专利名称：粘膜炎莫拉氏菌蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自粘膜炎布兰汉氏球菌的新型蛋白质、编码这类蛋白质的DNA序列、及其在诊断和作为疫苗主要成分中的用途。
粘膜炎布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhalis)(也称作粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis))是一种可导致人呼吸道感染的革兰氏阴性需氧菌。粘膜炎布兰汉氏球菌可以作为人、特别是儿童呼吸道微生物区系中的一部分存在。这种细菌可导致成年人的下呼吸道感染和儿童的中耳炎(Klein J.O.,《临床感染性疾病》(Clin.Infect.Dis.)19:823-833(1994)；Murphy T.F.《微生物学回顾》(Microbial.Rev.)60:267-279(1996)；Nicotra等《国际药物档案》(Arch.Intern.Med.)146:890-893)。在一项研究中发现在患有慢性阻塞性肺病的成年人中约30％的化脓性恶化是由粘膜炎布兰汉氏球菌导致的(Verghese等《抗菌剂化疗》(Antimicrob.Agents Chemother.)34:1041-1044(1990))。使用中耳液体培养物进行的研究显示15-20％的中耳炎发作是由粘膜炎布兰汉氏球菌导致的(Klein,1994,文献同上)。
由粘膜炎布兰汉氏球菌导致的感染可诱发对细菌外膜抗原的免疫反应(Chapman等《感染性疾病杂志》(J.Infect.Dis.)151:878-882(1985)；Faden等《感染性免疫》(Infect.Immun.)60:3824-3829(1992)；Sethi等《感染性免疫》(Infect.Immun.)63:1516-1520(1995))。对粘膜炎布兰汉氏球菌的抗体存在于上呼吸道中的分泌物中(Fadden(1992)，文献同上；Stenfors,L.E.和Raisanen,S.《耳鼻喉学誌》(Acta.Otolaryngol.)113:191-195(1993))。菌株特异性粘膜免疫反应对预防由粘膜炎布兰汉氏球菌导致的中耳炎来说是重要的(Faden(1992),文献同上；和Stenfors与Raisanen(1993),文献同上)。
大量专利公开文献已经公开了来源于粘膜炎布兰汉氏球菌的分离的蛋白质及其作为抗原的潜在用途。实例包括WO90/12591、WO93/03761、WO95/09025、WO95/31215、WO96/12733和WO97/41731。
然而，例如对提供一定范围的来自粘膜炎布兰汉氏球菌的抗原存在持续的需求以便产生更好和更为有效的疫苗。目前我们已经分离了可用于引起免疫反应的一定范围的这类蛋白质以及作为诊断工具的用途。
因此，在第一个方面中，本发明提供了一种属于粘膜炎布兰汉氏球菌抗原且具有的由SDS-PAGE测定的表观分子量约为14-约71kDa的蛋白质。
在优选的实施方案中，所述的蛋白质是一种下列分离自粘膜炎布兰汉氏球菌的蛋白质(ⅰ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为14kDa的蛋白质；(ⅱ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为14.5kDa的蛋白质；(ⅲ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为15kDa的蛋白质；(ⅳ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为20kDa并具有下列N-末端序列的蛋白质AISYGNSADAQPYVGAKIGQVDAKQINNKNT；(ⅴ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为30kDa并具有下列N-末端序列的蛋白质NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV；(ⅵ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为35kDa并具有下列N-末端序列的蛋白质TPTVYGKAFLTIDANNTDXTY；(ⅶ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为44kDa并具有下列N-末端序列的蛋白质AGLDRSGQDVTASLQDGTYA；
