治疗缺血相关疾病的方法

专利名称：：治疗缺血相关疾病的方法
技术领域：
：本发明涉及治疗缺血相关的疾病及紊乱的方法，包括由于突然丧失氧气导致的神经及心脏疾病，以及像阿尔茨海默病这样的变性疾病。所述方法涉及某些縮氨基硫脲化合物的使用。
背景技术：
：本发明总地涉及某些N-杂环甲醛縮氨基硫脲(HCTs)的新用途，目前己知所述的N-杂环甲醛縮氨基硫脲(HCTs)，作为核糖核苷酸还原酶的强力抑制剂，可用作抗肿瘤剂。使用这些化合物治疗肿瘤的方法特别地在Sartorelli等的美国专利5,721,259和5,281,715中公开。另外，本发明涉及HCTs的许多新的类似物，其令人惊讶地被发现具有神经保护作用。新近，美国专利6,613,803公开了某些新型的縮氨基硫脲用于治疗神经元损伤和神经变性疾病的用途。据称该新型化合物作为钠通道阻断剂发挥其治疗作用。然而，到目前为止，本领域中一直没有公开与Sartorelli的专利中公开的那些相同或相似的化合物用于治疗或预防神经元损伤的用途。神经细胞的存在及生理功能的实现需要能量支持。中枢神经细胞能量的唯一来源通常认为来自血液的葡萄糖及氧气。如果全部或任何部分中枢神经系统的血液供应被关闭，那么受累的神经元会缺氧及低糖(又称缺血疾病，并且其在本文中与缺氧和/或低糖同义使用)，并且它们迅速变性和死亡。临床上，通常将神经系统缺乏血液供应的情况称为"脑卒中"。仅仅是氧气供应的中断，则称为"缺氧"，这发生在昏厥、窒息或溺水。单独是葡萄糖的供应中断，则称为"低糖"。近年来，已经认识到，谷氨酸盐在中枢神经系统正常和健康的情况下是一种重要的兴奋神经递质，但在缺血时则起着神经毒性作用，称为"兴奋毒性(excitotoxicity)"。通常，谷氨酸盐存在于细胞内，仅仅在突触连接处微量释放，作用到毗邻含有谷氨酸盐受体的祌经元以传递神经信号。在正常情况下，释放到细胞外液的谷氨酸盐在数毫秒时间内会以一种高效的转运过程被转运回神经元内。只要这种转运过程工作正常，谷氨酸盐的兴奋毒性潜能就会被遏制。然而，这种转运过程是需要能量的，所以在缺血(能量短缺)的情况下，谷氨酸盐转运失能，已经释放作为递质的谷氨酸盐分子则会在细胞外的突触液中蓄积。这使得谷氨酸盐持续与兴奋受体接触，让这些受体处于过度刺激状态，这种情况下神经元过度兴奋导致死亡。两个额外的因素使情况更加复杂和恶化(l)受刺激过度的神经元在另外的突触连接处释放过量的谷氨酸盐，使更多的神经元处于过度刺激状态，神经毒积累范围超过初始的缺血区；和(2)与正常的神经元相比，受过度刺激的神经元更迅速消耗葡萄糖或氧气，这加速了有限能源的消耗，并进一步损害谷氨酸盐的转运过程。因此，象在脑卒中、心跳停止、昏厥的缺氧或低糖这样能量不足情况下导致的脑损伤是由双重机制造成的；初始的原因是缺血本身，其导致谷氨酸盐转运系统失灵及谷氨酸盐介导的兴奋毒性事件级联反应很大程度上为随后的脑损伤负责。除上述情况外，最近已经注意到神经元使用能量基质(葡萄糖及氧气)来维持其能量水平的能力的各种缺陷还可以激发导致神经元死亡的兴奋毒性过程。据推定，这是出现在象阿尔茨海默病、帕金森氏综合症、亨廷顿舞蹈病及肌萎縮性脊髓侧索硬化(ALS)这样的神经疾病中的神经变性的机制。例如，在患阿尔茨海默病病人脑活检组织中，已发现细胞内能量代谢缺陷的证据，并被建议引发谷氨酸盐兴奋毒性潜能释放导致阿尔茨海默病中神经元的死亡，从而通过与能量关联的兴奋毒性过程来解释。也有报道，在帕金森氏综合症及亨廷顿舞蹈病中细胞内存在能量代谢的内在缺陷的证据。尽管目前市场上没有神经保护用治疗剂，但是存在被批准用于治疗慢性神经疾病的药物，其是谷氨酸受体(NMDA)拮抗剂。尽管有证据表明这些药物在慢性CNS变性疾病中有改善作用，但是NMDA拮抗剂单独似乎通常不能提供实质的对缺血的保护作用，特别是在紧急情况下。谷氨酸盐受体拮抗剂作为神经保护剂抵抗缺血性神经变性的突出限制是，它们仅暂时使神经元与变性隔离；它们既没有更正能量短缺，也没有更正随着能量短缺继发而来的其它错乱。