专利名称：用于预防哺乳动物粘膜炎莫拉氏(布拉汉氏)菌感染的脂寡糖疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防细菌感染的偶联疫苗。更具体地，本发明涉及用于预防人粘膜炎莫拉氏(布拉汉氏)菌感染的偶联疫苗，其中包含来自细菌的脂寡糖，该脂寡糖中除去了酯化的脂肪酸或脂质A，并连接于免疫原性载体上。
尽管粘膜炎莫拉氏菌的保护性抗原还未清楚地限定，但是抗粘膜炎莫拉氏菌血清抗体可能在抗粘膜炎莫拉氏菌的免疫中发挥着重要作用。例如，因天然移生或感染获得免疫的正常成年人，其携带率(1～6％)低于儿童(50～78％)和老年人(＞26％)，而且较少地患感染(EjlertsenT.et al.,1994,J.Infect.29:23-31；Faden H.et al.,1994,J.Infect.Dis.169:1312-1317；Eliasson,I.,1986,Drugs 31(Suppl3):7-10；Vaneechoutte,M.,et al.,1990.,3.Clin.Microbiol.28:2674-2680)。在出生后的头4年当中，儿童逐渐地生成抗粘膜炎莫拉氏菌的血清抗体，这种现象同粘膜炎莫拉氏菌引发的菌血症及中耳炎发病率的降低相关(CDR WeeklyReports,1992-1995,Communicable Disease Surveillance Centre,London；Goldblatt D.,et al.,1990,J.Infect.Dis.162:1128-1135；Vaneechoutte,M.,et al.,1990.,J Clin Microbiol 28:2674-2680；Bluestone,C.D.,1986,Drugs 31(Suppl 3):132-141)。在成年患者的急性和康复期血清中，已经检测到了抗粘膜炎莫拉氏菌的抗体(Christensen,J.J.,et al.,1990,Clin.Diagn.Lab.Immunol.3:717-721；Rahman,M.,et al.,1997,APMIS105:213-220)。大多数恢复期血清表现出了针对相应粘膜炎莫拉氏菌的杀菌活性(Chapman,A.J.Jr.,et al.,1985,J.Infect.Dis.151:878-882)。这些结果表明血清抗体可能参与了抗粘膜炎莫拉氏菌感染的保护作用。
迄今为止，以粘膜炎莫拉氏菌为重要病原菌的研究工作通常集中在例如外膜蛋白(OMP)等表面抗原的描述上(Bhushan,R.,et al.,1994,J.Bacteriol.176:6636-6643；Campagnari,A.A.,et al.,1994,Infect.Immun.62:4909-4914；Helminen,M.E.,Et al.,1993,Infect.Immun.61:2003-2010；Helminen,M.E.,et al.,1994,J.Infect.Dis.170:867-872；Murphy,T.F.,etal.,1993,Mol.Microbiol.10:87-97)。已经对两种外膜蛋白进行了广泛的研究，它们是高分子量蛋白(UspA)和主要外膜蛋白(CD)。这两种蛋白相对地保存在粘膜炎莫拉氏菌的不同菌株中，并能导致杀菌抗体的生成(Helminen,M.E.,et al.,1994,J.Infect.Dis.170:867-872；Murphy,T.F.,et al.,1993,Mol.Microbiol 10:87-97；Yang,Y.P.,et al.,1997,FEMSImmunol.Med.Microbiol 17:187-199)。另外，用抗USPA单克隆抗体被动免疫或者用UspA免疫增加了鼠动物模型中肺部粘膜炎莫拉氏菌的清除(Helminen,M.E.,et al.,1994,J.Infect.Dis.170:867-872；Chen,D.,etal.,1996,Infect.Immun.64:1900-1905)。编码CD蛋白的基因已被克隆并测序(Murphy et al.,1993,Molec.Microbiol 10(1):87)。
已被纯化并定性的其他外膜蛋白包括蛋白E(OMP E)(Bhushanet al.,1994,J.Bacteriol,176(21):6636)、蛋白B1(Ducey et al.,1996,Abstracts,Gen.Mtg.Am.Soc.Microbiol.,96(0):186)和蛋白COPB(Aebiet al.,1996,Abstracts,Intersci.Conf.Antimicrobial Agents &Chemotherapy 36:158)。其它表面抗原包括还未在所有菌株中发现的菌毛(Marrs,C.F.& S.Weir,1990,Am.J.Med.88(suppl 5A):36S～40S)和荚膜多糖，荚膜多糖是否存在还有争议(Ahmed,K,et al.,1991,Microbiol Immunol.35:361-366)。脂寡糖相关高分子量外膜蛋白也已鉴定(Klingman & Murphy,1992,Abstr.Gen Mtg.Am.Soc.Microbiol.)。
脂寡糖(LOS)，粘膜炎莫拉氏菌的一种主要表面成分，是这种细菌致病机理的毒力因子(Doyle,W.J.,1989,Pediatr.Infect.Dis.J.81(Suppl):S45-S47；Fomsgaard,J.S.,et al.,1991,Infect.Immun.59:3346-3349)。LOS对于免疫保护的形成起着重要作用的原因在于(1)在粘膜炎莫拉氏菌感染的患者体内检测到抗LOS的血清抗体，(2)来自患者的康复期抗-LOS IgG表现出针对粘膜炎莫拉氏菌的杀菌活性，以及(3)在人体内LOS具有建立在其血清学特性基础上的保留结构(Rahman,M.,et al.,1995,Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.14:297-304；Tanaka,H.,et al.,1992,J.Jpn.Assoc.Infect.Dis.66:709-715)。类似地，特异于其它微生物(例如，b型流感嗜血杆菌、脑膜炎奈氏菌、霍乱弧菌、索氏志贺氏菌)的血清杀菌LPS或PS抗体赋予人体针对这些病原体的免疫力(Robbins,J.B.,et al.,1995,J.Infect.Dis.171:1387-1398；Cohen,D.,et al.,1997,Lancet 349:155-159)。
LOS的3个主要的抗原型(A,B和C)占粘膜炎莫拉氏菌菌株的95％(即在一项研究中测得为61％A；29％B；和5％C)(Vaneechoutte,M.,et al.,1990,J.Clin.Microbiol.28:182-187)。研究表明这些LOS中包含一种连接到脂质A上的寡糖，不含O-特异性多糖，来自这3种血清型的寡糖以一个共同的内核形成分枝(Edebrink,P.,etal.,1994,Carbohydr.Res.257:269-284；Edebrink,P.,et al.,1995,Carbohydr.Res.266:237-261；Edebrink,P.,et al.,1996,Carbohydr.Res.295:127-146)。
通常，来自多种微生物的脂多糖(LPS)和LOS对于哺乳动物具有体内毒性。现已有多种方法可以用于LPS或LOS的脱毒，或者获得无毒性的来自LPS多糖或来自LOS的寡糖。例如，弱酸处理LPS或LOS可作用于Kdo-葡糖胺键使脂质A从LOS分子中切除脂质A(Gu,X.X.,&C.M.Tsai,1993,Infect.Immun.61:1873-1880)。另一种方法是弱碱处理LOS，除去酯连接的脂肪酸但保留了脂质A的酰胺-连接的脂肪酸(Gupta,R.K.,et al.,1992,Infect.Immun.60:3201-3208；Gu et al.,1996,Infect.& Imm.64(10):4047)。
现已尝试使用多种方法来开发粘膜炎莫拉氏菌或其它微生物的疫苗(Karma et al.,1995,Int′l.J.Ped.Otorhinolaryngol.32(SUPPL.):S127-S134)。美国专利US5,607,846和US5,556,755公开了以下列成分为基础的粘膜炎莫拉氏菌疫苗外膜蛋白E和CD、衍生肽或寡肽、或者编码这些蛋白的核苷酸。美国专利US5,334,379公开了把含碳水化合物的抗原连接到一种具有免疫调节功效的细胞因子、淋巴因子、激素或生长因子上制成的偶联疫苗。专利号为2,162,193的加拿大专利公开了一种纯化的细菌乳铁蛋白受体蛋白可以用作针对抗包括粘膜炎莫拉氏菌在内能产生乳铁蛋白受体蛋白的病原体的疫苗。PCT申请WO90/11777公开了一种用于获得非装配菌毛亚单元的方法，该菌毛亚单元可以用作粘膜炎莫拉氏菌和其它细菌的疫苗。
需要开发一种无毒但具有免疫原性的粘膜炎莫拉氏菌疫苗，用于预防哺乳动物，特别是儿童及成人中耳炎、鼻窦炎以及类似呼吸道感染。尽管来自其它微生物的LOS的脱毒方法已知，但是脱毒产物(即半抗原)的体内免疫原性通常很弱。因此，需要这样一种形式的粘膜炎莫拉氏菌LOS，它是脱毒的但其免疫原性足以激发哺乳动物体内的免疫应答，产生抗-LOS抗体，优选IgG。
根据本发明的另一方面，公开了一种分离自粘膜炎莫拉氏菌并通过除去其中酯-连接的脂肪酸脱毒的脂寡糖，或者一种通过除去LOS中的脂质A获得的寡糖。在一个实施方案中，所述的分离出脂寡糖的粘膜炎莫拉氏菌是粘膜炎莫拉氏菌的纯化菌株。
根据本发明的另一方面，公开了一种用于预防粘膜炎莫拉氏菌感染引发的哺乳动物中耳炎的方法，其中包括向哺乳动物施用有效免疫保护量的偶联疫苗，该偶联疫苗中包括一种通过脱酯处理由粘膜炎莫拉氏菌LOS制备而成的脱毒脂寡糖(dLOS)，或者一种通过除去LOS中脂质A制备而成的寡糖(OS)，以及一种共价连接于上述dLOS或OS上的免疫原性载体。在一个优选实施方案中，所述哺乳动物为人。在另一个实施方案中，所述偶联疫苗通过非肠道途径施用。在一个实施方案中，所述偶联疫苗通过肌肉内注射、皮下注射，或者通过沉积在鼻内粘膜或这些方法的结合来施用。另一个实施方案中所述的有效免疫保护量每剂为约10μg～50μg。所述方法还可以包括在约两月时注射约10μg～25μg偶联疫苗，并在这次接种后第13个月再接种一次。在一个实施方案中，所述接种步骤包括接种第一剂，然后在第一剂约两月后再接种第二剂约10μg～25μg偶联疫苗，然后在第二剂后约两月接种第三剂约10μg～25μg偶联疫苗，然后在第三剂后约12个月接种第四剂量约10μg～25μg偶联疫苗。
根据本发明的另一方面，公开了一种用于对从粘膜炎莫拉氏菌分离的脂寡糖(LOS)进行脱毒的方法，其中包括从LOS中除去连接有酯的脂肪酸。一个实施方案中，用肼或弱碱试剂除去连接有酯的脂肪酸。
本发明还包括一种用于对来自粘膜炎莫拉氏菌的LOS进行脱毒的方法，包括从LOS中除去脂质A制备出OS。在一个实施方案中，通过酸处理除去脂质A。
