专利名称：：通过诱导免疫耐受治疗纤维化疾病的方法
技术领域：
：本发明总体上涉及纤维化疾病(fibrosingdisease)的治疗。具体地，本发明涉及通过诱导免疫耐受治疗纤维化疾病。
背景技术：
：人中的获得性纤维化疾病具有几个常见特征。组织纤维化之前是正常组织的损伤和/或炎症。T细胞和单核细胞对组织的浸润见于纤维化发展的早期。系统性硬化症(Systemicsclerosis)(SSc，硬皮病)是常见的系统性纤维化疾病，其与I,m,IV，VI,VII，XVI,XVIII型胶原蛋白的累积增加有关。对i,ni禾niv型的细胞和/或体液免疫已经在ssc患者中描述。该疾病主要特征包括皮肤增厚并与下方的结构紧密结合。通常涉及的内部器官是胃肠道，肺，肾和心脏。T淋巴系统通过合成不同类型的细胞因子可调节纤维母细胞和单核细胞/巨噬细胞以及多种其他靶细胞的功能。对于纤维化，T细胞产生成纤维因子诸如IL-4，TGF-pi和卩2，可直接刺激培养的纤维母细胞合成胶原。T细胞通过合成干扰素(IFN)Y可激活巨噬细胞，巨噬细胞可合成多种成纤维细胞因子，包括血小板来源的生长因子，TGF-(31和卩2，所述细胞因子可刺激纤维母细胞合成胶原。.发明概述本发明提供了通过口服给药从正发生纤维化的组织来源的组织蛋白来治疗纤维化疾病的方法。可根据本发明治疗的纤维化疾病包括但不限于，硬皮病(SSC)，皮肤纤维化，肝硬化，肾纤维化，肺纤维化，心脏纤维化，胃肠纤维化以及血管纤维化。一个实施方案中，本发明用于治疗患有纤维化疾病至少3年，优选至少5年的患者。另一实施方案中，纤维化疾病通过口服给药来自正发生纤维化的组织的胶原蛋白来治疗。根据组织类型，不同类型的胶原蛋白可用于该治疗。胶原蛋白可从人患者中正发生纤维化的组织制备，或者从动物诸如鸟类或哺乳动物的相应组织制备。可选，可使用化学合成或重组制备的胶原蛋白。胶原蛋白的片段或其混合物也可用于本发明中。一个优选实施方案中，胶原蛋白或胶原蛋白片段通过以大约500ug/天口服给药大约12个月来提供给患者。附图简述图1是显示不同SSc患者亚组中不同时间点的MRSS改变的柱图。图2显示在第12个月时，SSc患者百分比相对于MRSS改善百分比。图3显示第15个月时SSc患者百分比相对于MRSS改善百分比。图4显示用CNBr切割al(I)和a2(1)。发明详述本发明首次证实了口服给药的I型胶原蛋白(CI)在系统性硬化症(SSc)患者中诱导CI耐受性并缓解该疾病的临床表现。SSc是常见的系统性纤维化疾病，与细胞外基质蛋白诸如胶原蛋白的累积增加相关。不受任何具体理论的限制，据信口服给药其中T细胞被各种刺激因素激活的正发生纤维化的组织位点中存在的组织蛋白(例如胶原蛋白)可下调T细胞。因此，T细胞分泌成纤维细胞因子以及刺激单核细胞/巨噬细胞的细胞因子的作用受到抑制，所述细胞因子本来会刺激该组织位点的纤维母细胞产生细胞外基质蛋白诸如胶原蛋白。因此，本发明提供治疗纤维化疾病的方法，其通过口服给药从正发生纤维化的组织来源的组织蛋白来进行。可通过本发明的方法治疗的纤维化疾病包括但不限于SSC,皮肤纤维化，肝硬化，肾纤维化，肺纤维化，心脏纤维化(例如见于充血性心力衰竭)，胃肠纤维化以及例如见于动脉粥样硬化中的血管纤维化。无论其病因如何，本发明的方法可治疗这些纤维化疾病具体的实施方案中，本发明的方法用于治疗患有纤维化疾病至少3年，优选至少5年的患者。根据本发明，纤维化疾病可通过口服给药来自正发生纤维化的组织的胶原蛋白来治疗。例如，已知SSc与过量累积的I型胶原蛋白有关，因此I型胶原蛋白或其片段可口服给药SSc患者。肝硬化与肺纤维化以及间质胶原蛋白疾病分别与I，m和V型胶原蛋白的累积有关。因此，I，III禾口V型胶原蛋白分别可口服给药患有肝硬化，肺纤维化以及间质胶原蛋白疾病的患者。来自胶原蛋白的小合成肽在经鼻给予例如通过滴鼻剂或喷鼻剂给予或作为气溶胶吸入时，也可诱导耐受。胶原蛋白可从人类患者中正发生纤维化的组织或动物的相应组织制备和提取，所述动物诸如鸟类(例如家禽)或哺乳动物(例如牛或猪)。