因此，尽管这些拮抗剂的确在动物模型中对缺血性神经变性提供了某种程度的保护，但其保护是不完全的，并且在某种情况下仅延缓了变性的始发时间。因为缺血状况发生后神经元开始非常迅速地变性，所以很明确尚需要新的治疗剂，它们会发挥作用以保护神经元免受进一步的变性和死亡，例如通过恢复由血流中的氧和糖提供的能量平衡发挥作用。这些治疗剂不仅用于治疗急性缺血疾病，而且用于预防在慢性变性疾病如阿尔茨海默病和帕金森氏综合症中的神经元变性，基于纠正神经元能量短缺和预防兴奋毒性神经元变性。另外，本发明的化合物还可用于治疗眼和耳的由缺血性病因导致的神经疾病，以及糖尿病性神经病。开发能够预防或治疗不管是急性还是慢性缺血事件的后果的治疗剂，将是极受欢迎的。
发明内容本发明涉及以某些N-杂环2-甲醛縮氨基硫脲(HCTs)及其可药用盐或前药投药给所需病人以预防和/或治疗由缺血状况导致的疾病的方法这种有用的化合物由式I表示更优选地，所述化合物选自式II:更优选地，本发明的方法采用了在以下更完全描述的选自式III、IV、V或VI的化合物。作为最优选的实施方案，PAN-811(3-氨基吡啶-2-甲醛縮氨基硫脲)，其具有下式结构，用于实践本发明的方法更优选地所述化合物选自式II:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>本发明还涉及治疗、改善和/或预防特定的缺血相关疾病的方法，包括但限于治疗在任何原因导致的弥散性和病灶性缺血后的神经元损伤(并预防另外的缺血性损伤)，治疗或预防牵涉缺血性状况的耳神经毒性和眼病(如黄斑变性)，预防由于创伤或冠状动脉旁路手术导致的缺血，治疗或预防神经变性疾病如肌萎縮性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病、帕金森氏综合症和亨廷顿舞蹈病，以及治疗或预防糖尿病性神经病。图1为用PAN-811(A)或已知的神经保护剂维生素E(B)、硫辛酸(C)或银杏(GinkgoBiloba)(D)预处理，随后用过氧化氢处理的细胞存活率(左版面)及神经保护能力(右版面)的代表性图示。图2为PAN-811对神经细胞中产生ROS的影响的代表性图示。(A)PAN-811对神经细胞中产生过氧化氢诱导的ROS的影响。(B)PAN-811对神经细胞中产生基础水平的ROS的影响。图3为在缺氧情况下神经毒性对葡萄糖浓度的依赖性的代表性图示。图4为在常氧情况下及缺氧情况下PAN-811的神经保护作用的代表性图示。图5为在缺氧/低糖情况下PAN-811毒性的代表性图示。图6为轻度缺氧/低糖情况下PAN-811对神经细胞死亡的保护作用的代表性图示。图7为脑皮质神经元被PAN-811处理24小时时，PAN-811神经毒性的代表性图示。图8为PAN-811对缺血产生毒性的保护作用的代表性图示。图9为在用PAN-811或溶剂预处理，然后用过氧化氢处理后的细胞存活率的代表性图示。图10为在用PAN-811或溶剂预处理，然后用过氧化氢处理后的细胞存活率的代表性图示。发明详述缺血相关紊乱或疾病的病理学，涉及通常由于血管狭窄或阻塞导致的体内器官、组织或机体的部分血液供应减少，例如视网膜病、急性肾衰竭、心肌梗塞及脑卒中。这可以是急性发作(如心脏病发作)或慢性过程(如阿尔茨海默病或ALS)的结果。本发明意在可用于急性或慢性病理学中。本发明涉及以式I的化合物或其可药用盐或前药投药给所需病人以治疗缺血相关疾病特别是神经元细胞和组织的方法其中HET是含1或2个选自N和S的杂原子的5或6元杂芳基残基，并且任选地被氨基取代；并且R为H或Q-C4-垸基。在一优选实施方案中，所述化合物由式n表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中R是H或C广Q-烷基；并且R1、re和W独立地选自H和氨在另一优选实施方案中，所述化合物由式III表示:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula其中R是H或C1-4-垸基；并且Ri和R2独立地选自H和氨基,在另一优选实施方案中，所述化合物由式IV表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中R是H或C1-4-垸基。