根据本发明的另一方面，公开了一种制备粘膜炎莫拉氏菌偶联疫苗的方法，其中包括将分离自粘膜炎莫拉氏菌的脂寡糖(LOS)中的连接有酯的脂肪酸除去从而制备出去酯化的LOS(dLOS)；并且将得到的dLOS共价连接到免疫原性载体上。在一个实施方案中，上述的除去步骤中包括用肼或弱碱试剂处理LOS。在一个实施方案中，上述的连接步骤包括将dLOS结合到一种接头化合物上，并将该接头化合物结合到免疫原性载体上。优选地，所述接头化合物为己二酸二酰肼、ε-氨基己酸、氯己醇二甲基乙缩醛、D-葡糖醛酸内酯和对硝基苯乙胺，以及更优选地，所述接头化合物是己二酸二酰肼。在另一个实施方案中，所述疫苗组合物可以包括一种佐剂。
本发明还提供了一种用于预防由粘膜炎莫拉氏菌感染引发的哺乳动物中耳炎的偶联疫苗，其中包括一种分离自粘膜炎莫拉氏菌的脂寡糖(LOS)和一种与其共价连接的免疫原性载体，所述脂寡糖已通过除去酯化脂肪酸脱毒生成为一种脱毒LOS(dLOS)，或者通过除去脂质A生成为一种寡糖(OS)。优选地，所述免疫原性载体是一种蛋白质。在该优选实施方案的一个方面，免疫原性载体为分离自粘膜炎莫拉氏菌的UspA、分离自粘膜炎莫拉氏菌的CD、破伤风毒素/类毒素、分离自非获得型流感嗜血杆菌的高分子量蛋白(HMP)、白喉毒素/类毒素、脱毒后的绿脓杆菌(aeruginosa)毒素A、霍乱毒素/类毒素、百日咳毒素/类毒素、产气荚膜梭状芽胞杆菌外毒素/类毒素、乙肝表面抗原、乙肝核心抗原、轮状病毒VP 7蛋白、包括CRM197(Pappenheimeret al.,Immimochem.9:891-906,1972)和CRM3201(Black et al.,Science240:656-659,1988)等的CRMs(交叉反应物质)、或呼吸合胞病毒F和G蛋白。优选地，所述免疫原性载体蛋白为破伤风类毒素或HMP。
附图简述
图1图示的是针对粘膜炎莫拉氏菌菌株25238的兔抗血清的杀菌滴度，血清取自2～3只的一组试验兔，其中该组中每个成员均用下列物质单独接种两次LOS(＂LOS＂)、偶联物(“dLOS-TT”和＂dLOS-HMP＂)，或者加佐剂的偶联物(＂dLOS-TT+Ribi＂and＂dLOS-HMP+Ribi＂)。基于导致50％以上细菌杀死的血清稀释度，各组的杀菌滴度示为超过免疫前血清的值的增加倍数并表示为几何平均值(棒形图)和标准偏差(棒形图上的线形图)。粘膜炎莫拉氏菌全细胞激发生成的超免疫血清的杀菌滴度为1∶1,600。
图2为用粘膜炎莫拉氏菌菌株25238气溶胶攻击时，小鼠肺清除模型的被动保护试验图。用抗dLOS-TT兔抗血清或免疫前血清免疫40只小鼠，然后在免疫后18小时，用粘膜炎莫拉氏菌菌株25238通过气溶胶室攻击。攻击后3及6小时时处死小鼠。
FIG.3显示的是图2图例中描述的被动保护试验的结果。采集肺和血样用于分析。y-轴表示每个肺中的菌落形成单位(CFU)。第一个棒形图为对照组，第二个棒形图为疫苗组。攻击后3小时，疫苗组中细菌的量与对照组相比减少了50％。攻击后6小时，疫苗组中细菌的量与对照组相比减少了61％。
发明详述粘膜炎莫拉氏(布拉汉氏)菌的脂寡糖(LOS)是一种主要表面抗原，它激发抗能够导致儿童中耳炎和鼻窦炎以及成人呼吸道感染的细菌的杀菌性抗体。简便起见，上述细菌在下文中简称为粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis或Mcatarrhalis)。分离并处理粘膜炎莫拉氏菌LOS，用鲎属变形虫样细胞溶解物试验测试毒力减小了约20,000倍。将脱毒后的LOS(dLOS)通过一种连接化合物偶联到载体(例如，破伤风类毒素或从非获得型流感嗜血杆菌中纯化而来的高分子量蛋白)上形成dLOS-TT或dLOS-HMP。得到的偶联物中dLOS与TT和HMP之间的摩尔比分别为19∶1和31∶1。双向免疫扩散试验结果表明，这两种偶联物的抗原性与分离的LOS相当。对于这两种dLOS-载体而言，皮下(s.c.)或肌内(i.m.)注射动物可以激发抗LOS免疫球蛋白G(IgG)平均水平的升高。小鼠体内，注射3次上述偶联物后，检测到平均IgG水平升高了50～100倍，兔子体内，注射两次后IgG水平升高了350～700倍。向偶联物制剂中加入佐剂，可增强偶联物的免疫原性。
在兔子体内，免疫偶联物后产生的抗血清诱发了针对粘膜炎莫拉氏菌同源或异源菌株的补体-介导的杀菌活性。这些结果表明，脱毒后的LOS-蛋白偶联物可以用作一种用于免疫预防粘膜炎莫拉氏菌-引发疾病的疫苗。
用一株纯化的A型粘膜炎莫拉氏菌(ATCC 25238，来自美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection),Rockville,MD)作为示范性来源，用标准方法(Edebrink,P.,et al.,1994,Carbohycir.Res.257:269-284；Masoud,H.,et al.,1994,Can.J.Chem.72:1466-1477)纯化LOS。其它已知粘膜炎莫拉氏菌株，其中有许多来自ATCC或其它保藏处，或者用熟知的细菌学方法获得的纯化临床菌株也在本发明的范围之内，用作LOS的来源。简要地说，将粘膜炎莫拉氏菌株25238在巧克力琼脂上培养8小时，然后接种到3％胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)。37℃振荡过夜温育。进一步稀释培养物并转移到装有TSB的挡板烧瓶中，37℃继续振荡培养24小时。离心收集细胞，按照标准方法，用乙醇、丙酮和石油醚洗涤细胞沉淀(如Masoud,H.,et al.在1994,Can.J.Chem.72:1466-1477中所述)，然后将其干燥成粉末。用经过改进(Gu,X-X.,1995,Infect.Immun.63:41154120)的标准热酚-水法(Westphal,O.,et al.,1965,Methods Carbohydr.Chem.5:83-91)，从细胞中提取LOS，得到蛋白或核酸含量低于1％的LOS(Smith,P.K.,et al.,1985,Anal.Biochem.150:76-85；Warburg,O.& W.Christian,1942,Biochem.Z.310:384-421)。可以用其他已知的纯化LOS的方法代替本发明所述的方法。
尽管本发明描述的是用肼对来自粘膜炎莫拉氏菌的LOS进行脱毒的方法，但是使用任意一种能除去脂质A中的酯化脂肪酸的试剂或酶的方法，例如弱碱处理，即用pH13.2～13.6的稀(0.1N)NaOH或其他稀碱水溶液处理，也在本发明的范围之内。重要的是，脱毒条件必须足够温和，以保证不会水解LOS的寡糖部分。寡糖的水解会破坏保护性表位。在与上述温和条件基本相同的条件下，用无水肼处理，对分离的粘膜炎莫拉氏菌LOS脱毒(Gu,X.X,et al.,1996,Infect.Immun.64:4047-4053；Gupta,R.K.,et al.,1992,Infect.Immun.60:3201-3208)。简单地说，将LOS悬浮于无水肼中并在1℃～100℃的温度范围内温育，优选25℃～75℃，更优选约37℃。混合温育10分钟～24小时，优选约2小时～约3小时，然后冷却混合物，加入冷丙酮至形成沉淀，离心收集改沉淀物。用丙酮洗涤沉淀，溶于水，然后超离心。将超离心后得到的上清液冻干，重溶，并进行柱层析，收集洗脱出的含碳水化合物的馏分，冻干，命名为dLOS。称重，dLOS的重量约为LOS的38％。
或者，可以使用pH约为2～3的稀或弱酸水溶液，弱酸处理对LOS进行脱毒，具体描述见Gu et al.(Infect.Immu～61:1873-1880,1993)，该方法可以除去脂质A得到寡糖(OS)。然后用与dLOS相同的方法将这种OS偶联到载体上。尽管本发明中描述的是使用乙酸除去粘膜炎莫拉氏菌LOS中的脂质A，但是使用任意一种能除去脂质A的试剂或酶的方法都在本发明的范围之内。所述OS-蛋白偶联物在小鼠和兔子体内也都具有免疫原性，可以激发抗LOS和载体蛋白的抗体。在小鼠中，偶联物(加佐剂)-免疫血清表现出针对同源性粘膜炎莫拉氏菌株25238的杀菌活性。在兔子中，偶联物-免疫血清表现出同源性菌株25238的杀菌活性。
就dLOS或OS偶联物的制备而言，dLOS可以直接共价连接到载体蛋白上，例如，使用如戊二醛等交联试剂。优选地，选用各种已知方法中的任意一种(例如，见Marburg et al.,1986,J.Am Chem Soc.108:5282，和美国专利US4,882,317；US 5,153,312；US 5,204,098)，使用接头化合物将dLOS或OS与载体隔离开从而制备出dLOS或OS偶联物。接头化合物的存在促进dLOS或OS有效偶联到载体上，优化偶联物的免疫原性。接头化合物具有长度及柔性可按需调整的侧链，可以隔离碳水化合物和载体成分。接头物可以增强偶联抗原的平动及转动特性，从而增加抗体的结合途径。在双功能位点之间，所述接头物侧链可以包括各种结构特征，包括杂环原子和开裂位点。尽管己二酰肼(ADH)是一种优选接头物，但是其他合适接头还包括，例如ε-氨基己酸、氯己醇二甲基乙缩醛、D-葡糖醛酸内酯和对硝基苯乙胺等杂双功能接头物。尝试用于本发明的偶联试剂包括羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺。许多合适接头物和偶联试剂对于本领域普通技术人员来说都是已知的(Dick et al.,conjugate Vaccines,J.M.Cruse & R.E.Lewis,Jr.,eds.,Karger,New York,pp.48-114,1989)。
在一个优选实施方案中，首先用己二酰肼(adipic dihydrazide)(ADH)对dLOS或OS进行衍生，ADH充当蛋白载体之间的接头物。简而言之，用已知方法，将己二酸二酰肼(ADH)连接到dLOS或OS的Kdo部分的羧基上形成AH-dLOS或H-OS衍生物(Gu,XX,& C.M.Tsai,1993,Infect.Immun.61:1873-1880)。使用摩尔数过量的ADH，以确保更有效地偶联并且限制dLOS-dLOS偶联。反应混合物中，ADH与dLOS或OS之间的摩尔比典型地为约10∶1～约250∶1，优选为50∶1～约150∶1，更优选约100∶1。在一个优选实施方案中，每个dLOS或OS对应1个ADH存在于AH-dLOS偶联物中。在另一个优选实施方案中，最终的dLOS-载体偶联物中，dLOS或OS与载体之间的摩尔比为约15～约100，在优选的约20～约50的下限与优选的约40～约75的上限之间，优选约25～约50，更优选约50。通常，通过改变AH-dLOS或AH-OS和载体的起始浓度以及反应时间，来控制上述摩尔比。通常，在这些范围内，上述摩尔比与体内对该偶联物的抗体应答之间正相关(即，摩尔比越大，应答约强)。通过柱层析，从上述反应混合物中纯化出衍生后的dLOS或OS，得到同时含有碳水化合物和己酰肼(adipichydrazide)的洗脱馏分(Kemp,A.H.& M.R.A.Mo rgan,1986,3.Immunol.Methods 94:65-72)。收集这些馏分，冻干，命名为AH-dLOS或AH-OS。