(ⅷ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为71kDa并具有下列内部肽序列的蛋白质残基350-361GELSSNLQDRHK残基366-380ADIHGNRFRGSAAIAS残基528-533NFEYLK残基542-556FGELSVGDSHSVFLQ残基665-682DADVTGGFYGPNATEMGG。
如上所述，将本发明的蛋白质和多肽类用作抗原物质。这类物质可以是“抗原的”和/或“免疫原性的”。一般来说，“抗原的”指的是能够用于产生抗体或实际上能够在受治疗者体内诱发抗体反应的蛋白质或多肽。“免疫原性的”指的是能够在受治疗者体内引起保护性免疫反应的蛋白质或多肽。因此，在后一种情况中，所述的蛋白质或多肽不仅可以产生抗体反应而且可以产生以非抗体为基础的免疫反应。
本领域技术人员认识到本发明蛋白质或多肽类的同系物或衍生物也应用于本发明的上下文中，即作为抗原/免疫原性物质。因此，例如包括一种或多种附加、缺失、置换等在内的蛋白质或多肽类也包括在本发明中。此外，能够将一种氨基酸用另一种相似“类型”的氨基酸来取代。例如，将一种疏水氨基酸用另一种疏水氨基酸来取代。可以使用一种诸如CLUSTAL程序这样的程序以比较氨基酸序列。该程序可比较氨基酸序列且如果合适通过在各序列中插入间隔来发现最佳排列。能够计算最佳排列的氨基酸同一性或相似性(氨基酸类型的同一性+保守性)。类似于BLASTx这样的程序可排列最长的一段类似序列并给予其适宜的值。因此能够获得发现具有相似性的几个区域的比较结果，它们各自具有不同的评分。两类分析均是本发明中所关注的。
在同系物和衍生物的情况中，本文所述与蛋白质或多肽的同一性程度的重要性低于所述同系物或衍生物应保持其对肺炎链球菌的抗原性或免疫原性的重要性。然而，合适的是提供与本文所述的蛋白质或多肽类具有至少60％相似性的同系物或衍生物(如上所述)。优选提供具有至少70％相似性的同系物或衍生物、更优选提供具有至少80％相似性的同系物或衍生物。最优选提供具有至少90％乃至95％相似性的同系物或衍生物。
在一种可选择的手段中，所述的同系物或衍生物可以是融合蛋白即例如通过有效标记所需蛋白质或多肽而引入方便进行纯化的部分。必须除去“标记”或在这种情况中所述的融合蛋白自身应保持足够的抗原性是有用的。
可以将基因克隆技术用于提供基本上纯的形式的本发明蛋白质。例如，在J.Sambrook等在《分子克隆》(Molecular Cloning)第2版，Cold Spring Harbor laboratory Press(1989)中公开了这些技术。因此，也可以将本文公开的蛋白质N-末端序列用作分离编码各个蛋白质的基因的探针的基础。因此，在本发明的另一个方面中，提供了包括如下序列或由如下序列组成的核酸分子(ⅰ)编码本文所述的蛋白质或多肽的DNA序列或其RNA等价物；(ⅱ)与(ⅰ)的任意序列互补的序列；(ⅲ)与(ⅰ)和(ⅱ)的那些序列具有基本上同一性的序列；(ⅳ)编码本文所述蛋白的同系物、衍生物或片段的序列。
本发明的核酸分子可以包括大量这类序列和/或片段。本领域技术人员会认识到本发明可以包括在本文中列举的那些特殊新型核酸分子的新型变体。这类变体也包括在本发明中。例如，由于菌株的变异，实际上存在这些变体。例如，包括附加、置换和/或缺失。另外和特别地，当使用微生物表达系统时，希望通过在用于表达的特定生物体中利用公知优选密码子用途来工程化所述的核酸序列。因此，合成或非天然出现的变体也包括在本发明的范围内。
当使用上述术语“RNA等价物”时，它指的是一种给定的RNA分子，该分子具有与给定DNA分子序列互补的序列(实际上满足RNA的“U”取代遗传密码中的“T”)。
当为了测定同源性或同一性程度的目的而比较核酸序列时，可以使用诸如BESTFIT和GAP(两者均来自Wisconsin Genetics ComputerGroup(GCG)软件包)这样的程序。例如，BESTFIT比较两种序列并产生大多数相似片段的最佳排列。GAP能够使序列延其全长排列且如果合适通过在序列中插入间隔来发现最佳排列。在本发明上下文中，当讨论核酸序列的同一性时，适当进行比较，使所述序列延其全长排列来进行比较。
优选的情况是，具有基本上同一性的序列与所述序列具有至少50％的序列同一性、理想的是具有至少75％的序列同一性且更优选具有至少90％或至少95％的序列同一性。在某些情况中，序列同一性可以为99％或99％以上。
理想的情况是，术语“基本上同一性”指的是所述序列与本文所述的任意序列具有同一性的程度比与现有技术的核酸序列的同一性的程度更高。
然而，应注意如果本发明的核酸序列编码至少部分新型基因产物，那么本发明在其范围内包括可编码所述基因产物或其新型部分的所有可能的序列。
