治疗癌症和纤维化疾病的化合物组合物和方法
【专利说明】治疗癌症和纤维化疾病的化合物组合物和方法
[0001] 本申请是申请日为2010年3月23日，申请号为201080012287. X，发明名称为"治 疗癌症和纤维化疾病的化合物组合物和方法"的申请的分案申请。
[0002] 本申请要求2009年3月23日提交的美国临时专利申请No. 61/162348的优先权， 并且该申请在此通过引用整体并入本文。 发明领域
[0003] 本发明涉及靶向END0180多肽并由此内化的分子、包含该分子的偶联物、包含该 分子和偶联物的组合物，以及使用它们将治疗剂递送至在细胞表面上表达END0180多肽的 细胞用以治疗细胞增生性疾病或病症以及纤维化并且用以控制（调控）肿瘤进展的方法。
[0004] 发明背景
[0005] END0180# 体
[0006] END0180也称为⑶280、uPARAP(尿激酶纤溶酶原激活物受体相关蛋白）和2型甘 露糖受体C(MRC2)，它是指导所结合的配体在内涵体内降解的循环型胞吞受体。它是与尿激 酶型纤溶酶激活物（uPA)和尿激酶型纤溶酶激活物受体（uPAR)形成的三体复合物的一部 分，因而参与纤溶酶原至纤溶酶的生成过程。已知纤溶酶在胞外基质（ECM)转换和将休眠 型TGF-β至其活性形式的蛋白水解性转化中起作用。
[0007] 三体复合物除了在产生纤溶酶中起作用之外，还显示出参与基质金属蛋白酶 (MMP)酶原的激活，作用于纤维蛋白以结合若干胶原蛋白，并参与胞外基质的常规转换。该 复合物还参与细胞粘附和信号转导（Bherendt等，2000. JBC 275:1993-2002)。
[0008] END0180是通过促进细胞迀移并摄入胶原蛋白用于细胞内降解而在细胞活动性 和胞外基质重构中起作用的循环型胞吞受体（Niels. 2004 Biol Chem. 385(2):103-36; Kjoller 等，2004 Exp Cell Res.293 (l):106-16;Wienke 等，2007 Cancer Res. 67 (21) : 10230-40)。END0180与巨噬细胞甘露糖受体家族共享同源性，该家族包括 甘露糖受体、磷脂酶八2和 DEC-205/MR6(Isacke 等，1990 Mol. Cell. Biol. 10:2606-2618 ; Sheikh 等，2000, J. Cell. Sci. 113 :1021-1032 ;Behrendt 等，2000, J. Biol. Chem. 275 : 1993-2002)。此家族构成是基于总体结构保守性：大的胞外结构域包含N末端信号序列， 随后是富含半胱氨酸的结构域，II型纤连蛋白结构域（FNII)和8或10个C型凝集素样结 构域（CTLDs)以及小的跨膜和胞内结构域（共约66个氨基酸）。作为一个家族，这些受体 具有两个明显特征：第一，尽管它们属于大的C型凝集素超家族，但是它们仍在单个多肽骨 架中独特地包含多个 CTLDs (Taylor M.E·，1997 Glycobiology 7 :v_vii;McKay 等，1998， Eur. J. Immunol. 28 :4071-4083 ;Howard 和 Isacke，2002,见上文）。第二，它们共享在细胞 的质膜和胞间区室之间循环的能力（Isacke等，1990,见上文；Zvaritch等，1996, J. Biol. Chem. 271 :250-257)。在甘露糖受体家族中，END0180的不寻常之处在于它从质膜靶向循环 的内涵体而不是随后的内涵体/溶酶体区室（Howard和Isacke，2002,见上文）。
[0009] END0180 位于细胞表面上，被膜小窝（Isacke 等，1990M〇1. Cell. Biol. 10 : 2606-2618 ;Sheikh 等，2000, J. Cell. Sci. 113 :1021-1032)和内涵体中。它主要表达 于成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞中。原位杂交显示它表达于高度血管化的器官中。 END0180还发现于小鼠胚胎的骨形成区（Wu等，1996, J. Biol. Chem. 271:21323-21330)和 发育期间处于软骨内和膜内骨化位置的成骨细胞和骨细胞中（Engelholm等，2001，Trends Cardiovasc. Med. 11:7-13) 〇
[0010] 以下的专利公布也涉及 END0180 受体：US 6, 117, 977、US 7, 399, 468、WO 97/40154和WO 00/58473。转让给本发明受让人的并在此通过引用整体并入本文的PCT专 利公布No. WO 2004/100759以及美国专利公布No. 2007/0072244和2009/0202566涉及鉴 定能调控人END0180受体活性的化合物的方法。
[0011] 抗体疗法