尽管本发明的优选实施方案是连接到蛋白质上的粘膜炎莫拉氏菌dLOS或OS，更优选从流感嗜血杆菌中纯化而来的破伤风类毒素(TT)或高分子量蛋白(HMP)，但是本领域中已知的各种载体也适合于制备本发明的dLOS-或OS-载体偶联物。HMP是一组表面暴露的高分子量蛋白，它们是从感染了流感嗜血杆菌的个体中获得的人康复期血清中的主要抗体目标(结构和功能的进一步限定见S.J.Barenkamp,1992,J.Infect.Dis.165(Suppl.1):S181-184)。载体能够增强寡糖的免疫原性，而且抗载体产生的抗体可以用于医疗方面。所述载体可以是水溶性或不溶性的。合适的天然或合成多聚合物免疫原性载体包括，例如，含有伯氨基和/或仲氨基、叠氮基或羧基的物质。
各种免疫原性载体蛋白中的任意一种都可以用于制备本发明所述的dLOS-或OS-载体偶联物。这些蛋白包括，例如菌毛、外膜蛋白以及病原菌的分泌毒素、这类分泌毒素的无毒或“类毒素”形式、类似于细菌毒素的抗原性无毒蛋白(已知称为交联反应物质或CRMs)以及其他蛋白质。优选分离自革兰氏阴性菌的外膜蛋白。优选的外膜蛋白包括分离自粘膜炎莫拉氏菌的UspA和CD。类毒素也是优选的。尝试用于本发明的细菌毒素与类毒素的非限制性实例包括，例如，破伤风毒素或类毒素、白喉毒素或类毒素、脱毒后的绿脓杆菌毒素A、霍乱毒素或类毒素、百日咳毒素或类毒素以及产气荚膜梭状芽胞杆菌外毒素或类毒素。另外本发明还尝试了用病毒蛋白(乙肝表面或核心抗原、轮状病毒VP 7蛋白以及呼吸合胞病毒(RSV)F和G蛋白)作为载体。
CRMs包括类似于白喉毒素的抗原性CRM197(Pappenheimer Etal.，上述)以及百日咳毒素的遗传学操作突变形式CRM3201(Black etal.，上述)。来自哺乳动物的免疫原性载体蛋白，例如匙孔血蓝蛋白、鲎血蓝蛋白(horseshoe crab hemocyanin)以及植物麻仁球蛋白也在本另外，还设想了多种用于制备粘膜炎莫拉氏菌dLOS-或OS-蛋白偶联物的偶联方法。例如，本发明中出现的，用AH对dLOS或OS进行衍生化，然后将其连接到TT或HMP上。或者，用于制备合适dLOS-或OS-蛋白偶联物的另一种方法包括dLOS的胱胺衍生化，EDC-介导的衍生化作用，然后二硫化偶联到N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸盐-衍生化后的蛋白质上。其他众所周知的用来将寡糖偶联到免疫原性载体蛋白上的方法也在本发明的范围之内，具体描述见，例如美国专利No.5,153,312、美国专利No.5,204,098；以及欧洲专利EP 0497525；和EP 0245045。
将AH-dLOS或AH-OS偶联到破伤风类毒素(TT)上或来自流感嗜血杆菌的高分子量蛋白(HMP)上形成偶联物(Gu,X.X.,& C.M.Tsai,1993,Infect.Immun.61:1873-1880)。反应混合物中，AH-dLOS或AH-OS与蛋白成分之间的摩尔比典型地为约10∶1～约250∶1，优选为50∶1～约150∶1，更优选约100∶1。例如，按照AH-dLOS与偶联蛋白之间约100∶1的摩尔比，将溶解于水中的AH-dLOS与TT或HMP混合。然后，将pH调至5.4±0.2，并在1～3小时的时间段内，将1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入到搅拌的反应混合物中。将反应混合物调至pH7.0，离心，并用柱层析纯化。收集含有蛋白质和碳水化合物的峰，根据偶联物中使用的蛋白不同命名为dLOS-TT或dLOS-HMP。用dLOS和BSA作为参照物，用常规方法分析偶联物中的碳水化合物和蛋白组成(Dubois,M.,et al.,1956,Anal.Biochem.28:250-256；Smith,P.K,et al.,1985,Anal.Biochem.150:76-85)。
本领域技术人员能够理解到，偶联到载体上的dLOS或OS可以从单个粘膜炎莫拉氏菌株或者多种菌株开始，制备出多价混合物。或者，可以使用用于制备单一偶联物的单一来源dLOS或OS，单独制备dLOS-或OS-载体偶联物，然后可以将不同偶联物混合制备出含有多于一种类型的dLOS-或OS-载体偶联物的疫苗。这种情况下，可以制备出含有一种或多种已知抗原类型的粘膜炎莫拉氏菌LOS的疫苗。
用标准的SDS-PAGE及银染色技术对纯化后的dLOS定性，并将其与纯化后的LOS进行比较，具体操作基本同上所述(Tsai,C.M.& C.E.Frasch,1982,Anal.Biochem.119:115-119)。在凝胶上分离粘膜炎莫拉氏菌LOS(25,50,100和200ng)和dLOS(20μg)的等分溶液，该凝胶上还含有明尼苏达州沙门氏菌LPS Ra和Re作为标准参照物。每个含有粘膜炎莫拉氏菌LOS的泳道中都出现了一个Mr约为4,000的单一条带(Edebrink,p.et al.,1994,Carbohydr.Res.257:269-284)，但是含有20μg dLOS的泳道在LOS的位置处未出现可检测到的条带。相反，含有20μg dLOS的泳道在明尼苏达州沙门氏菌LPS Ra条带的水平处出现了一条模糊的条带。这些结果表明dLOS样品中粘膜炎莫拉氏菌的残留量小于0.25％。
用标准鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)试验(Hochstein,H.D.,etal.,1973,Bull.Parenter.Drug Assoc.27:139-148)，测试分离LOS和dLOS的毒性。当使用可从U.S.F.D.A获得的标准物时，LAL试验的敏感度为0.2EU/ml。分离的LOS为20,000EU/μg，而dLOS为1EU/μg，表明毒性降低了20,000倍。优选地，毒性降低了约500～1000倍EU/□g或更多的组合物可以用于制备疫苗。这类如用LAL试验测定出的体外毒性降低的现象，与体内毒性降低及可接受水平相关。用标准的体内热原测试方法能够容易地测定出体内毒性(例如，兔子体内，使用剂量为0.1μg～1μg/kg体重)。
使用抗粘膜炎莫拉氏菌全细胞(菌株25238)的兔子超免疫血清，用双向免疫扩散方法测试dLOS、AH-dLOS以及dLOS-TT和dLOS-HMP偶联物的抗原性。用标准方法制备超免疫血清。简单地说，用109M的粘膜炎莫拉氏菌全细胞(菌株25238)和非完全氟氏佐剂(体积比为1∶1)乳液，对两只新西兰大白兔皮下和肌内两次注射(每次注射都进行皮下和肌内注射)，两次间隔为4周。每次注射前及注射后2周收集血样。
在溶于磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)中的0.8％琼脂糖凝胶上，用标准方法进行双向免疫扩散。该试验中，中心孔中加入抗粘膜炎莫拉氏菌全细胞的兔超免疫血清，周围孔中各自加入LOS、dLOS-TT、dLOS-HMP、dLOS和HMP。在双向免疫扩散试验中，超免疫血清与LOS反应，产生一条明显的、易检测沉淀带。类似地，超免疫血清与dLOS反应，产生一条稍宽一点的沉淀带，表明分离后的dLOS保留了分离后的LOS的抗原性。与LOS比较时，超免疫血清还与dLOS-TT和dLOS-HMP偶联物反应，生成一条相同的沉淀带。但是，超免疫血清与分离后的HMP之间未发生可测量的反应。
另外，对此前公开的方法(Gu,X.X.,et al.,1996,Infect.Immun64:4047-4053)稍做改动，用酶联免疫吸附法(ELISA)测量抗原性。用LOS包被ELISA平板，然后用3％BSA封闭。然后，将ELISA孔与用稀释后的兔血清温育，随后加入碱性磷酸酶-偶联的山羊抗-兔IgG和IgM(Sigma)。在上述所有步骤之间，用含聚合物分散试剂(0.01％Tween-20)的PBS充分重复洗涤各孔。用30分钟，加入酶底物，然后在A405处对反应进行定量。用偶联物作为包被抗原以及稀释后的兔免疫血清作为结合抗体，类似地测定dLOS-载体偶联物的抗原性。这两种dLOS-载体偶联物都表现出了可比较的与兔超免疫血清间的结合，并且在同样条件下dLOS-载体偶联物的抗原性高于LOS。
为了测定体内抗原性，将dLOS-载体偶联物通过非肠道途径注射到小鼠和兔子体内，随后用ELISA测定动物血清中抗-LOS抗体的水平。在小鼠中，dLOS和TT或HMP的非偶联混合物不能激发抗-LOS抗体的生成。相反，dLOS-TT和dLOS-HMP这两种偶联物在第二次注射后都激发生成了低水平抗-LOS IgG。第三次注射偶联物后，抗-LOS IgG的水平升高了50～100倍。注射3次后，dLOS-TT和dLOS-HMP都激发生成了类似水平的抗-LOS IgG。单独LOS与LOS-载体偶联物激发生成的抗-LOS IgG水平近似。
加入了佐剂的dLOS-TT和dLOS-HMP偶联物制剂都显著地增强了小鼠体内的免疫原性。也就是说，带有佐剂的2次剂量的dLOS～载体偶联物激发生成的抗体水平相当或高于单独使用3次剂量偶联物的抗体水平。与注射3次不含佐剂的同样偶联物后得到的水平相比，注射3次带有佐剂的dLOS～载体偶联物后，抗-LOS IgG水平升高了约9～15倍。注射3次偶联物-佐剂制剂后，dLOS-TT偶联物激发生成的IgG水低于dLOS-HMP偶联物。
使用的佐剂包括单磷酰脂质A和海藻糖二霉菌酸酯(商品名称为Ribi-700，购自Ribi Immunochemical Research,Hamilton,MT)。其他众所周知的标准佐剂也在本发明尝试的范围之内，例如，铝化合物(即明矾)、经过化学修饰的脂多糖、杀死的百日咳博德特氏杆菌悬液、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酸以及本领域普通技术人员已知的其他佐剂。另外的佐剂的描述参见Warren等(Ann.Rev.Biochem.4:369-388,1986；New Generation Vaccines,2nd Edition,Leine,M.M.et al.,Eds.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1997)。优选使用铝化合物，特别优选适用于人的佐剂。当分析小鼠血清中的IgM水平时，偶联物在每次注射后激发低至中度水平抗-LOS抗体的平均水平，而LOS在第三次注射后激发生成了高水平的抗-LOS IgM。向dLOS-蛋白偶联物中加入佐剂提高了第二次注射后产生的抗-LOS IgM水平。
当类似地对小鼠血清中抗dLOS-蛋白偶联物中蛋白成分(TT或HMP)的抗体进行测试时，发现了抗-蛋白抗体。就抗-TT抗体而言，dLOS-TT在第一次注射后激发生成了低水平的IgG，而在第二次或第三次注射后该水平明显升高。与接受了同样偶联物但未接受佐剂的小鼠相比，注射带有佐剂的dLOS-TT能够提高dLOS-TT注射组中的IgG水平。TT和dLOS的非偶联混合物激发产生的抗-TT IgG水平高于dLOS-TT激发产生的水平。所有的免疫原都激发生成了低水平的抗-TTIgM，注射液中加入佐剂后，其水平升高。