所述的核酸分子可以是分离型或重组型。可以将它引入载体且可以将所述载体引入宿主。这类载体和合适的宿主也构成本发明的另外的方面。
因此，例如通过使用以本文所述N-末端氨基酸序列为基础设计的探针可以鉴定粘膜炎布兰汉氏球菌中的基因。然后可以使用限制酶切下它们并将其克隆入载体。可以将该载体引入合适的宿主用于表达。
通过使用与所述核酸分子部分序列互补的合适的探针可以从粘膜炎布兰汉氏球菌中获得本发明的核酸分子。可以将限制酶或超声处理技术用于获得用于探测的合适大小的片段。
或者可以将PCR技术用于扩增所需的核酸序列。因此，可以将本文提供的序列数据用于设计进行PCR的两种引物，使得可以靶向包括完整基因或其片段在内的所需序列且然后将它们扩增至较高的程度。一种引物通常表现出对位于一种DNA分子链上的第一种序列的高度特异性，而另一种引物通常表现出对位于DNA序列互补链上并且从互补序列到第一种序列之间存在间隔的第二种序列的高度特异性。
典型的引物至少有15-25个核苷酸长。
作为一种进一步的选择，可以使用化学合成方法。该方法可以自动进行。可以化学合成相对较短的序列并将它们彼此连接以产生较长的序列。
本领域技术人员会认识到对分子量进行SDS-PAGE测定可使结果产生±10％误差范围。因此，已经如此测定的本文所述的任何表观分子量均会有这样的误差。
本领域技术人员会认识到也可以使用本发明的抗原性蛋白质片段，当然条件是这类片段可保持有效的充分的抗原性。用于筛选这类片段的技术对于本领域技术人员来说是众所周知的。因此，在第二个方面中，本发明提供了一种或多种本文所述的蛋白质抗原性片段。
如上所述，本发明抗原(包括抗原性片段)的初级用途是引起免疫反应。因此，在第三个方面中，本发明提供了一种免疫原性组合物，优选一种疫苗组合物，它包括一种或多种本发明的抗原(包括抗原性片段)。可以用标准的药物载体、赋形剂、稀释剂等来配制该组合物。此外，它可以包括一种或多种佐剂用于促进任何免疫反应。本发明的疫苗组合物可以包括一种或多种佐剂。在本领域中众所周知的佐剂的实例包括诸如氢氧化铝这样的无机凝胶或诸如弗氏不完全佐剂这样的油包水乳剂。其它有用的佐剂对于本领域技术人员来说是众所周知的。
在第四个方面中，本发明提供了本文所述的一种或多种蛋白质或一种或多种其抗原性片段在制备免疫原性组合物中的用途。优选的情况是，该免疫原性组合物是一种疫苗。在优选的实施方案中，该疫苗用于预防或治疗呼吸感染或者预防或治疗中耳炎。
特别地，将一种或多种下列蛋白质、同系物、衍生物或一种或多种其抗原性片段用于/一起用于制备所述的免疫原性组合物(ⅰ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为14kDa的蛋白质；(ⅱ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为14.5kDa的蛋白质；(ⅲ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为15kDa的蛋白质；(ⅳ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为20kDa并具有下列N-末端序列的蛋白质AISYGNSADAQPYVGAKIGQVDAKQINNKNT；(ⅴ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为30kDa并具有下列N-末端序列的蛋白质NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV；(ⅵ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为35kDa并具有下列N-末端序列的蛋白质TPTVYGKAFLTIDANNTDXTY；(ⅶ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为44kDa并具有下列N-末端序列的蛋白质AGLDRSGQDVTASLQDGTYA；(ⅷ)具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为71kDa并具有下列内部肽序列的蛋白质残基350-361GELSSNLQDRHK残基366-380ADIHGNRFRGSAAIAS残基528-533NFEYLK残基542-556
FGELSVGDSHSVFLQ残基665-682DADVTGGFYGPNATEMGG。
本文所述的抗原性蛋白质、衍生物、同系物或其片段可以单独提供、作为纯化或分离的制剂提供或作为与其它粘膜炎布兰汉氏球菌抗原性蛋白质的混合物的一部分来提供。
