨瑞尔 申请人:圣保罗国家资助研究基金会