当类似地对小鼠血清中的抗-HMP抗体水平进行测试时，dLOS-HMP在第一次注射后激发生成了低水平的IgG，第二次和第三次注射后抗-HMP IgG水平显著升高。佐剂的加入提高了接受dLOS-HMP偶联物的小鼠体内的IgG水平。在加入或不加佐剂的情况下，HMP和dLOS的非偶联混合物激发生成的抗-HMP IgG水平都高于接受dLOS-HMP的小鼠中观察到的水平(见下列表2)。所有免疫原都激发生成了低水平的抗-HMP IgM。
另外，在兔子皮下和肌内注射dLOS-蛋白偶联物的0和1个月后测定了免疫原性(每次注射均同时进行皮下和肌内)。在0时(即首次注射时)、首次注射后两周以及第二次注射后两周，收集血样。使用测量小鼠血清时所用的ELISA方法，测定注射下列免疫原(每种免疫原每次都注射50μg)后获得的兔血清中的IgM和IgG水平LOS,dLOS-TT，含佐剂的dLOS-TT,dLOS-HMP，含佐剂的dLOS-HMP,dLOS、TT和HMP的非偶联混合物，或者粘膜炎莫拉氏菌全细胞。dLOS、TT和HMP的混合物或LOS本身在两次注射后都激发生成了低水平的抗-LOS IgG或IgM抗体。与注射前的血清水平相比，第一次和第二次注射后dLOS-TT偶联物激发生成了显著升高的抗-LOS IgG。注射dLOS-HMP偶联物激发生成的IgG水平低于注射dLOS-TT偶联物时的水平。加入佐剂后，对于两种偶联物来说，每次注射后激发生成的抗-LOS IgG水平都变高，带有佐剂的两次注射后这两种偶联物之间无明显的差异。就IgM而言，两种偶联物都激发生成了低至中等水平的抗-LOS抗体，与注射不含佐剂的同种偶联物相比，加入佐剂通常能提高每次注射后检测到的抗-LOS IgM抗体的水平。
当类似地对兔血清中抗dLOS-蛋白偶联物中蛋白成分的抗体进行测定时，发现了抗-蛋白抗体。就抗-TT抗体而言，第一次注射后dLOS-TT激发生成了低水平的IgG，在第二次注射后该水平显著升高。与注射时不加入佐剂相比，注射加入佐剂的dLOS-TT后，检测到的抗-TT显著升高。注射TT、dLOS和HMP的非偶联混合物激发生成的抗-TT I IgG高于dLOS-TT激发生成的水平，但低于第二次注射后加入佐剂后的dLOS-TT激发生成的水平。所有免疫原都激发生成了低至中等水平的抗-TT IgM。
就兔血清中发现的抗-HMP抗体而言，dLOS-HMP在第一次注射后激发低水平IgG，第二次注射后，该水平显著升高。在dLOS-HMP中加入佐剂提高了抗-HMP IgG抗体的水平。HMP、dLOS和TT的混合物激发生成的抗体水平高于注射不含佐剂的dLOS-HMP时的抗体水平，但是略低于带有佐剂的dLOS-载体偶联物。所有免疫原都激发生成了低至中等水平的抗-HMP IgM。
用标准方法(Gu X-X.,et al.,1996,Infect.Immun.64:4047-4053)，测试用小鼠及兔子制备得到的抗血清针对同源或异源粘膜炎莫拉氏菌的体外杀菌活性。在兔子模型中，用LOS或非偶联的dLOS免疫后制备的血清没有表现出针对同源粘膜炎莫拉氏菌株的杀菌活性。相反，用dLOS-TT免疫后激发生成的血清在平均滴度为1∶16(不含佐剂)及1∶40(加入佐剂)时表现出了杀菌活性。用ELISA测定的抗-LOSIgG水平与检测到的杀菌滴度相关。
抗血清针对分离自不同地区(例如，日本)的同源或异源菌株的杀菌活性表明，用dLOS-蛋白偶联物激发生成的兔血清表现出的杀菌活性高于用类似方法制备的小鼠血清。所有偶联物-诱导的兔血清都表现出了针对同源粘膜炎莫拉氏菌株的杀菌活性，而典型血清表现出了针对大多非同源菌株的杀菌活性(10个ATCC菌株及临床分离株中的9个)。相反，不足一半的dLOS-载体偶联物-诱导的血清表现出了针对同源菌株的杀菌活性。通常，杀菌滴度与抗LOS IgG抗体水平之间相关。
使用另外的20个粘膜炎莫拉氏菌株(10个野生型ATCC菌株和10个临床分离株)，对配了佐剂后的dLOS-′IT激发生成的兔抗血清的杀菌活性进行测定。20个菌株中的10个为补体或血清敏感菌株。使用其余的10个菌株时，在平均滴度为1∶15(范围为1∶2～1∶32)时，兔抗血清表现出针对4个ATCC及5个临床分离株的杀菌活性。
小鼠模型中，在注射3次dLOS-载体偶联物后，用dLOS-蛋白偶联物免疫小鼠制备的血清中有20％(20个小鼠中的4个)，以及用偶联物和佐剂免疫后制备的血清中有45％(20个小鼠中有9个)，表现出了针对同源粘膜炎莫拉氏菌株(ATCC 25238)的低滴度杀菌活性。
下面的实施例中出现的结果表明，脱毒化处理后，粘膜炎莫拉氏菌dLOS保留了抗原决定簇但不具有体内免疫原性。当将dLOS偶联到载体蛋白上时，这种dLOS组分具备了免疫原性。也就是说，粘膜炎莫拉氏菌dLOS-载体偶联物能够诱导针对哺乳动物LOS的显著IgG抗体应答。哺乳动物中，dLOS-载体偶联物激发生成了至少相当于LOS激发水平的抗-LOS IgG抗体。这种dLOS-蛋白偶联物在兔子体内的免疫原性要好于小鼠(即，向兔子体内注射2次这种偶联物后，抗-LOS抗体增加的倍数通常大于2次或3次注射同一种偶联物后小鼠体内观察到的抗-LOS抗体的增加倍数)。在这两种动物中，与注射不含佐剂的同种偶联物相比，注射加有佐剂的偶联物通常都能提高抗-LOS抗体的水平。dLOS-TT和dLOS-HMP偶联物激发生成了近似水平的抗-LOSIgG抗体，当在偶联物中加入佐剂时抗体水平升高。
本发明的粘膜炎莫拉氏菌dLOS-载体偶联物可以用作疫苗，诱导抗哺乳动物粘膜炎莫拉氏菌的免疫反应，特别是预防人中耳炎及呼吸道疾病。本发明中描述的制备这类dLOS-载体偶联物的方法可以用来生产这类疫苗。本发明中公开的方法也可以用于鉴定其他dLOS-载体偶联物(即dLOS与其他载体单元的偶联物)，这些偶联物可以用于诱导哺乳动物中针对粘膜炎莫拉氏菌的保护性免疫应答，特别是包括儿童在内的人体中的保护性免疫应答。能够理解到的是，粘膜炎莫拉氏菌的疫苗可以包括dLOS-载体偶联物，以及其他成分，例如，免疫原性惰性的药物学可接受试剂或临床可接受的佐剂。本领域技术人员还能理解的是，粘膜炎莫拉氏菌dLOS-载体偶联物可以与其他针对其他感染因子的免疫原活性成分联合(例如，制备一种针对粘膜炎莫拉氏菌以及一种或多种能引发儿童疾病的其他细菌或病毒的联合疫苗)；例如，用于预防细菌性中耳炎的粘膜炎莫拉氏菌、非获得性流感嗜血杆菌以及肺炎链球菌的三价疫苗。
就接种而言，dLOS-载体偶联物经非肠道途径接种。尽管各种接种途径包括，例如，肌内(i.m.)、皮下(s.c.)，腹膜内(i.p.)，经粘膜(例如，鼻内)以及经动脉接种都进行了尝试，但是优选经粘膜、皮下和肌内接种。就非肠道接种而言，dLOS-载体偶联物可以采用灭菌制剂的形式，例如，灭菌注射水溶液或油状悬液，加入或不加入佐剂。按照本领域众所周知的方法，用合适的分散或润湿剂以及悬浮剂配制这类悬液。所述灭菌制剂还可以用非肠道可接受稀释剂或溶剂，例如，1,3-丁二醇溶液，配制成无菌注射溶液或悬液。其他合适的稀释剂包括，例如，水、林格氏溶液和等渗的氯化钠溶液。另外，常规上还常用无菌的不挥发油(fixed oils)作为溶剂或悬浮介质。例如，任意一种品牌的不挥发油都可以使用，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，类似地还可以把油酸等脂肪酸用于注射制剂的制备中。就鼻内接种而言，按照各种常用方法中的任意一种，用惰性载体(例如，空气或碳氢化合物)对所述制剂进行气雾化处理。
本发明所述疫苗中的dLOS-载体偶联物可以呈可溶或微粒形式，或者可以引入到微球体或微胶囊中，包括脂质体。在一个实施方案中，接种的偶联物的剂量为约10μg～约100μg，优选约20μg～约50□g。在另一个优选实施方案中，接种量为约25μg～约40μg。确切剂量可以用本领域普通技术人员已知的常规剂量/应答方法测定出来，接种剂量通常以体重为基础，儿童尤其如此。
本发明所述疫苗可以接种到任一年龄的哺乳动物，适于在年轻哺乳动物中，特别是人诱导产生针对粘膜炎莫拉氏菌诱发的中耳炎或呼吸道感染的主动免疫应答。作为儿童用疫苗，dLOS-载体偶联物在约2～12月龄时接种，优选约2～6月龄。可能还将给予加强注射。典型地，在例如首次注射后约2月和约3月时进行约10μg～约25μg的两次加强注射。或者，在首次注射后2、4和6月时进行加强注射。另外还尝试了其他加强注射方案。
疫苗组合物中可以包括来自不同粘膜炎莫拉氏菌株的偶联物鸡尾酒组合，这样的疫苗组合物能够预防所有或大多数医学相关菌株。根据dLOS不同，现有3种不同类型的粘膜炎莫拉氏菌A、B和C型，它们分别占临床菌株的61％、29％和5％。如实施例6中所述，针对的一个菌株产生的抗血清能与一些但并非全部的其他菌株进行交叉反应。因此，可能使用不同偶联物的鸡尾组合。含有来自A和B型的dLOS或OS的偶联物的混合物能够覆盖所有医学相关菌株的90％，而含有来自A、B和C型的dLOS或OS的偶联物混合物能够覆盖所有医学相关菌株的95％。
如下面实施例7所述，用任一抗dLOS-TT的免疫抗血清免疫小鼠，进行被动保护试验，然后用粘膜炎莫拉氏菌株25238气溶胶室刺激。疫苗组中，观察到每个肺中的细菌CFU显著减少。这种小鼠肺清除模型能够模拟该细菌在人体内的天然转运。这种模型的优点在于其简单，可重复以及可通过气溶胶机械很好控制，可以在同一种攻击条件下对大量小鼠进行研究，并且在接种细菌时不需任何外科侵入性操作。
尽管无意限定到一种具体的行为或机理模型，但是应答dLOS-载体偶联物生成的杀菌抗体，特别是IgG可以渗出鼻咽粘膜表面。此时，上述抗体能够灭活粘膜表面上的粘膜炎莫拉氏菌接种物，从而预防或减轻粘膜炎莫拉氏菌诱发的中耳炎及呼吸道疾病的症状。分泌性IgA也可能在呼吸道粘膜免疫中发挥了作用，特别是当通过鼻粘膜接种该偶联疫苗时。
下述实施例能够阐明本发明的优选实施方案。
实施例1粘膜炎莫拉氏菌LOS的纯化及脱毒用(A型)粘膜炎莫拉氏菌株ATCC 25238作为纯化LOS的示范来源(Edebrink,P.,et al.,1994,Carbohydr.Res.257:269-284；Masoud,H.,et al.,1994,Can.J.Chem.72:1466-1477)。在37℃、5％CO2的条件下，在巧克力琼脂上培养该菌株8小时，然后转移到装在500mL培养瓶内的250ml 3％胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)中。将该培养瓶置于恒温振荡器(Model G-25,New BrunswickScientific,Co.,Edison,NJ)上37℃、110rpm培养过夜。将培养物转移到6个2.8升挡板Fernbach烧瓶中，每个烧瓶中各装有1.4升TSB。在37℃,110rpm下恒温振荡培养24小时。培养物在4℃下15,000×g离心10分钟收集细胞。