因此，在第五个方面中，本发明提供了一种抗原组合物，它包括一种或多种本发明的蛋白质、一种或多种其同系物或衍生物或一种或多种其抗原性片段、可选择性地混合于至少一种其它粘膜炎布兰汉氏球菌抗原或一种或多种其抗原性片段。
另外，可以将本发明的蛋白质或其抗原性片段用于产生或筛选抗体。
因此，在进一步的方面中，本发明提供了对至少一种本发明蛋白质或对一种或多种其抗原性片段产生的抗体。优选的抗体特异性地与本发明的蛋白质结合并由此可以将其用于纯化这类蛋白质(例如可以将它们固定并用于结合本发明的蛋白质。然后可以通过用合适的洗脱剂在合适的条件下进行洗涤来洗脱所述的蛋白质)。
本发明范围内的抗体可以是单克隆的或多克隆的。
当将本发明的蛋白质注入动物体内时，多克隆抗体可以通过刺激其在合适的动物宿主(例如小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、绵羊、山羊或猴)中的产生而得到增加。如果需要，可以与本发明的蛋白质一起给予一种佐剂。可以使用诸如如上所述的那些众所周知的佐剂。然后通过它们与本发明蛋白质的结合来纯化所述的抗体。
单克隆抗体可以从杂交瘤中产生。通过使产生所需抗体的骨髓瘤细胞和脾细胞融合以便形成无限增殖细胞系来产生这些单克隆抗体。因此，可以使用众所周知的Kohler & Milstein技术(《自然》(Nature)256(1975))或在该技术基础上进行的改进技术。
用于生产与特定蛋白质结合的单克隆抗体和多克隆抗体的技术目前在本领域中得到了充分的开发。在标准的免疫学教科书、例如Roitt等在《免疫学》(Immunology)第二版(1989)，Churchill Livingstone,London中讨论了这些技术。
除全部抗体外，本发明还包括能够结合本发明蛋白质的其衍生物。因此，本发明包括了抗体片段和合成的构建体。抗体片段和合成构建体的实例由Dougall等在Tibtech 12 372-379(1994年9月)中给出。
例如，抗体片段包括Roitt等在上述文献中所述的Fab、F(ab)2和FV片段。可以修饰Fv片段以便产生称作单链Fv(scFv)分子的合成构建体。它包括共价结合Vh和Vl区的肽接头，该接头有利于分子的稳定性。可以使用的其它合成构建体包括CDR肽类。它们是含有抗原结合决定簇的合成肽类。还可以使用肽的模拟物。这些分子通常是构象上限制的模拟CDR环状结构的有机环并且它们包括抗原相互作用侧链。
合成构建体包括嵌合分子。因此，例如，人源化(或灵长源化)的抗体或其衍生物属于本发明的范围内。人源化抗体的一个实例是具有人构架区而不是啮齿类超变区的抗体。Morrison等在PNAS,81,6851-6855(1984)和Takeda等在《自然》(Nature)314,452-454(1985)中讨论了生产嵌合抗体的方式。
合成构建体还包括含有可向分子提供具有除抗原结合特性以外的某些所需特性的附加部分的分子。例如所述的部分可以是一种标记(例如荧光或放射性标记)。
本发明的抗体或其衍生物还应用于检测/诊断粘膜炎布兰汉氏球菌。
在本发明的第七个方面中，提供了一种检测和/或诊断粘膜炎布兰汉氏球菌的方法，该方法包括下列步骤(a)使一种或多种本发明的抗体与所检测的样品接触；和(b)检测一种或多种本发明的抗原性蛋白质或一种或多种其抗原性片段的存在。
另一方面，可以将本发明的抗原性蛋白质用于检测抗粘膜炎布兰汉氏球菌的抗体，它们可以存在于获自受治疗者的生物样品中。因此，在进一步的方面中，本发明提供了一种检测和/或诊断粘膜炎布兰汉氏球菌的方法，该方法包括下列步骤(a)使本文所定义的一种或多种本发明的抗原性蛋白质或一种或多种其抗原性片段或以本发明免疫原性组合物的形式与所检测的样品进行接触；和(b)检测存在的对粘膜炎布兰汉氏球菌的抗体。
在另一方面中，本发明提供了本发明的抗原性蛋白质、其抗原性片段或免疫原性组合物在检测和/或诊断粘膜炎布兰汉氏球菌中的用途。所述的检测和/或诊断优选在体外进行。
本发明的抗原性蛋白质、其抗原性片段或抗原组合物可以作为用于体外检测和/或诊断粘膜炎布兰汉氏球菌的试剂盒的组成部分来提供。因此，在另一个方面中，本发明提供了一种用于检测和/或诊断粘膜炎布兰汉氏球菌的试剂盒，该试剂盒中包括至少一种本发明的抗原性蛋白质、其抗原性片段或抗原组合物或至少一种本发明的抗体。
如上所述，可以将所述的抗原性蛋白质或其抗原性片段用于诱发对粘膜炎布兰汉氏球菌的免疫反应。因此，在进一步的方面中，本发明提供了本发明抗原、其片段或抗原性组合物在药物中的用途。