可选，化学合成或重组制备的胶原蛋白也可使用。此外，胶原蛋白片段或其混合物也可用于本发明。例如，CNBr裂解I型胶原蛋白所衍生的肽可以用于SSc患者的治疗。胶原蛋白或其片段可通过以以下剂量口服给药患者来提供大约200-1000jig/天，优选约400-600[ig/天，更优选约500所述治疗可持续至少6个月，优选12个月或更长时间，或直到疾病的临床表现减轻或缓解。本发明还通过以下实施例具体说明。实施例1为了确定口服给药500pg/天的牛I型胶原蛋白(CI)是否缓解系统性硬化症(SSc)的临床表现，进行多中心双盲安慰剂对照研究。基于以下标准筛选用于包括在研究中的患者--至少18岁的男性或女性；-临床诊断为患有弥漫型(diffose)SSc(根据1980年的ACR标准)3年或以下(早期)，或4-10年(晚期)；-加入研究前6个月之中通过病史或体检显示稳定的皮肤病变；和-加入研究之前1个月具有稳定的改良Rodnan皮肤评分(MRSS):筛选是稳定的MRSS>16，随机分配时稳定的如下MRSS:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>对168名符合上述标准的患者分级并随机分配接受日安慰剂[2mlO.lM乙酸(HAc)]或500吗牛CI，持续12个月。在基线期以及4，8，12以及15个月以后，测定MRSS作为第一临床结果变量。硬皮病健康评估调査问巻(SHAQ)，短表(shortform)36调査问巻，医生的全面评估，患者的全面评估，血压，体重和血清肌酐作为第二临床结果指标在基线期以及4，8，12和15个月之后测定。在不早于基线期以前5周和第12个月时测定患者的FVC和DLCO，作为第二临床结果参数。需要在对接受任何排它性药物/治疗的患者进行筛选前访问。图1总结了从基线起第4个月(蓝)，第8个月(红)，第12个月(绿)，第15个月(桔红)的MRSS改变，分成四个亚组。每个柱表明每个时间点上每组中MRSS改变的分布；上方边缘是75%;下方边缘是25%;柱内的线表示MRSS改变中间值。在此以外的值通过伸出的线表示。结果表明CI治疗组和安慰剂组在第12个月时的改变平均值没有统计学差异。类似的结论见于其他临床和实验室参数(见表1和2)。然而在第15个月，CI治疗的晚期患者("晚期胶原蛋白"组)中的MRSS为7.9，与安慰剂组中的晚期患者("晚期安慰剂"组)的2.9相比有非常明显的差异。如图1所示，在第15个月，胶原蛋白治疗的晚期患者组的桔红色柱中的中间值明显低于其他桔红色柱中的中间值，并且实际上是所有柱中最低的。这表明CI治疗的晚期患者亚组中的MRSS改善最大。接受治疗的晚期患者各组中MRSS平均值差异的p值为0.0063;而所有其他实验对于0.05的水平而言都不明显。注意到变量MRSS本身不是正态分布的，但MRSS在第12个月和第15个月与基线相比的改变是正态分布的。因此，p值获自t检验。非参数检验也用于确定治疗组和安慰剂组之间的MRSS改变，即秩-和检验，所得p值相似。在MRSS中的改变产生分叉并测定具有皮肤MRSS改变的患者百分比的情况下，获得两幅图(图2和图3)。每幅图显示四个亚组的每一个中经理不同程度的MRSS改善的患者百分比。例如，在图2中，晚期胶原蛋白组中几乎50%的患者在第12个月的MRSS减少20%。反之早期胶原蛋白组中仅仅大约19%经历类似的改善。两幅图都明显显示与其他亚组相比，晚期患者从胶原蛋白治疗中获益最多。在胶原蛋白组中，卡方检验证实了在第15个月时，与早期患者相比，晚期患者中MRSS改善至少25%的比例明显更高。总而言之，上述研究显示口服给药500pg/天的CI持续12个月在研究第15个月时可明显降低病程大于等于4-10年的患者中的MRSS，表明口服胶原蛋白治疗对皮肤纤维化具有延迟效果。在该研究中，口服CI对于PFT或HAQ没有明显效果，并且没有CI治疗导致的副作用。