按照常规方法(基本同Masoud,H.,et al.,1994,Can J.Chem.72:1466-1477中的描述)，细胞沉淀用95％乙醇洗涤1次，用丙酮洗涤2次，并用石油醚洗涤2次，干燥成粉末。用改进的(Gu X-X.,1995,Infect.Immun 63:4115-4120)标准热酚-水法(Westphal,O.,et al.,1965,MethodsCarbohydr.Chem.5:83-91)，从细胞中提取LOS，得到所含蛋白或核酸成分低于1％的LOS(Smith,P.K.,et al.,1985,Anal.Biochem.150:76-85；Warburg,O.& W.Christian,1942,Biochem.Z.310:384-421)。
在温和的碱性条件下，用无水肼处理LOS，以便从脂质A中除去酯化脂肪酸(Gu,X.X.,et al.,1996,Infect.Immun.64:4047-4053；Gupta,R.K.,Et al.,1992,Infect.Immun.60:3201-3208)。简单地说，将LOS(160mg)悬浮在16mL无水肼(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)中，搅拌下在37℃温育3小时。将该悬液置于冰上冷却，滴加冷丙酮直至形成沉淀。将混合物在5℃下5,000xg离心30分钟。用冷丙酮洗涤沉淀2次，溶于无热原的水中终浓度为10-20mg/mL，然后在5℃下150,000xg超离心3小时。冻干上清液并经(1.6×90cm)Sephadex G-50(Pharmacia LKB Biotechnology,Uppsala,Sweden)柱上进行层析，用25mM乙酸铵洗脱，并用示差折射计(R400；Waters,Milford,Mass.)监测。用微量酚-硫酸法(Dubois,M.,et al.,1956,Anal.Biochem.28:250-256)对洗脱液中的碳水化合物进行分析。收集含有碳水化合物的馏分，冻干，命名为dLOS，它的重量为LOS的38％。
与温和的酸处理LOS通过开裂Kdo-葡糖胺键上切除LOS分子中的脂质A部分(即，Gu,X.X.,& C.M.Tsai,1993,Infect.Immun.61:1873-1880中所述方法)，再偶联到蛋白载体上后，用这种方法对粘膜炎莫拉氏菌LOS脱毒可以获得较高产率的dLOS。
实施例2dLOS的衍生以及与蛋白质的偶联按照下述方法，制备按照实施例1中方法制备的dLOS的己二酰阱(AH)衍生物，并纯化。用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟磺基-琥珀酰亚胺(磺基-NHS)，把己二酸二酰肼(ADH)连接到dLOS的Kdo部分的羧基上，形成AH-dLOS衍生物(Pierce)(Gu,X.X.,& C.M.Tsai,1993,InfecL Immun.61:1873-1880)。简单地说，将dLOS(70mg)溶于7mL 345mM ADH(ADH与LOS的摩尔比约100∶1，在估计dLOS为3,000Mr的基础上)(Edebrik,P.,etal.,1994,Carbohydr.Res.257:269-284)。加入磺基-NHS至浓度为8mM,pH调至4.8，并加入EDC至浓度为0.1M。搅拌反应混合物并于pH4.8下保持3小时。按照实施例1中的方法，将反应混合物调至pH7.0并在G-50上进行柱层析。对洗脱液中的碳水化合物和己二酰肼(adipic hydrazide)(AH)进行分析(Kemp,A.H.& M.R.A.Morgan,1986,J.Immunol.Methods 94:65-72)。收集同时含有碳水化合物和AH的馏分，冻干，命名为AH-dLOS。用AH和dLOS作为标准，测量AH-dLOS的组成。
按照下述方法将AH-dLOS偶联到蛋白质(TT和HMP)上。TT(Connaught Labs.Inc.,Swiftwater,Pa.)和HMP从非获得型流感嗜血杆菌菌株12中纯化而来(Barenkamp,S.J.,1996,Infect.Immun.64:1246-1251)。将AH-dLOS偶联到TT或HMP上形成偶联物(Gu,X.X.,& C.M.Tsai,1993,Infect.Immun.61:1873-1880)。简单地说，将AH-dLOS(30mg)溶于3mL水中，并与15mg TT(5.9mg/ml，或12mg HMP(4mg/ml)混合。AH-dLOS与TT(Mr为150K)andHMP(Mr为120K)之间的摩尔比为约100∶1。PH调至5.4，加入EDC至浓度为约0.05～0.1M。搅拌反应混合物，pH在5.6下保持1～3分钟。将反应混合物调至pH7.0，离心，并在0.9％NaCl中通过Sephacryl S-300层析柱(1.6×90cm)。收集同时含有蛋白和碳水化合物的峰，命名为dLOS-TT或dLOS-HMP。用dLOS和BSA作为标准，分析这两种偶联物中碳水化合物和蛋白的组成(Dubois,M.,et al.,1956,Anal.Biochem 28:250-256；Smith,P.K.,et al.,1985,Anal.Biochem.150:76-85)。
根据衍生产物中AH和dLOS或者偶联物中dLOS和蛋白质的测定量(μg/ml)，对衍生的AH-dLOS和dLOS-蛋白偶联物进行物理学分析。根据碳水化合物的含量，AH-dLOS的产率为93％。对于dLOS-TT，测量出103μg/ml dLOS和266μg/ml蛋白质；对于dLOS-HMP，测量出220μg/ml dLOS和280μg/ml蛋白质。使用dLOS、TT和HMP的分子量分别为3,000、150,000和12,000，用每摩尔蛋白质对应的dLOS摩尔数，计算出偶联物的摩尔比。两种偶联物制剂中dLOS相对于TT及HMP的摩尔比分别为19∶1和31∶1。用酚-硫酸法测量出dLOS的初始量以及偶联物中的含量，在此基础上计算出偶联物的产率。dLOS-TT和dLOS-HMP的产率分别为8％和19％。实施例3dLOS、衍生的dLOS以及dLOS-蛋白偶联物的抗原性用抗粘膜炎莫拉氏菌全细胞(菌株25238)的兔超免疫血清，通过双向免疫扩散和酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，测试dLOS、AH-dLOS以及偶联物的抗原性。超免疫血清制备方法同上所述。
在溶于磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)中的0.8％琼脂糖凝胶上，用标准方法进行双向免疫扩散。该试验中，中心孔中加入抗粘膜炎莫拉氏菌全细胞的兔超免疫血清，周围孔中分别加入下列物质1mg/mlLOS、103μg/ml dLOS-TT、220μg/ml dLOS-HMP(以dLOS的量为基础)、1mg/ml dLOS、200μg/ml dLOS以及500μg/ml HMP。在双向免疫扩散试验中，超免疫血清与LOS反应，产生一条明显的、易检测沉淀带。类似地，超免疫血清与dLOS反应，(在两个测试浓度下均)产生一条稍宽一点的沉淀带，表明分离的dLOS保留了分离的LOS的抗原性。超免疫血清与dLOS-TT及dLOS-HMP偶联物反应，生成清楚的沉淀带。双向免疫扩散中，这两种偶联物和LOS形成了基本相同的沉淀线。相反，超免疫血清与分离的HMP之间未发生可测量的反应。
用此前公开的(Gu,X.X.,et al.,1996,Infect.Immun.64:4047～4053)改进的方法进行ELISA试验。用LOS包被标准ELISA板上的各孔(Dynatech Laboratories,Inc.,Alexandria,VA)后，用溶于PBS中的3％BSA溶液封闭1小时，然后加入兔血清(1/8,000稀释度)温育2小时。随后加入碱性磷酸酶-偶联的山羊抗-兔IgG和IgM(Sigma)，温育1小时。在上述所述步骤之间，用含有0.01％Tween-20的PBS洗涤。血清和磷酸酶使用的稀释剂为溶于PBS 0.01％Tween-20的1％BSA。30分钟后，加入酶底物，然后用微孔板自动读数仪(EL309,Bio-TekInstruments)在A405处读取反应。按照A405处的ELISA反应性，类似地测定dLOS-载体偶联物的抗原性。用偶联物作为包被抗原(10μg/ml)以及将兔免疫血清作为结合抗体(1/8,000稀释度)。
就实施例3中所述的偶联物制剂而言，两种偶联物与兔超免疫血清之间都表现出了可比性结合。dLOS-TT的A405值为1.9,dLOS-HMP的A405值为1.3。同样条件下，LOS(10μg/ml)的A405数值为1.1。
接下来用动物模型，即用小鼠和兔子测定dLOS-蛋白偶联物的体内免疫原性。
Example 4:dLOS-蛋白偶联物在小鼠中的免疫原性5周龄雌性小鼠(NIH/Swiss)，每组10～20只，皮下注射5□g(基于糖)溶于0.2ml 0.9％NaCl中的下列物质dLOS-TT、dLOS-HMP、LOS或dLOS加TT或HMP(5μg蛋白质)的混合物，其中含有或不含佐剂。每次注射所用的佐剂中含有50μg单磷酰基脂质A(MPL)和50μg合成海藻糖dicorynomycolate(STD)，它存在与一种惰性载体(商品名称为Ribi-700，购自Ribi Immunochemical Research,Hamilton,MT)中。以3周的间隔注射3次，第一次注射后第14天，第二及第三次注射后第7天给小鼠放血。
血清抗-LOS水平表示为ELISA单位(EU)，用分离自25238菌株的LOS作为包被抗原。作为参照，使用抗25238菌株全细胞的血清，其中的IgG和IgM的指派数值分别为65,000EU/ml和800EU/ml。用ELISA测量抗TT或HMP的血清抗体，其中TT或HMP(5μg/mL)作为包被抗原，并以参照小鼠血清(三次注射TT或HMP产生的)为基础表示为ELISA单位，参照血清中IgG和IgM的指派数值分别为2,000EU/ml和10EU/ml。
对于这些结果的统计学分析来说，抗体水平表示为n个独立观察数值的几何平均ELISA单位或滴度(交互的)±标准偏差或幅度(n＜4)。用双边t检测测量显著性，P值小于0.05视为显著。
如标1中数据所示，dLOS和TT或HMP的非偶联混合物不能激发生成抗-LOS抗体。第二次注射后，两种偶联物都激发生成了低水平的抗-LOS IgG，但在第一次注射后没有生成；第三次注射后，约升高50～100倍(P＜0.01)。3次注射后，dLOS-TT和dLOS-HMP都激发生成了类似水平的抗-LOS IgG。LOS本身同偶联物激发生成的抗-LOSIgG水平近似。
两种偶联物与Ribi佐剂的制品都显著地增强了它们的免疫原性带有佐剂的2次剂量的偶联物激发生成的IgG水平相当或高于单独使用3次剂量偶联物时的IgG水平，三次注射后的抗-LOS IgG水平升高约9～15倍(P＜0.01)。配有佐剂的情况下，3次注射后，dLOS-TT激发生成的IgG水平低于dLOS-HMP偶联物(P＜0.05)。