[0012] 对治疗癌症及其它疾病的新疗法的寻求使人们开发了能抑制受体功能的人抗体 和人源化抗体。国际专利公布WO 2006/023491提供了 RNA干扰方法，其包括使细胞接触融 合蛋白-双链RNA复合物，该复合物包含含感兴趣的双链RNA的双链RNA区段及为抗体Fab 片段-鱼精蛋白融合蛋白的融合蛋白。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明部分基于对特异性结合细胞表面上的END0180多肽的分离的分子的鉴定。 在一些实施方案中，该分子结合END0180多肽的胞外结构域并通过所述多肽内化到细胞 中，从而给表达END0180多肽的细胞提供用于递送治疗和诊断药物（cargo)的媒介物。因 此在一些实施方案中，本发明提供包含特异性结合END0180多肽的分子和治疗剂以用于将 该治疗剂递送到细胞的偶联物。在一些实施方案中，所述END0180多肽与SEQ ID NO: 2所 示的氨基酸序列具有基本同一性，由与SEQ ID NO: 1所示的核酸序列具有基本同一性的多 核苷酸编码。
[0015] 一方面，本发明还提供抗END0180抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的重链⑶R3片段。
[0016] 在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还可包含具有SEQ ID NO:8所示 的氨基酸序列的轻链CDR3片段。
[0017] 在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段可选自由以下组成的组：全IgG、 Fab片段、Fab'片段、F(ab'）2片段、其重链和/或轻链的可变部分、Fab微抗体和scFv。优 选地，所述抗体包含SEQ ID N0:5所示的多肽序列。优选地，所述抗体或抗原结合片段可为 人源化的。优选地，所述抗体或抗原结合片段可为嵌合的。
[0018] 一方面，本发明提供由命名为E3-8D8的杂交瘤细胞系（BCCM登记号LMBP 7203CB) 产生的抗END0180抗体或该抗体的片段，其结合细胞表面上的END0180受体。在一些实施 方案中，抗体与受体的结合使抗体内化到细胞中。本发明还提供了 E3-8D8杂交瘤细胞系。
[0019] 本发明还提供分离的抗END0180抗体或其抗原结合片段，由所述E3-8D8杂交瘤细 胞系分泌。本发明还提供抗体或其抗原结合片段，与由所述E3-8D8杂交瘤细胞系分泌的抗 体结合相同的表位。
[0020] 在一些实施方案中，抗体或其片段是人源化的或嵌合的抗体或其片段。
[0021] 本发明提供包含至少一个抗END0180抗体或其片段（所述抗体由E3-8D8杂交瘤 产生）、或其人源化分子、嵌合抗体或其片段以及载体的组合物。
[0022] 在一些实施方案中，该分离的抗体选自由以下组成的组：全IgG、Fab片段、Fab'片 段、F(ab'）2片段、其重链和/或轻链的可变部分、Fab微抗体和scFv。在一些实施方案中， 所述抗体是包含具有SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列的重链CDR3结构域的重组多肽，或其 仍保留特异性结合END0180能力的变体。在一些实施方案中，所述抗体还包含具有SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列的轻链CDR3结构域，或其仍保留特异性结合END0180能力的变体。
[0023] 在一些实施方案中，所述抗体是包含SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列的scFv重组 多肽，或其仍保留特异性结合END0180能力的变体。在具体实施方案中，显示与END0180受 体的结合亲和力并包含SEQ ID NO: 7和8所示的CDR3结构域的抗体当与受体接触时，由受 体内化到表达END0180的细胞中。
[0024] 本发明还提供组合物，其包含至少一种如上所述的抗END0180抗体或其片段，和 包括放射性同位素、治疗剂、细胞毒剂或可检测标记的部分（moiety)。在一些实施方案中， 该部分共价地（通过接头或化学键）或非共价地（通过离子、范德华力、静电或氢键）与 抗体相连（或连接或偶联）。
[0025] 在一些实施方案提供抗END0180抗体或其抗原结合片段，其选自以下：
[0026] a)由杂交瘤细胞系E3-8D8 (BCCM登记号LMBP 7203CB)产生的单克隆抗体；
[0027] b)与（a)中的抗体结合相同表位的抗体或其片段；
[0028] c) (a)或（b)的人源化抗体；
[0029] d)包含与SEQ ID NO :6基本相似的多肽的抗体片段；和
[0030] e)包含氨基酸序列与SEQ ID NO:7和8所示的氨基酸序列基本相似的⑶R3的重 组多肽。
[0031]