口服胶原蛋白治疗的延迟效果与一旦T细胞剌激被中和纤维母细胞需要一些时间来"逐渐平静"("winddown")有关。这些结果也表明仅仅在晚期患者中T细胞提供成纤维信号的主要来源。实施例2该实施例描述了用于测定500pg/天的口服CI治疗在加入实施例1所述研究的患者中是否诱导CI耐受性的实验。血清和PBMC获自治疗之前和口服牛CI治疗12月之后的患者，或在3个月或以上到11个月或以下退出的患者(drop-out)。PBMC在有或无牛al(I)链，牛(x2(I)链,天然牛CI，或al(I)或a2(I)的CB(CNBr)肽的情况下收集。CB肽通过用CNBr裂解牛或人al(I)和a2(I)(图4和表3所示)并通过离子交换层析纯化来分离。在给药CI或安慰剂之前的基线期以及第12个月时，纯化的al(I)和a2(I)的CB肽以及未分离的al(I)和a2(I)的CB肽用于培养SSc患者的PBMC。在第0和12个月，PBMC上清通过ELISA分析IFNy禾口IL-IO。链刺激的PBMC在口服给药CI之后产生的IFNy减少或IL-10增加作为第一免疫学结果变量。结果总结于表4-9。如表5-6所示，在口服CI治疗12个月的总和早期疾病阶段患者群中，观察到al(I)CB肽混合物以及al(I)CB7导致PBMC的IFN丫产生明显减少。此外，在总和早期疾病阶段患者群中，观察到人a2(I)以及al(I)CB7导致PBMC的IL-10产生明显增加(表7-8)。这些结果表明口服牛CI通过调节TH1/TH2产生而对于治疗患弥漫性SSc大于等于4年的患者而言是有效的。抗原特异性IL-10产生的上调提示在LD患者中诱导了CI耐受性。对于总SSc人群，患病期和以下物质导致的IL-lO产生之间成反比al(I)CB3(p=-0.0059.N=153);al(I)CB7(p=-0.0335,N=150);人al(I)(p=-0.0166，N=152);a2(I)CB混合物(p--0.0032.N=154)。对于早期患者，MRSS和a2(I)CB2导致的IFNY产生之间成反比(p:-0.026，N=94)。对于总SSc人群，SF-36和al(I)CB4导致的IFNy产生之间成反比^=-0.0448,N=143)。对于晚期患者，SF」36和al(I)CB4和PHA导致的IFN^y产生成反比(分别为p=-0.0364，N=57;p=-0.028,N=58)。对于总弥漫性SSc人群，FVC和与al(I)CB4和人a2(I)—起培养的PBMC的IL-10产生成正比(分别为p=0.0122,N=I52;p=0.0072，N=94)。对于早期患者，FVC与人a2(I)导致的IL-10成正比(p-0.0062,N=94)。对于早期患者，FEB1和a2(1)CB4和al(I)CB混合物导致的IL-10产生成反比(分别为p;0.0067，N=92;p=-0.0041,N=94)。对于总弥漫性SSc人群，FEV1和al(I)CB混合物导致的IL-lO成反比(p-0.0241,N=154)。在早期患者中，DLCO和al(I)CB7导致的IFNy产生成正比(p-0.0367，N-90)。晚期患者中，DLCO和a2(1)CB2导致的IFNY产生成正比(p-0.0383,N=59)。总而言之，用CI和CI衍生肽培养患者PBMC进行的免疫反应实验显示，总体上，培养的PBMC产生的IFNy和IL-10增多见于早期疾病患者(<4年病程)。抗原白色念珠菌导致的IFN丫产生不存在于早期和晚期患者中，提示对共同环境抗原的Thl反应受损。天然牛CI引发早期和晚期患者中IFNy和IL-10产生的明显增加。不能引发晚期患者中IFNy或IL-10产生的具体CICB肽包括al(I)CB2，4,5和7,以及a2(I)CB2,3和3-5。早期和晚期患者中最强的一致性IFNy和IL-10反应见于al(I)CB8，al(I)CB6,a2(1)CB4，表明al(I)和a2(I)的这些部分含有在大多数弥散性SSc患者的疾病持续期中激发T细胞反应的表位。