就IgM而言，每次注射后偶联物激发生成低至中等水平的抗-LOS，而LOS在第三次注射后激发生成较高水平的抗-LOS IgM。Ribi佐剂能够提高偶联物组中的抗-LOS IgM水平。表1．偶联物激发的针对粘膜炎莫拉氏菌LOS的鼠源抗体应答免疫原a血样b几何平均值(±SD幅度)cELISA单位IgG IgMdLOS+TT11 121 1(1-2)33 5(1-15)dLOS+HMP 11 121 1(1-2)31(1-2)1dLOS-TT11 125(1-19) 7(2-23)352(6-447)**17(3-91)dLOS-HMP 11 1(1-2)22(1～8)*6(2-19)3101(15-691)**17(5-63)dLOS-TF13(1-11)**2(1-4)+佐剂 2210(48-923)**16(62-396)3470(266-828) 14(8-25)dLOS-HMP 13(1-9)*9(2-39)+佐剂 2101(26-389)**22(6-84)31,514(299-7,658) 32(13-80)LOS11 3(1-9)28(2-40)*2(1-4)3113(20-630)**52(12-230)a用5μg LOS、5μg偶联物、5μg加Ribi佐剂的偶联物、LOS、或者dLOS与TT或HMP的混合物(各5μg)，对每组10～20只小鼠共给予三次皮下注射，间隔为3周。b收集血样1，首次注射后两周；2，第二次注射后1周；以及3，第三次注射后1周。c ELISA单位以抗菌株25238的参考血清为基础，用来自菌株25238的LOS作为包被抗原。用*和**标记的数据针对的是单一的免疫原，测量结果差异显著(P＜0.01)。
小鼠中的抗-蛋白抗体。如表2中列出的数据所示，dLOS-TT在第一次注射后激发生成低水平的抗-TT IgG抗体，第二及第三次注射后该水平显著升高(P＜0.01)。注射时加入Ribi佐剂能提高dLOS-TT组的IgG水平。TT和dLOS的混合物激发生成的IgG水平高于dLOS-TT组。所有免疫原均激发生成低水平的抗-TT IgM。
表2中还列出了对于抗-HMP抗体得到的结果。dLOS-HMP在第一次注射后激发生成低水平的IgG，第二及第三次注射后该水平显著升高(P＜0.01)。Ribi佐剂提高了dLOS-HMP组的IgG水平。HMP和dLOS的混合物激发生成的IgG水平高于dLOS-HMP。所有免疫原均激发生成了低水平的抗-HMP IgM。表2．偶联物激发的针对蛋白质(TT或HMP)的鼠源抗体应答免疫原a 血样b几何平均值(±SD幅度)ELISA单位IgG IgM抗-TTdLOS-TT1 1(1-2)12 34(21-54) 13 90(35-237)2(1-3)dLOS-TT1 14(6-35) 3+佐剂 2 303(191-481) 11(7-18)3 2,430 27(13-56)dLOS+TT1 11(7-18) 12 303(191-481) 1(1-2)3 729 2(1-3)抗-HMPdLOS-HMP 1 1 12 2(1-8)13 11(3-43) 1dLOS-HMP 1 4(2-9)2(1-6)+佐剂 2 52(30-92) 7(3-17)3 810(389-1,685)11(7-18)dLOS+HMP 1 2(1-6)2(1-3)2 377(149-952) 2(1-3)3 1,403(645-3,051) 10(7-14)a用5μg LOS、5μg偶联物、5μg加Ribi佐剂的偶联物、或者dLOS与TT或HMP的混合物(各5μg)，对每组10～20个只鼠给予三次皮下注射，间隔为3周。b收集血样1，首次注射后两周；2，第二次注射后1周；以及3，第三次注射后1周。
实施例5dLOS-蛋白偶联物在兔子体内的免疫原性向兔子(每组2～3只)按50μg/注射的量各注射皮下和肌内2次下列物质LOS、含或不含佐剂的dLOS-TT偶联物、含或不含佐剂的dLOS-HMP偶联物、dLOS加TT或HMP的混合物(各组分为50μg)，两次注射间隔为4周。对于所有不含佐剂的注射物来说，免疫原溶于1mL 0.9％NaCl中。对于含佐剂的注射物来说，免疫原溶于1mL 0.9％NaCl中，其中含有250μg单磷酰脂质A和250μg海藻糖二霉菌酸酯(Ribi-700佐剂，Ribi Immunochemical Research,Hamilton,MT)。每次注射后2周，用常规方法从耳静脉中采集10～20ml的血样。
如表3列出的结果所示，在两次注射后，LOS、TT和HMP的混合物或者LOS激发生成了低水平的抗-LOS IgG或IgM抗体。dLOS-TT偶联物在第一和第二次注射后激发生成了显著升高水平的抗-LOSIgG(比免疫前血清高37倍和700倍)。dLOS-HMP表现出的IgG水平低于dLOS-TT(分别比免疫前血清高6倍和347倍)。Ribi佐剂提高了两种偶联物每次注射后的抗-LOS IgG水平(分别比免疫前血清高40倍和2000倍)。2次注射后，这两种偶联物的应答之间无显著差异。
就IgM而言，两种偶联物都激发生成了低至中等水平的抗-LOS抗体，加有Ribi佐剂的偶联物每次注射后都激发生成了低至中等水平的抗-LOS抗体。表3．偶联物激发的针对粘膜炎莫拉氏菌LOS的兔源抗体应答免疫原a血样b几何平均值(幅度)ELISA单位IgG IgMLOS 06(3-10) 6(3-10)110(3-30)52(30-90)252(30-90) 90dLOS-TT 05(3-10) 14(10-30)1187(90-270) 9023,505(2,430-7,290) 187(90-187)dLOS-TT 010 5(3-10)+佐剂 1810(270-2,430) 389(270-810)221,870 270(90-810)dLOS-HMP07(3-10) 1043(30-90) 30(10-90)22,430 90(30-270)dLOS-HMP010(3-30)7(3-10)+佐剂 1389(30-2,430) 90(30-270)221,870 270(90-810)dLOS+TT+HMP 010(3-30)17(10-30)110(3-30)30252(30-90) 30全细胞 06(3-10) 101270 156(90-270)265,610 49(3-810)a在用50μg LOS、50μg偶联物、50μg加Ribi佐剂的偶联物、或者dLOS与TT或HMP的混合物(各50μg)，对每组中的2～3只兔子进行皮下及肌内注射免疫的0时及一个月后。抗粘膜炎莫拉氏菌的超免疫血清在本发明的前面部分已作描述。b收集血样0，注射免疫原之前；1，第一次注射后14天；以及2，第二次注射后14天。
兔的抗-蛋白抗体。如表4中列出的有关抗-TT抗体的数据所示，dLOS-TT在2次注射后激发生成了显著高水平的IgG(比免疫前血清水平高389倍)，Ribi佐剂在2次注射后使dLOS-TT激发生成的IgG水平提高了4倍。dLOS和TT的混合物激发生成的抗-TT IgG水平高于dLOS-TT偶联物，特别是在第一次注射后。所有免疫原均激发生成低水平的抗-TT IgM。
表4中还列出了抗-HMP抗体的数据，dLOS-HMP在2次注射后激发生成显著水平的IgG(比免疫前血清水平高81倍)，加入Ribi佐剂在2次注射后使dLOS-HMP激发生成的IgG水平提高了4倍。HMP和dLOS混合物激发生成的IgG水平高于dLOS-HMP，特别是在第一次注射后。所有免疫原均激发生成了低水平的抗-HMP IgM。表4．偶联物激发的针对粘膜炎莫拉氏菌LOS的兔源抗体应答免疫原a 血样b 几何平均值(幅度)ELISA单位IgG IgM抗-TTdLOS-TT03317(3-10) 1021,168(810-2,430) 14(10-30)dLOS-TT05(3-10) 3+佐剂 114(10-30)14(10-30)25,055(2,430-21,870) 10(3-30)dLOS+TT+HMP010 101270 9022,43030抗-HMPdLOS-HMP 010(3-30) 7(3-10)114(10-30)102810 10dLOS-HMP 07(3-10) 10(3-30)+佐剂 1130(30-270) 14(10-30)23,505(2,430-7,290) 30dLOS+TT+HMP010 101156(90-270) 3022,43052(30-90)a在用50μgLOS、50μg偶联物、50μg加Ribi佐剂的偶联物、或者dLOS与TT或HMP的混合物(各50μg)，对每组中的2～3只兔子进行皮下及肌内注射免疫的0时和一个月后。抗粘膜炎莫拉氏菌的免血清在本发明的前面部分已作描述。b收集血样0，注射免疫原之前；1，第一次注射后14天；以及2，第二次注射后14天。实施例6抗粘膜炎莫拉氏菌株的动物血清的杀菌活性该实施例中，测试了实施例4和5中制备的动物血清针对下列菌株的杀菌活性用于分离LOS的同种菌株(ATCC 25238；“同源株”)以及粘膜炎莫拉氏菌的其他野生菌株(“异源株”)。对11个粘膜炎莫拉氏菌野生型菌株(ATCC保藏号为8176,8193,23246,25238,25239,25240,43617,43618,43627,43628，和49143)(购自美国模式培养物保藏中心，Rockville,MD)，以及10个从中耳炎或呼吸道感染患者体内分离到的日本临床分离株(命名为M1～M10)(Goro Mogi惠赠，Oita Medical University,Japan)进行测试。本领域普通技术人员可以理解到，用常规生物学技术可以从临床样品中分离出粘膜炎莫拉氏菌的另外菌株并进行类似的测试。
对于杀菌活性试验来说，将兔免疫前和免疫后(2次注射后)血清在56℃温育30分钟，从而灭活其中的补体成分。然后用补体介导的杀菌试验，测试灭活血清针对粘膜炎莫拉氏菌的杀菌活性，试验方法与此前描述基本相同(Gu,X.X.；et al.,1996,Infect.Immun.64:40474053)，不同之处为，用豚鼠血清(1∶1稀释，每孔20μl)作为补体来源(Sigma,St.Louis,MO)以及在琼脂平板铺板之前将反应混合物在37℃下温育30分钟。导致50％以上杀死率的最高血清稀释度表示为交互杀菌滴度。
小鼠模型中，注射3次dLOS-TT或dLOS-HMP后，20％的偶联物免疫血清(20个小鼠中有4个)，以及45％的偶联物(加佐剂)免疫血清(20个小鼠中有9个)，表现出了针对同源菌株的低滴度杀菌活性。
图1以图显示表明，在兔子模型中，来自LOS(或dLOS)免疫的动物的血清没有表现出针对同源粘膜炎莫拉氏菌株(ATCC 25238)的杀菌活性，相反，dLOS-TT免疫血清却表现出了平均滴度为1∶16(未加佐剂)和1∶40(加入佐剂)的杀菌活性，dLOS-HMP-免疫血清表现出平均滴度为1∶10(未加佐剂)和1∶40(加入佐剂)的杀菌活性。LOS IgGELISA水平与杀菌滴度之间存在相关关系(r=0.60,P=0.02)，但IgM水平不与之相关。