在另一方面中，本发明提供了(a)本文所述的抗原性蛋白质、其抗原性片段或免疫原性组合物在诱发受治疗者体内免疫反应中的用途；(b)一种用于治疗或预防受治疗者呼吸感染的方法，该方法包括对受治疗者给予有效量的本发明的至少一种蛋白质、至少一种其抗原性片段或一种免疫原性组合物(优选作为一种疫苗给予)的步骤；和(c)一种用于治疗或预防受治疗者中耳炎的方法，该方法包括对受治疗者给予有效量的本发明的至少一种蛋白质、至少一种其抗原性片段或一种免疫原性组合物(优选作为一种疫苗给予)的步骤。
用于生产本文所述抗原性蛋白质(或实际上是其片段)的一种便利的方法，它是通过使用重组DNA技术来进行。
现在参照下列实施例来描述本发明，这些实施例不应以任何方式来限定本发明。这些实施例涉及附图，其中附
图1表示用于分离本文所述30kDa和71kDa蛋白质的流程图解；附图2表示用于分离本文所述14kDa、14.5kDa和15kDa蛋白质的流程图解；附图3表示显示银染色后纯化蛋白质的SDS-PAGE凝胶；且附图4表示使用或不使用本发明抗原进行免疫接种的粘膜炎布兰汉氏球菌感染的小鼠的清除速率数据。
实施例1蛋白质的纯化(ⅰ)30kDa和71kDa给20ml脑心浸液(BHZ)肉汤接种4-5个克隆的粘膜炎布兰汉氏球菌K65菌株(来自在Sir Charles Gardinar Hospital,Perth,Australia回收的痰的临床分离物；菌株K65产生β-内酰胺酶)并在37℃下在振动培养箱中培养过夜。将2ml的培养物加入到4×500ml烧瓶中的BHI肉汤中并在37℃下在振动培养箱中培养过夜。使细菌沉淀并在4℃下在PBS中使用应用JA-14转子的Beckman JA-2离心机以10,000rpm洗涤3次、每次持续15分钟。除在添加乙酸钠/β-巯基乙醇后不调节pH外，使用兼性离子提取法和乙醇沉淀法提取蛋白质。将终产物对蒸馏水透析，从而产生40ml、15.35mg/ml的总计为614mg的蛋白质。将该制备物冻干。
在上BioRad Q2离子交换柱前，将蛋白质提取物重新悬浮于约60mg/ml缓冲液A(25mM tris-HCl,pH8.1)中。将1ml等分试样各自走柱。将该柱用缓冲液A以1ml/分钟洗涤5分钟。使用连续和从100％缓冲液A至100％缓冲液B(25mM Tris-HCl+0.5M NaCl,pH8.1)的逐步梯度相结合的方法在5-10分钟内洗脱蛋白质。随后的梯度是用100％缓冲液B洗涤4分钟、接着用100％缓冲液A洗涤1分钟。合并级分2、3和4；在PD-10柱上脱盐改变成稀释的Tris缓冲液；然后冻干。
用蒸馏水将体积调节至600μl、与2.4ml还原缓冲液(62.5mM Tris,pH6.8、10％v/v甘油、2％w/v SDS、5％v/v β-巯基乙醇、1.2×10-3％w/v溴酚蓝)混合并在37℃下保温30分钟。使用Bio-Rad Model 491Prep Cell、应用40ml9％T-1.42％C丙烯酰胺/BIS(N,N’-亚甲双丙烯酰胺)分离凝胶与在37mm(内径[i.d.])柱上聚合的10ml 4％t-0.36％C丙烯酰胺/BIS积层凝胶进行用于纯化蛋白质的制备型SDS-PAGE。用0.025M Tris-HCl从该柱上洗脱下级分、通过冻干浓缩并通过分析型SDS-PAGE分析蛋白质含量。在级分57-80中有71kDa的蛋白质。将其合并，冻干并加至25ml蒸馏水中。通过使用稀释的PBS的缓冲液更换使制备物脱盐并再浓缩以便缓冲蛋白质的PBS的浓度是等渗的。
从这种相同的制备性细胞流出物中并合含有55-65kDa蛋白质的级分26-34和含有20-35kDa蛋白质的级分4-17。使用145T-1.42％C丙烯酰胺/BIS分离凝胶与4％T-0.36％C丙烯酰胺/BIS积层凝胶进一步纯化级分4-17(参见附图1的流程图)。如上所述估计级分的蛋白质含量、合并合适范围的级分并使纯化的蛋白质脱盐和浓缩。
(ⅱ)其它蛋白质的纯化给20ml脑心浸液肉汤接种4-5个克隆的粘膜炎布兰汉氏球菌K65菌株并在37℃下在振动培养箱中培养过夜。将2ml的培养物加入到4×500ml烧瓶中的BHI肉汤中并在37℃下在振动培养箱中培养过夜。使细菌沉淀并在4℃下在PBS中使用应用JA-14转子的Beckman JA-2离心机以10,000rpm洗涤3次、每次持续15分钟。使用兼性离子提取法和乙醇沉淀法提取蛋白质，同时用乙酸钠/β-巯基乙醇将pH调节至pH为4。
