一种适用于纤维堆囊菌的新型talen载体及其构建方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物化学和分子生物学领域，具体涉及一种适用于纤维堆囊菌的 TALEN载体及其构建方法。
【背景技术】：
[0002] TALE是来自于植物致病细菌黄色单胞杆菌属的一类具有高度特异性的DNA结合 S[=l (Sanjana NE, Cong L, Zhou Y, Cunniff MM, Feng G, Zhang F. A TAL effector toolbox for genome engineering. Nature Protocols, 2012, 7:171-192.)，其特异性是由其重复单 元中的重复可变区（Repeat Variable Diresidue，RVD)决定的。TALE元件主要包括TALEN 元件和TALE-TF元件，TALEN元件由于基因敲除效率高、几乎无脱靶作用等优点已经在哺乳 动物细胞、干细胞和植物等真核细胞的基因组编辑方面有着十分广泛的应用，而由于相应 载体的缺乏，TALEN在原核生物中的应用尚未见报道。由于纤维堆囊菌其次级代谢产物丰 富，构建其基因改造体系对于其代谢产物种类和产量十分重要，但由于相关载体的缺乏及 纤维堆囊菌成团生长的特性导致纤维堆囊菌的基因工程改造进展缓慢。因此，构建适用于 纤维堆囊菌的TALEN载体将扩大TALEN技术的应用范围，提高原核生物的基因组编辑效率， 促进基因组编辑技术的发展。
【发明内容】
：
[0003] 本发明的目的是提供一种适用于纤维堆囊菌的新型TALEN载体及其构建方法。
[0004] 本发明的适用于纤维堆囊菌的新型TALEN载体，其特征在于，其是通过以下方法 构建的：根据目的基因的碱基序列确定靶标序列，再确定靶标序列上下游的靶标识别域碱 基序列，根据上下游的靶标识别域碱基序列设计TAL重复单元，分别得到上游的TALE重复 单元和下游的TALE重复单元，将上游的TALE重复单元连接至Ptalen L48载体上，下游的 TALE重复单元连接至Ptalen R36载体上；再用内切酶Hindlll和Spel酶切Ptalen L48载 体和上下游含有内切酶Hindlll和Spel位点的P43启动子，再进行连接反应，使P43启动 子代替启动子PGPD插入到酶切位点Hindlll和Spel之间，得到载体P43LTALEN ;再用内切 酶AscI和Spel酶切Ptalen R36载体和上下游含有内切酶AscI和Spel位点的P43启动 子，再进行连接反应，使P43启动子代替启动子pGPD插入到酶切位点AscI和Spel之间，得 到载体P43RTALEN ;载体P43LTALEN和载体P43RTALEN即为适用于纤维堆囊菌的新型TALEN 载体。
[0005] 所述的纤维堆囊菌优选为纤维堆囊菌So ce M4,也可以是纤维堆囊菌So ce 90、 So ce 56 和 So ce M6。
[0006] 目前，关于TALEN技术在原核生物中的应用几乎未见报道，本发明首次将适用于 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的启动子P43替换适用于真核生物的启动子，将构建成功的靶标 目的基因的左右臂TALEN元件和靶标基因共同转入纤维堆囊菌，用Western blot验证重组 蛋白是否表达，从而验证所构建的载体能在纤维堆囊菌中行使基因敲除的功能，进一步拓 宽TALEN技术的应用范围，促进生物技术的发展。
【附图说明】：
[0007] 图1为ADH2基因扩增及pET22b-ADH2双酶切鉴定图；
[0008] 图2为TALEN靶标序列图及TALEN重组载体测序鉴定图；
[0009] 图3为P43LTALEN及P43RTALEN双酶切鉴定图；
[0010] 图4为P43LTALEN、P43RTALEN及pET22b-ADH2导入纤维堆囊菌后的质粒及PCR鉴 定图；
[0011] 图5为敲除成功重组菌测序结果与ADH2基因比对图；
[0012] 图 6 为导入 P43LTALEN、P43RTALEN 和 pET22b-ADH2 后的总蛋白 Western blot 鉴 定图。
【具体实施方式】：
[0013] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0014] 实施例1 :pET22b-ADH2重组质粒的构建：
[0015] 一、ADH2基因的获取。
[0016] 1?设计引物：
[0017]上游引物：GGAATTCCATATGTCTATTCCAGAAACTCAAAAAG
[0018]下游引物：GCCCTCGAGITTAGAAGAGTCAACAACGT
[0019] 2.用试剂盒提取啤酒酵母As2. 4的基因组，按如上引物PCR扩增得到长度约为 1024bp的带酶切位点的ADH2基因并测序验证（其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，ADH2基因的碱基序列的Genbank登陆号为NM_001182812. 1)，
[0020] PCR反应体系如下：
[0021]
【主权项】
1. 一种适用于纤维堆囊菌的新型TALEN载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 根据目的基因的碱基序列确定靶标序列，再确定靶标序列上下游的靶标识别域碱基序列， 根据上下游的靶标识别域碱基序列设计TAL重复单元，分别得到上游的TALE重复单元和下 游的TALE重复单元，将上游的TALE重复单元连接至Ptalen L48载体上，下游的TALE重复 单元连接至Ptalen R36载体上；再用内切酶Hindlll和Spel酶切Ptalen L48载体和上下 游含有内切酶Hindlll和Spel位点的P43启动子，再进行连接反应，使P43启动子代替启 动子PGPD插入到酶切位点Hindlll和Spel之间，得到载体P43LTALEN ;再用内切酶AscI 和Spel酶切Ptalen R36载体和上下游含有内切酶AscI和Spel位点的P43启动子，再进 行连接反应，使P43启动子代替启动子pGPD插入到酶切位点AscI和Spel之间，得到载体 P43RTALEN ;载体P43LTALEN和载体P43RTALEN即为适用于纤维堆囊菌的新型TALEN载体。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的纤维堆囊菌为纤维堆囊菌So ce M4〇
3. -种按照权利要求1或2所述的制备方法制备得到的适用于纤维堆囊菌的新型 TALEN载体。
【专利摘要】本发明公开了一种适用于纤维堆囊菌的新型TALEN载体及其构建方法。本发明首次将适用于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的启动子P43替换适用于真核生物的启动子，将构建成功的靶标目的基因的左右臂TALEN元件和靶标基因共同转入纤维堆囊菌，用Western blot验证重组蛋白是否表达，从而验证所构建的载体能在纤维堆囊菌中行使基因敲除的功能，进一步拓宽TALEN技术的应用范围，促进生物技术的发展。
【IPC分类】C12N15-55, C12N15-74, C12N15-66
【公开号】CN104673820
【申请号】CN201510083348
【发明人】叶伟, 章卫民
【申请人】广东省微生物研究所
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月13日