使用另外10个野生型(ATCC菌株)和10个日本临床分离株，对配制了Ribi佐剂的dLOS-TT激发生成的兔抗血清的杀菌活性进行进一步测定。20个菌株中的10个为补体敏感(菌株23246,43617,M9)或血清敏感(菌株43627,43628,49143,M4,M7,M8,M10)菌株。使用其余的10个菌株时，在平均滴度为1∶15(范围为1∶2～1∶32)时，兔抗血清表现出针对4个ATCC及5个日本临床分离株的杀菌活性。该杀菌试验中有1个菌株(ATCC 25240)呈阴性。本发明用来显示杀菌活性的交叉试验表明，可以用相对少数的由不同菌株的LOS制备而成的偶联物，配制出一种能够为所有粘膜炎莫拉氏菌毒性菌株提供保护的疫苗(见第21页，底部)。实施例7小鼠肺清除模型的被动保护试验用抗dLOS-TT兔抗血清或免疫前血清免疫40只小鼠，然后在免疫后18小时，用108cfu粘膜炎莫拉氏菌菌株25238通过气溶胶室攻击。在攻击后3及6小时时杀死小鼠(图2)。采集肺组织和血样用于分析。结果见图3。在攻击后3小时，疫苗组中的细菌量与对照组相比减少了50％。在攻击后6小时，疫苗组与对照组相比减少了61％。在各时间点，对照组和疫苗组之间都存在明显差异。另外还对抗体水平进行了分析，抗体水平反过来与细菌cfu相关。这些结果表明dLOS-TT偶联物诱导的抗体加强了小鼠中粘膜炎莫拉氏菌的肺部清除。实施例8用粘膜炎莫拉氏菌dLOS-蛋白偶联物免疫人最初，选择成人测试其对于实施例1和2中制备的dLOS-载体偶联物或者实施例9-11中制备的OS-载体偶联物的安全性和免疫原性。筛选内源性抗体(例如由于儿童感染粘膜炎莫拉氏菌而生成)水平相对低的个体，选择与总人口相比相对低水平的成人用于研究。用溶于药物学可接受载体的dLOS-TT偶联物、dLOS-HMP偶联物、OS-TT偶联物或OS-HMP偶联物(25μg～50μg，视体重而定)对这些个体进行肌内注射。对于成人来说，注射1次通常激发生成足以表现出3天～2周的抗体应答。用基本相同于实施例4～6中描述的方法，测定得到的血清的免疫原性和杀菌活性。第一次注射后约1～6个月进行第二次注射，此后1周测量血清抗-粘膜炎莫拉氏菌抗体的水平。对照个体注射同样剂量的溶于同种药物学可接受载体中的上述偶联物中相应蛋白成分(单独)，并按照同样注射方案免疫成人。
对于接受dLOS-载体偶联物或OS-载体偶联物的个体而言，免疫后的血清抗体水平表明这些偶联物具有体内免疫原性而不产生不能接受的副作用。杀菌活性与来自这些个体的血清抗体相关。就这些个体而言，优选进行多次免疫以达到最佳免疫应答。相反，从接受对照注射的对照个体得到的血清未表现出任何免疫原性以及高于其注射前血清的抗-粘膜炎莫拉氏菌的杀菌活性。也就是说，与对照组相比，接受dLOS-TT偶联物、dLOS-HMP偶联物、OS-TT偶联物或OS-HMP偶联物的成人的抗血清表现出明显高的免疫原性或抗-粘膜炎莫拉氏菌杀菌活性。另外，数年内监测这些个体中耳感染的发生频率，在这段时间内，用dLOS-TT,dLOS-HMP,OS-TT或OS-HMP偶联物免疫过的成人无一例发生中耳感染。
在成人得到的抗血清结果的基础之上，将疫苗测试扩大到儿童，在2～4月龄之间肌注初始剂量的疫苗(量视体重而定，通常为10～40μg)，在初始免疫后2～4月进行两次加强接种。一组儿童接受在初始免疫后2、4和6月时接受3次加强接种。未接受疫苗的年龄相当的儿童作为对照。监测免疫后儿童的血清水平，并按照上述方法监测，结果表明同时具有免疫原性和杀菌活性。在从第一次接种到约4岁这段时间内，对这些儿童进行中耳炎和鼻窦炎测定。接受接种的儿童几乎不发生中耳炎和鼻窦炎，在这段时间内即使监测到中耳炎和/或鼻窦炎，其症状与对照组相比也较轻。实施例9酸水解粘膜炎莫拉氏菌25238制备寡糖(OS)用弱酸处理LOS，从Kdo-葡糖胺键处切除LOS分子中的脂质A(即Gu,X.X.,& C.M.Tsai,1993,Infect.Immun.61:1873-1880中所述的方法)，对粘膜炎莫拉氏菌LOS脱毒。简单地说，将421mg LOS溶于蒸馏水中至浓度为10mg/ml，然后在1％乙酸中100℃水解2～3小时。150,000xg离心3小时除去脂质A部分和未水解LOS。上清液冻干，溶于小体积的水中，一分为二，每份都在用25mM乙酸铵平衡过的Sephadex G-25柱(1.6×90cm)上进行层析。分析洗脱液中的糖含量、合并主要的OS馏分，冻干三次除去盐分。按重量计，OS从起始LOS中的产率为47％。
实施例10用ADH对OS进行衍化按照此前的描述(Gu et al.,1993，上述)，通过用EDC和磺基-NHS通过碳化二亚胺介导的缩合反应，将ADH偶联到OS上。用Bio-Gel P-4柱(1.6×90cm；Bio-Rad,Hercules,CA)纯化反应混合物。分析洗脱液中的糖及AH含量。合并同时含有糖和AH的峰，冻干3次除盐分。OS与ADH的比例约为1。AH-OS衍生物中糖的产率约为74％。实施例11:AH-OS与蛋白质的偶联在pH5.2±0.2的条件下，用0.1M EDC进行偶联反应。就OS-TT反应而言，将30mg AH-OS溶解于3ml蒸馏水中，并与15mg TT(5.90mg/ml)混合。就OS-HMP反应而言，将20mg AH-OS溶解于2ml水中，并与8.4mg HMP(4.2mg/ml)混合。AH-OS与TT或HMP之间的摩尔比为150或141比1(以分子量为基础OS为2,000,TT为150,000,HMP为120,000)。纯化步骤与实施例2中对dLOS-蛋白偶联物的描述相同。这些OS-蛋白偶联物具有与上述dLOS-蛋白偶联物相同的用途，即作为人粘膜炎莫拉氏(布拉汉氏)菌感染的疫苗。OS-TT和OS-HMP偶联物的组成、产率及抗原性见表5。表5．OS偶联物的组成、产率及抗原性Amt(ug/ml) 摩尔比a产率bA405c偶联物OS蛋白 OS/蛋白 (％) 超免疫血清OS-TT12315711 2.4 1.1OS-TT24315221 6.1 0.6OS-HMP1 4718216 8.8 2.0OS-HMP2 3211217 4.5 1.4a．比例表示为每摩尔蛋白对应的OS摩尔数，dLOS、TT、HMP分子量分别为2,000、150,000和120,000。b．用微量酚-硫酸法测量出基于OS的初始量以及偶联物中的OS含量。c．用偶联物作为包被抗原(10□g/ml)以及兔超免疫血清作为结合抗体(1/8,000稀释度)时，偶联物的抗原性表示为A405处ELISA反应值，在同样条件下，LOS(10ug/ml)表现出的A405数值为1.1。
OS-蛋白偶联物在小鼠和兔子中都激发生成了抗LOS的抗体应答。蛋白偶联物在小鼠和兔子中也都激发生成了抗TT和HMP的抗体。由偶联物激发生成的针对粘膜炎莫拉氏菌菌株25238 LOS的鼠源抗体应答示于表。雌性小鼠(NIH/Swiss)，每组10只，皮下注射5□g(按碳水化合物计算)溶于0.2ml 0.9％NaCl中的下列物质OS-TT、OS-HMP、LOS或OS加TT或HMP(5μg蛋白质)的混合物，它们含有或不含佐剂。使用的佐剂与dLOS抗体应答的相同。注射3次，间隔为3周，第一次注射后第14天，第二及第三次注射后第7天给小鼠放血。
血清抗-LOS水平表示为ELISA单位(EU)，用分离自25238菌株的LOS作为包被抗原。作为参照，使用抗25238菌株全细胞的超免疫血清，其中的IgG和IgM的指派数值分别为65,000EU/ml和800EU/ml。按照对dLOS偶联物描述的方法，用ELISA测量抗TT或HMP的血清抗体。对于这些结果的统计学分析来说，抗体水平表示为n个(交互的)独立观察数值的几何平均ELISA单位或滴度±标准偏差或幅度(n＜4)。用双边t检测测量显著性，P小于0.05视为显著。
如表6中数据所示，OS、TT和HMP的非偶联混合物未激发生成抗-LOS抗体。第二次注射后，两种偶联物都激发生成了低水平的抗-LOS IgG，但在第一次注射后没有激发；第三次注射后，轻微升高(P＜0.01)。3次注射后，OS-TT和OS-HMP激发生成了类似水平的抗-LOSIgG。注射2次后，LOS本身与偶联物激发生成的抗-LOS IgG水平近似；但是，在第三次注射后，LOS本身激发生成的水平显著高于偶联物。两种偶联物加入佐剂后的制品都显著地增强了它们的免疫原性。表6．偶联物激发生成的针对粘膜炎莫拉氏菌菌株25238 LOS的鼠源抗体应答GM(±SD幅度)ELISA单位b免疫原a注射次数 IgG IgMOS-TT1 1 1 12 6(1-30) 2(1-3)3 4(1-35) 5(1-46)OS-TT1 1 2(1-3) 3(1-9)+佐剂2 4(1-22) 3(1-9)3 7(148) 50(12-209)OS-TT2 1 1 2(1-6)2 1 4(1-14)3 8(1-70) 7(2-28)OS-IT2 1 1(1-2) 2(1-5)+佐剂2 34(5-249) 19(6-62)3 113(13-957) 126(39-409)OS-HMP1 1 1 12 2(1-4) 2(1-5)3 5(1-72) 4(1-40)OS-HMP1 1 1(1-2) 2(1-9)+佐剂2 2 3(1-9)3 90(5-1,585) 81(26-257)OS-HMP2 1 1 12 1(1-2) 4(1-15)3 3(1-13) 7(2-25)OS-HMP2 1 1 7(2-25)+佐剂2 6(1-26) 34(12-92)3 38(8-176) 195(46-828)OS+TT+HMP1 1 12 1 13 1(1-2) 3(2-5)LOS 1 1 3(1-9)2 8(2-40) 2(1-4)3 113(20-630) 52(12-230)a小鼠，每组10只，皮下注射3次5□g下列物质偶联物、加入Ribi佐剂的偶联物、LOS、或者OS、TT和HMP的混合物(各5μg)，间隔为3周。第一次注射后2周，第二及第三次注射后1周采集小鼠血样。b ELISA单位以抗菌株25238的参照血清为基础的，用来自菌株25238的LOS作为包被抗原。免疫前血清含有1(1-2)U IgG和1U IgM。
表7中给出了OS-TT偶联物激发生成的针对TT的鼠源抗体应答。IgG抗体应答强于IgM抗体应答。佐剂明显地增强了OS-TT2的免疫应答，但不如对OS-TT 1增加的幅度明显。表7．OS-TT偶联物激发生成的针对TT的鼠源抗体应答GM(±SD幅度)ELISA单位b免疫原a注射次数 IgG IgMOS-TT11 2(1-3) 12 22(7-72) 13 90(34-237) 1OS-IT11 4(1-9) 4(2-6)+佐剂 2 126(69-229) 5(3-9)3 90(64-128) 22(9-51)OS-TT21 95(33-269) 2(1-3)2 52(9-296)2(1-4)3 140(12-1,614)5(2-11)OS-TT21 113(66～191) 3(1-5)+佐剂 2 271(81-908) 19(9-41)3 1,756(454-6,769) 90(48-169)OS+TT+HMP 1 14(8-25) 1(1-2)2 470(257-851) 2(1-6)3 908(332-2,487) 14(5-40)a见表6脚注ab ELISA单位以抗TT的参照血清为基础的，用TT作为包被抗原，免疫前血清显示＜1单位的IgG或IgM。