对CI和CI衍生肽的特异性的PBMCIFNy或IL-10应答提示可能存在这样的患者亚组，其中应答于特定CI表位的具体细胞因子可能影响疾病表达。表1基线期到第12和第15个月的硬皮病HAQ改变<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2基线期到第12个月的PFT改变总安慰剂总CI早期安慰剂早期CI晚期安慰剂晚期CI(n)FEVt平均值土SEM(61)"0.46±1.67(47)-2,02±3.05(30)-0.17+3.18(30)-2.07±4.74(31)-0.74±1.23(17)-1.94±1.45P值NSNSNS(n)FVC平均值土SEM(60)-0.68±1.20(40)-4.54±2.41(29)-0.83±2.11(31)-5.42±3.66(31)-0.55土1.25(17)-2.94±1.42P值NSNSNS(n)DLco平均值土SEM(59)-2.66±2.23(47)-5.74±2.58(29)-1.76±3.21(31)-4.81±3.77(30)-3.53±2.59(16)-7.51+3.99P值NSNSNS势活*被9/16:K表3.人GIGB肽中所含的氨基酸残基<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表4(n)PBS基线期和第12个月时的IFNY产生(n)PHA(n)Cand(n)Ha1(1)(n)Ha2(I)BCI(58)389±71(46)734±111(57)2837±(50)497±113(55)876±139190-(58)671±133(54)769±107(55)766±132(54)685±112(57)728±116f58)970±150(46)407±71(46)508±790.184(46)2844±(38)840±194(44)950±176233(45)539+140(45)767±113(46)2178±0.0460.888(44)848±163(45)749±1030.544(46)638±118(46)655±1260.293(28)239±57(28)648土131(27)2955±250(24)339±124(28i487±115(26)627±147(26)571±82(26)516±119(26)536±92(27)714±187(28)795±194(30)324土81(3。i544±1080.371(30)2982±28(30J2062土291(25)989±283(29)627±2110.246(29)1190±253(29)692±122(29)1042±236(29)684±116(30)672土166(30)709±1770.798(30)528±123(30)2731f30i815土178286(26)644±183(30)842±231(29)1099±222(29)990±220(28)823±196(30)740±146(28)795±195(16)563±133(16)2585±(16)439±1033520.153(16)2397±(13)554±150(16)378±900.245(15)486±102(16)902±2300.106(15)473±103(16)866±2030.061(16)573±143(16)554±1470.240总安慰剂基线第12个月晚期安慰剂基线第12个月200680043061.X势溢击被11/16:K月a个c线u值总基割pI月c个期线u值早基第p月c个期线w值晚基第D.