在上BioRad Q2离子交换柱前，使用如上所述的方案将蛋白质提取物重新悬浮于约60mg/ml缓冲液A中。从该柱的峰中估计蛋白质含量、合并合适的级分并使用制备型凝胶电泳进行进一步纯化(使用如附图2中所示的柱和如上所述的方案)。涉及使用SDS的制备型电泳的所有蛋白质纯化均通过用磷酸钾沉淀而使洗涤剂被除去。结果从来自单一提取过程的10μg-300μg范围量的粘膜炎布兰汉氏球菌的其它膜提取物中纯化几种蛋白质。附图3表示对23kDa-71kDa蛋白质进行的分析型SDS-PAGE分析。氨基酸序列的鉴定N-末端测序根据Applied Biosystems法提供的方案进行本过程。然而，此外，本领域技术人员还可以根据Matsudaira在《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)262:10035-10038(1997)中所述的方法来进行这类测序。内部肽测序使用SDS-PAGE兼容性S-2-酰胺化(carboxamidothylation)法进行测序。对溶于由10％甘油(体积/体积)、5％(重量/体积)SDS、0.025M Tris HCl、100mM 1,4-DTT、pH8.3组成的溶液的蛋白质进行烷基化反应。最初通过在90℃下将该混合物保温15分钟来还原蛋白质。然后将样品冷却至37℃、将丙烯酰胺加入至终浓度为2M并在无光照的氩气中将该混合物培养30分钟-60分钟。加入SDS还原缓冲液、使样品进行SDS-PAGE、通过考马斯染色使蛋白质显色并将其从凝胶中切下。对不能够进行N-末端测序的71kDa的蛋白质进行该过程。实施例2免疫接种方案Intra-Peyer’s斑贴(IPP)免疫接种法是一种针对大鼠所述的改进方法(Kyd等《感染性免疫》(Infect.Immun.)63:2931-2940(1995))。通过将蛋白质与弗氏不完全佐剂(IFA)(Sigma,St Louis,MI)按1∶1的比例乳化以使剂量在2.5μg-10μg的范围来制备免疫接种的接种物。通过皮下注射0.25ml的氯胺酮/甲苯噻嗪的PBS溶液(5mg/ml的盐酸氯胺酮[Troy Laboratories,Smithfield,NSW,Austrialia]；2mg/ml的盐酸甲苯噻嗪[Bayer,Pymble,NSW,Austrialia])使6-8周龄、维持在SPF条件下的不含特异性病原体(SPF)的雄性BALB/c小鼠麻醉。通过在腹部壁上的1cm中线切口使小肠暴露并使用26G针头将约1μl体积的接种物经浆膜下层输送到各Peyer’s斑贴。用无菌PBS冲洗小肠并缝合腹腔。通过注射IFA和PBS乳剂给假拟接种的小鼠进行同样的外科手术。
在IPP后的第14天进行气管内加强注射。通过静脉二羟孕烷二酮-21-醋酸酯-羟-5α-孕烷二酮复合剂麻醉法给小鼠使用镇静剂(0.15ml；20mg溶于PBS的阿法双酮(alphadone)/kg体重；Pitman-Moore,Nth Ryde,NSW,Australia)。将20μl体积的蛋白质PBS溶液(给予的相同量的IPP)通过经口腔插入气管的22.5G导管(Terumo,Tokyo,Japan)输送入肺。用两个0.3ml体积的空气分散接种物。细菌攻击使粘膜炎布兰汉氏球菌在用50ml/升去纤维蛋白的马血(AmadeusInternational,Brooklyn,Vic,Australia)补充的脑心浸液(BHI)琼脂平板上生长过夜。将平板在37℃和5％CO2条件下培养过夜、收集细菌并用PBS洗涤3次。通过测定405nm处的光密度来估计浓度并通过对系列稀释的接种物过夜铺平板的菌落形成单位(CFU)进行计数来证明。经静脉给予二羟孕烷二酮-21-醋酸酯-羟-5α-孕烷二酮复合剂给小鼠使用镇静剂。将20μl的活粘膜炎布兰汉氏球菌的浓接种物如上所述导入肺用于强化IT。在感染后4小时或如上所述通过腹膜内注射戊巴比妥钠来处死小鼠。通过心脏穿刺取血并使之凝块以用于收集血清。通过颈暴露气管且通过经插管将0.5ml的PBS滴注入肺并回收来获得支气管肺泡灌洗物(BAL)。在获得BAL后，将完整的肺切下、置于2ml体积的PBS中并在组织匀浆器中匀化(9500rpm；Heidolph DIAX600,Electro GmbH & Co,Kelheim,Germany)。通过将用于CFU测定的系列稀释物铺平板估计BAL和肺匀化物的细菌清除率。通过在4℃和450×g下离心10分钟(Juoan BR3.11,St Nazaire,France)来分离血清并将其保存在-80℃下。结果给小鼠免疫接种IPP并用纯化的蛋白质进行强化IT。附图4中所示的数据表明了与非免疫细菌回收率相比支气管肺泡灌洗物(BAL)或肺组织中细菌清除率增加的百分比。
表观分子量为71kDa的蛋白质可最有效地提高从BAL中的清除率，而对该蛋白质的免疫反应在从肺组织中的清除方面几乎无效。
在用表观分子量为44kDa的蛋白质免疫接种后的免疫反应可有效地使从BAL和肺组织中清除细菌。用15和30kDa蛋白质进行的免疫接种表明在BAL和肺中增加的清除率为50％以上，而表现出这种BAL清除率的14.5kDa蛋白质没有在肺中达到相同的预防作用。14kDa蛋白质在BAL中清除细菌方面不是有效的，但能够轻度提高从肺中的清除率。