表8中给出了OS-HMP偶联物激发生成的针对HMP的鼠源抗体应答。就TT抗体应答而言，IgG抗体水平明显升高，而IgM水平仍很低。加入佐剂大大地增强了IgG抗体应答，比表7中列出的TT抗体应答高出很多。表8．OS-HMP偶联物激发生成的针对HMP的鼠源抗体应答GM(+SD幅度)ELISA单位b免疫原a注射次数IgGIgMOS-HMP1 1 3 1(1-2)2 65(40-105) 14(5-37)3 183(83-398)8(3-21)OS-HMP1 1 9(2-34)2(1-3)+佐剂2 585(330-1,442) 5(3-8)3 1,506(507-4,464) 6(3-12)OS-HMP2 1 9(4-19)3(2-5)2 81(39-168) 4(2-12)3 175(34-902)2(1-6)OS-HMP2 1 81(45-146) 6(3-14)+佐剂2 1,131(642-1,997) 17(8-38)3 4,228(2,600-7,454) 38(12-120)OS+TT+HMP1 2(1-4) 12 470(257-851) 33 1,573(752-3,281) 34(11-104)a见表6，脚注ab ELISA单位以抗HMP的参照血清为基础的，用HMP作为包被抗原，免疫前血清显示1～3个单位的IgG或IgM。
表9中给出了偶联物激发生成的针对粘膜炎莫拉氏菌LOS的兔源抗体应答，表10中给出了偶联物激发生成的针对TT或HMP的兔源抗体应答。表9．偶联物激发生成的针对粘膜炎莫拉氏菌LOS的兔源抗体应答GM(±SD幅度)ELISA单位b免疫原a注射次数 IgG IgMOS-TT20 22(3-90) 7(3-30)1 140(30-810) 52(30-90)2 7,290(2,430-21,870) 68(30-90)OS-TT2+Ribi 0 4(3-10) 10(3-30)1 729(270-2,430) 156(90-270)2 12,627(7,290-21,870) 90OS-HMP2 0 17(10-30)7(3-30)1 467(90-2,430)10(3-30)2 7,290(2,430-21,870) 90(30-270)OS-HMP2+Ribi 0 9(3-30) 7(3-30)1 810 30(10-90)2 12,627(7,290-21,870) 118(90-270)OS+TT+HMP 0 5(3-10) 17(10-30)1 5(3-10) 5(3-10)2 38(3-90) 17(10-30)LOS 0 6(3-10) 6(3-10)1 10(3-30) 52(30-90)2 52(30-90)90a兔子，每组2～3只，皮下及肌内注射免疫2次50μg下列物质偶联物、加入Ribi佐剂的偶联物、LOS、或者OS、TT和HMP的混合物(各50μg)，间隔为1～2月。每次注射前及注射后14天采集血样。b见表6，脚注b。表10．偶联物激发生成的针对蛋白质(TT或HMP)的鼠源抗体应答GM(±SD幅度)ELISA单位b免疫原a注射次数IgG IgM抗-TT的分析OS-TT2 0 10 101 270 17(10-30)2 4,209(2,430-7,290) 118(90-270)OS-TT2+Ribi 0 17(10-30) 101 2,430 902 21,870 355(90-810)OS+TT+HMP0 30 17(10-30)1 468(270-810)155(90-270)2 2,430 90抗-HMP的分析OS-HMP2 0 52(30-90) 17(10-30)1 118(90-270) 302 2,430 52(30-90)OS-HMP2+Ribi 0 30 17(10-30)1 468(270-810)302 7,290 30OS+TT+HMP0 52(30-90) 17(10-30)1 270 302 2,430 52(30-90)a见表9脚注ab见表7和8脚注b给小鼠注射3次OS-TT或OS-HMP偶联物后，OS蛋白偶联物-免疫血清中无一份表现出针对同源粘膜炎莫拉氏菌菌株25238的杀菌活性，而偶联物(加佐剂)-免疫血中的40％(20只小鼠中的8只)表现出了针对同源粘膜炎莫拉氏菌菌株25238的杀菌活性，范围为1∶8～1∶64。给兔子注射2次OS-TT或加佐剂的OS-HMP偶联物后，37.5％偶联物-免疫血清(8只兔子中的3只)表现出针对同源粘膜炎莫拉氏菌菌株25238的杀菌活性，范围为1∶2～1∶8。
本发明虽然对特定实施方案进行了详细的描述，但是，本领域技术人员能够理解到，这些技术方案只是举例说明而并不构成限制，本发明真实范围是由下列权利要求限定的。
权利要求
1．一种粘膜炎莫拉氏菌偶联疫苗，其中包括一种分离自粘膜炎莫拉氏菌的脂寡糖(LOS)和一种与其共价连接的免疫原性载体，所述脂寡糖已通过除去酯化脂肪酸处理生成为一种脱毒的LOS(dLOS)，或者通过除去脂质A生成为一种寡糖(OS)。
2．权利要求1的疫苗，其中所述的载体是蛋白质。
3．权利要求2的疫苗，其中所述的免疫原性载体蛋白选自分离自粘膜炎莫拉氏菌的UspA、分离自粘膜炎莫拉氏菌的CD、破伤风毒素/类毒素、分离自非获得型流感嗜血杆菌的高分子量蛋白(HMP)、白喉毒素/类毒素、脱毒后的绿脓杆菌毒素A、霍乱毒素/类毒素、百日咳毒素/类毒素、产气荚膜梭状芽胞杆菌外毒素/类毒素、乙肝表面抗原、乙肝核心抗原、轮状病毒VP7蛋白、CRM、CRM197、CRM3201以及呼吸合胞病毒F和G蛋白。
4．权利要求3的疫苗，其中所述的免疫原性载体蛋白是破伤风类毒素或HMP。
5．一种药用组合物，其中包括在药物学上可接受载体中的权利要求1所述疫苗偶联物。
6．权利要求5的药用组合物，其中进一步包括一种佐剂。
7．权利要求6的药用组合物，其中所述的佐剂是为单磷酰脂质A与海藻糖二霉菌酸酯或明矾的混合物。
8．权利要求1的偶联疫苗，其中所述的免疫原性载体通过一种接头化合物与dLOS或OS共价连接。
9．权利要求8的偶联疫苗，其中所述的接头化物选自己二酸二酰肼、ε-氨基己酸、氯己醇二甲基乙缩醛、D-葡糖醛酸内酯和对硝基苯乙胺。
10．权利要求8的偶联疫苗，其中所述的接头化合物为己二酸二酰肼。
11．分离自粘膜炎莫拉氏菌并通过除去其中的酯化脂肪酸脱毒的脂寡糖。
12．权利要求11的脂寡糖，其中所述的用于分离所述脂寡糖的粘膜炎莫拉氏菌为粘膜炎莫拉氏菌的纯化菌株。
13．分离自粘膜炎莫拉氏菌并通过除去其中的脂质A脱毒的脂寡糖。
14．一种用于预防哺乳动物中由粘膜炎莫拉氏菌感染引发的中耳炎的方法，其中包括向哺乳动物接种有效免疫保护量的偶联疫苗，该偶联疫苗中包括一种由分离自粘膜炎莫拉氏菌的脂寡糖衍生而来的脱毒脂寡糖(dLOS)或寡糖(OS)，以及一种共价连接于上述dLOS上的免疫原性载体。
15．权利要求14的方法，其中所述的哺乳动物为人。
16．权利要求14的方法，其中所述的偶联疫苗经非胃肠道途径接种。
17．权利要求16的方法，其中所述的偶联疫苗的接种途径为肌内注射、皮下注射或鼻内粘膜沉积或者这些方法的结合。
18．权利要求14的方法，其中所述的有效免疫保护量为每剂约10μg～50μg。
19．权利要求14的方法，其中进一步包括用约10μg～约25μg偶联物加强注射。
20．权利要求14的方法，其中所述的接种步骤包括接种第一剂量约1μg～50μg偶联疫苗，然后在第一剂量约两月后再接种第二剂量约10μg～25μg偶联疫苗，然后在第二剂量后约两月注射第三剂量约10μg～25μg偶联疫苗，然后在第三剂量后约12个月注射第四剂量约10μg～25μg偶联疫苗。
21．一种对分离自粘膜炎莫拉氏菌的脂寡糖进行脱毒的方法，其中包括除去分离的LOS中的酯化脂肪酸。
22．权利要求21的方法，其中所述的酯化脂肪酸的除去是通过用肼或弱碱试剂处理LOS来实现的。
23．一种制备粘膜炎莫拉氏菌偶联疫苗的方法，其中包括除去分离自粘膜炎莫拉氏菌的脂寡糖(LOS)中的酯化脂肪酸得到脱毒后的LOS(dLOS)；以及将dLOS共价连接到免疫原性载体上。
24．权利要求23的方法，其中所述的除去步骤中包括用肼或弱碱试剂处理所述LOS。
25．权利要求23中的方法，其中所述的连接步骤包括将dLOS连接到一种接头化合物上，并将该接头化合物连接到免疫原性载体上。
26．权利要求25的方法，其中所述的接头化合物是己二酸二酰肼、ε-氨基己酸、氯己醇二甲基乙缩醛、D-葡糖醛酸内酯或对硝基乙基胺。
27．权利要求25的方法，其中所述的接头化合物是己二酸二酰肼。
28．权利要求23的方法，其中进一步包括向连接到免疫原性载体上的dLOS中加入佐剂。
29．一种制备粘膜炎莫拉氏菌偶联疫苗的方法，其中包括除去分离自粘膜炎莫拉氏菌的脂寡糖(LOS)中的脂质A得到寡糖(OS)；以及将OS共价连接到免疫原性载体上。
30．权利要求29的方法，其中所述的除去步骤包括用酸处理LOS。
31．权利要求29的方法，其中所述的连接步骤包括包括将OS连接到一种接头化合物上，并将该接头化合物连接到免疫原性载体上。
32．权利要求31中的方法，其中所述的接头化合物是己二酸二酰肼、ε-氨基己酸、氯己醇二甲基乙缩醛、D-葡糖醛酸内酯或对硝基乙基胺。
33．权利要求32的方法，其中所述的接头化合物是己二酸二酰肼。
34．权利要求29的方法，其中进一步包括向连接到免疫原性载体上的OS中加入佐剂。
35．一种偶联疫苗，其中包括一种分离自粘膜炎莫拉氏菌的脂寡糖(LOS)和一种与其共价连接的免疫原性载体，所述脂寡糖已通过除去酯化脂肪酸处理生成为一种脱毒的LOS(dLOS)或者通过除去脂质A生成为一种寡糖(OS)，该疫苗可以用于预防哺乳动物中粘膜炎莫拉氏菌感染诱发的中耳炎。
36．权利要求35的疫苗，其中所述的免疫原性载体是蛋白质。
37．权利要求36的疫苗，其中所述的免疫原性载体蛋白选自分离自粘膜炎莫拉氏菌的UspA、分离自粘膜炎莫拉氏菌的CD、破伤风毒素/类毒素、分离自非获得型流感嗜血杆菌的高分子量蛋白(HMP)、白喉毒素/类毒素、脱毒后的绿脓杆菌毒素A、霍乱毒素/类毒素、百日咳毒素/类毒素、产气荚膜梭状芽胞杆菌外毒素/类毒素、乙肝表面抗原、乙肝核心抗原、轮状病毒VP7蛋白、CRM、CRM197、CRM3201以及呼吸合胞病毒F和G蛋白。
38．权利要求37的疫苗，其中所述的免疫原性载体蛋白是破伤风类毒素或HMP。
全文摘要
本发明公开了一种粘膜炎莫拉氏(布拉汉氏)菌偶联疫苗,其中包括分离自粘膜炎莫拉氏菌的脂寡糖(LOS)和一种与其共价连接的免疫原性载体,所述脂寡糖已通过除去酯化脂肪酸处理生成为一种脱毒的LOS(dLOS)或者通过除去脂质A生成为一种寡糖(OS),该疫苗可以用于预防包括人在内的哺乳动物中粘膜炎莫拉氏菌感染诱发的中耳炎。
文档编号C12P19/04GK1288384SQ99802142
公开日2001年3月21日 申请日期1999年1月12日 优先权日1998年1月13日
发明者古新星, J·B·罗宾斯 申请人:美国国有健康与人类服务部