表5<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表6<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>基线期和第12个月时SScPBMG的IL-10产生(n)PBS(n)PHA(n)Cand(n)BCI(n)Hoc1(1)(n)Ho2(1)(65)382+93(65)277±36(64)1500+177(63)1131±135(52)168±40J64)195±23(64)537±83(65)240±25(65)827土99(61)579±85(65)641+85(61)433±47(51)247±48(51)293±430.565(51)1263±219(51)1438±2190.172(41)"M8土24(50)260±500.778(51)398±91(51)256±370.234(49)604±87(49)536±660.093(49)425+71(49;466±660.052(34)308土77(34)328±59(33)1656±258(32)"80土189(28)205±69(33)212±33(33)577±128(34264土38(34)984土155(32)57B土109(34)700±135(32)463±71(34)271±64(34)281±430.922(34)1314±264(34)1290±1190.541(27)136±34(33)235±570邻6(34)478±127(34)239±420.826(33)665±"2(33)495±780.314(33)462+96(33)400±590.376(31)463±175《31i220±37(31)1334+242(31J1082±194(24)125土30(31)177±32(31)493±106(31)213±32(31)655±113581±136(31)577±99(29)400±6275(17)199±64(1力319+980.457(17)1161±403J17)1734±4760.1肪(14)83±24(17)310±1000.明8(17)239±96(17)289±750.070(16)479±131(16)621±1230.122(16)348+90(16)602±1590.039200680043061.X势溢也^H/165X表月个月个剂安月I个c月个安线ua线u值期线u期线u值总基第总基第s:早基第早基第p慰月I月安个a个期线u期线u值晚基第晚基第p基线期和第12个月时用牛nc1fl、CB肽培养的SScPBMC的IL-10产生<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表8表9<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>权利要求1.治疗患者中的纤维化疾病的方法，包括口服给药患者从正发生纤维化的组织来源的组织蛋白。2.权利要求1的方法，其中所述纤维化疾病选自以下疾病组成的组硬皮病(SSC)，皮肤纤维化，肝硬化，肾纤维化，肺纤维化，心脏纤维化，胃肠纤维化和血管纤维化。3.权利要求1的方法，其中所述患者已经患有所述纤维化疾病至少3年。4.权利要求1的方法，其中所述组织蛋白是胶原蛋白。5.权利要求2的方法，其中所述纤维化疾病是SSc。6.权利要求5的方法，其中所述组织蛋白是I型胶原蛋白或其片段。7.权利要求6的方法，其中所述胶原蛋白源自人或除人以外的动物种类。8.权利要求6的方法，其中所述胶原蛋白或其片段以大约500^g/天口服给药所述患者。9.权利要求8的方法，其中所述患者被治疗大约12个月。10.权利要求l的方法，其中所述组织蛋白的口服给药在所述患者中诱导耐受性。全文摘要本发明首次证实口服给药的I型胶原蛋白(CI)在患有系统性硬化症(SSc)的患者中诱导CI耐受性，并缓解所述疾病的临床表现。因此，本发明提供了通过口服给药从正发生纤维化的组织来源的组织蛋白例如胶原蛋白来治疗纤维化疾病的方法。文档编号A61K35/12GK101309694SQ200680043061公开日2008年11月19日申请日期2006年11月16日优先权日2005年11月16日发明者A·E·波斯尔斯韦特,A·H·康申请人:田纳西大学研究基金会