序列表<110>Cortecs(UK)LimitedCripps,Allan WKyd,Jennelle<120>蛋白质<130>PWC/P20695WO<140>PCT/GB99/01473<141>1999-05-11<150>GB9810084.5<151>1998-05-11<160>9<170>Patentln版本2.1<210>1<211>31<212>PRT<213>粘膜炎布兰汉氏球菌<400>1Ala Ile Ser Tyr Gly Asn Ser Ala Asp Ala Gln Pro Tyr Val Gly Ala1 5 10 15Lys Ile Gly Gln Val Asp Ala Lys Gln Ile Asn Asn Lys Asn Thr20 25 30<210>2<211>31<212>PRT<213>粘膜炎布兰汉氏球菌<400>2Asn Val Val Thr Asn Thr Gly Ala Thr Val Val Asp Gly Thr Arg Thr1 5 10 15Ile Phe Ser Thr Leu Val Lys Pro Ala Ala Val Val Ala Ala Val20 25 30<210>3<211>21<212>PRT<213>粘膜炎布兰汉氏球菌<220><221>SITE<222>(19)<223>Xaa是任意的氨基酸<400>3Thr Pro Thr Val Tyr Gly Lys Ala Phe Leu Thr Ile Asp Ala Asn ASn1 5 10 15Thr Asp Xaa Thr Tyr20<210>4<211>20<212>PRT<213>粘膜炎布兰汉氏球菌<400>4Ala Gly Leu Asp Arg Ser Gly Gln Asp Val Thr Ala Ser Leu Gln Asp1 5 10 15Gly Thr Tyr Ala20<210>5<211>12<212>PRT<213>粘膜炎布兰汉氏球菌<400>5Gly Glu Leu Ser Ser Asn Leu Gln Asp Arg His Lys1 5 10<210>6<211>16<212>PRT<213>粘膜炎布兰汉氏球菌<400>6Ala Asp Ile His Gly Asn Arg Phe Arg Gly Ser Ala Ala Ile Ala Ser1 5 10 15<210>7<211>6<212>PRT<213>粘膜炎布兰汉氏球菌<400>7Asn Phe Glu Tyr Leu Lys1 5<210>8<211>15<212>PRT<213>粘膜炎布兰汉氏球菌<400>8Phe Gly Glu Leu Ser Val Gly Asp Ser His Ser Val Phe Leu Gln1 5 10 15<210>9<211>18<212>PRT<213>粘膜炎布兰汉氏球菌<400>9Asp Ala Asp Val Thr Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Asn Ala Thr Glu Met1 5 10 15Gly Gly
权利要求
1．一种属于粘膜炎布兰汉氏球菌(B.catarrhalis)抗原并具有由SDS-PAGE测定的表观分子量约为14-约17kDa的蛋白质；
2．一种如权利要求1中所述的蛋白质，它具有由SDS-PAGE测定的约为14kDa的表观分子量。
3．一种如权利要求1中所述的蛋白质，它具有由SDS-PAGE测定的约为14.5kDa的表观分子量。
4．一种如权利要求1中所述的蛋白质，它具有由SDS-PAGE测定的约为15kDa的表观分子量。
5．一种如权利要求1中所述的蛋白质，它具有由SDS-PAGE测定的约为20kDa的表观分子量并具有下列N-末端序列AISYGNSADAQPYVGAKIGQVDAKQINNKNT。
6．一种如权利要求1中所述的蛋白质，它具有由SDS-PAGE测定的约为30kDa的表观分子量并具有下列N-末端序列NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV。
7．一种如权利要求1中所述的蛋白质，它具有由SDS-PAGE测定的约为35kDa的表观分子量并具有下列N-末端序列TPTVYGKAFLTIDANNTDXTY。
8．一种如权利要求1中所述的蛋白质，它具有由SDS-PAGE测定的约为44kDa的表观分子量并具有下列N-末端序列AGLDRSGQDVTASLQDGTYA。
9．一种如权利要求1中所述的蛋白质，它具有由SDS-PAGE测定的约为71kDa的表观分子量并具有下列内部肽序列残基350-361GELSSNLQDRHK残基366-380ADIHGNRFRGSAAIAS残基528-533NFEYLK残基542-556FGELSVGDSHSVFLQ残基665-682DADVTGGFYGPNATEMGG。
10．一种如权利要求1-9中任意一项所定义的蛋白质的同系物或衍生物。
11．一种或多种如权利要求1-9中任意一项所定义的蛋白质的抗原性片段。
12．一种包括如下序列或由如下序列组成的核酸分子(ⅰ)编码如权利要求1-9中任意一项所定义的蛋白质的DNA序列或其RNA等价物；(ⅱ)与(ⅰ)的任意序列互补的序列；(ⅲ)与(ⅰ)和(ⅱ)的那些任意序列具有基本上同一性的序列；(ⅳ)编码权利要求1-9中任意一项所定义的蛋白质同系物、衍生物或片段的序列。
13．一种包括如权利要求12中所定义的核酸序列的载体。
14．一种用如权利要求13中所定义的载体转化或转染的宿主细胞。
15．一种免疫原性组合物，它包括一种或多种如权利要求1-9中任意一项所定义的蛋白质、一种或多种如权利要求10中所定义的同系物或衍生物或一种或多种如权利要求11中所定义的抗原性片段。
16．一种如权利要求15中所述的免疫原性组合物，它是一种疫苗。
17．一种或多种如权利要求1-9中任意一项所定义的蛋白质、一种如权利要求10中所定义的同系物或衍生物或一种或多种如权利要求11中所定义的抗原性片段在制备免疫原性组合物中的用途。
18．权利要求17中所述的用途，其中所述的免疫原性组合物是一种用于预防或治疗呼吸感染的疫苗组合物。
19．权利要求17中所述的用途，其中所述的免疫原性组合物是一种用于预防或治疗中耳炎的疫苗。
20．一种抗原组合物，它包括一种或多种如权利要求1-9中任意一项所定义的蛋白质和/或一种或多种如权利要求10中所定义的同系物或衍生物和/或一种或多种如权利要求11中所定义的抗原性片段；可选择性地与至少一种其它粘膜炎布兰汉氏球菌抗原或其片段相混合。
21．一种对如权利要求1-9中任意一项所定义的蛋白质、如权利要求10中所定义的同系物或衍生物或如权利要求11中所定义的抗原性片段产生的抗体。
22．一种检测和/或诊断粘膜炎布兰汉氏球菌的方法，该方法包括下列步骤(a)使一种或多种如权利要求21中所定义的抗体与所检测的样品接触；和(b)检测一种或多种如权利要求1-9中任意一项所定义的抗原的存在。
23．一种检测和/或诊断粘膜炎布兰汉氏球菌的方法，该方法包括下列步骤使一种或多种如权利要求1-9中任意一项所定义的抗原性蛋白质、一种或多种如权利要求10中所定义的同系物或衍生物、一种或多种如权利要求11中所定义的抗原性片段或一种如权利要求20中所定义的抗原组合物与所检测的样品接触；和(b)检测对粘膜炎布兰汉氏球菌的抗体的存在。
24．如权利要求1-9中任意一项所定义的蛋白质、如权利要求10中所定义的同系物或衍生物、如权利要求11中所定义的片段或如权利要求20中所定义的抗原组合物在检测/诊断粘膜炎布兰汉氏球菌中的用途。
25．一种用于检测/诊断粘膜炎布兰汉氏球菌的试剂盒，它包括至少一种如权利要求1-9中任意一项所定义的抗原性蛋白质、至少一种如权利要求10中所定义的同系物或衍生物、至少一种如权利要求11中所定义的抗原性片段、一种如权利要求20中所定义的抗原组合物或一种如权利要求21中所定义的抗体。
26．如权利要求1-9中任意一项所定义的蛋白质、如权利要求10中所定义的同系物或衍生物、如权利要求11中所定义的片段或如权利要求15中所定义的免疫原性组合物在药物中的用途。
27．如权利要求1-9中任意一项所定义的蛋白质、如权利要求10中所定义的同系物或衍生物、如权利要求11中所定义的抗原性片段或如权利要求15中所定义的免疫原性组合物在诱发受治疗者免疫反应中的用途。
28．一种用于治疗或预防受治疗者呼吸感染的方法，该方法包括下列步骤对受治疗者给予有效量的至少一种如权利要求1-9中任意一项所定义的蛋白质、至少一种如权利要求10中所定义的同系物或衍生物、至少一种如权利要求11中所定义的抗原性片段或一种如权利要求15中所定义的免疫原性组合物。
29．一种用于治疗或预防受治疗者中耳炎的方法，该方法包括下列步骤对受治疗者给予有效量的至少一种如权利要求1-9中任意一项所定义的蛋白质、至少一种如权利要求10中所定义的同系物或衍生物、至少一种如权利要求11中所定义的抗原性片段或一种如权利要求15中所定义的免疫原性组合物。
全文摘要
本发明提供了粘膜炎布兰汉氏球菌的新型抗原、及其在疫苗中的用途以及诊断和/或检测方法。
文档编号G01N33/569GK1306542SQ99807588
公开日2001年8月1日 申请日期1999年5月11日 优先权日1998年5月11日
发明者A·W·克里普斯, J·基德 申请人:科特克斯(Om)有限公司