在又一优选实施方案中，所述化合物由式V表示:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>其中R是H或C1-4垸基.最后，另一优选实施方案是式VI所示的化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中R是H或d-Or烷基,作为更优选的实施方案，本发明的化合物选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(在式n中，R是甲基，并且R!、R2和R3是H);<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(在式III中，R是甲基并且R,和R2是H);<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>(在式V中，R是H);和(在式VI中，R是H)。本发明的最优选的实施方案涉及下式所示的PAN811(3-氨基吡啶-2-甲醛縮氨基硫脲)投药给所需病人以治疗缺血相关疾病的方法
技术领域：
：本发明的某些化合物可在C二N双键附近以E、Z-立体异构体存在，并且本发明包括异构体的混合物以及单独的异构体，单独的异构体可通过本领域普通技术人员公知的方法被分离。本发明的某些化合物可以光学异构体形式存在，并且本发明包括这些光学异构体的外消旋混合物以及单独的对映体，单独的对映体可通过本领域普通技术人员公知的方法被分离。可药用盐的例子是无机酸和有机酸的加成盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸、乙酸盐、二氯乙酸盐和草酸盐。前药的例子包括，例如，化合物与作为羟垸基的R,-R3形成的酯，并且这些前药可根据己知技术制备。本发明人令人惊讶地和意想不到地发现化合物3-氨基吡啶-2-甲醛縮氨基硫脲，及其若干新型类似物，可有效用作神经保护剂，已知目前仅仅公开了所述化合物作为抗肿瘤剂的用途。例如，参见美国专利5,721,259。因此，本发明的实施方案之一涉及特定的缺血相关疾病的改善，包括但限于治疗在任何原因导致的弥散性和病灶性缺血后的神经元损伤(并预防另外的缺血性损伤)，治疗或预防牵涉缺血性状况的耳神经毒性和眼病(如黄斑变性)，预防由于创伤或冠状动脉旁路手术导致的缺血，治疗或预防神经变性疾病如肌萎縮性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿舞蹈病，以及治疗或预防糖尿病性神经病。在脑卒中后的头几分钟减少神经损伤，是获得有效治疗的重要策略。在脑卒中期间，血栓栓子封闭了动脉，中断了局部脑区的氧及葡萄糖供给，从而导致梗死中心核的神经元的丧失。中心核中的细胞经坏死性机制，非常迅速地死亡。环绕着缺血梗死区的脑区，结构尚存，但(电传导)功能终止(称作半影)。半影是一种暂时的区域，它演变成梗死是一种相对进行性现象(Touzanietal.,Curr.Opin.Neurol.14:83-8，2001)。这一区域提供了挽救某些脑功能的可能性，处理半影的治疗窗口大大长于处理梗死区。半影也可描述为供血受限的区域，能量代谢仍然保留。因此，半影区是神经保护治疗及重新激活静止神经元的因子如高压氧的靶区。由此，中枢神经受损后立即的损伤也许不是可逆的，但加重脑损伤，主要是迷漫性脑缺氧/缺血事件链的进行，可以由有效的神经保护战略加以防止。例如，在冠状动脉旁路移植术(CABG)之前及期间给予神经保护剂，能够有效地保护由脑血流短期改变(引起轻度缺氧/低糖状态)造成的神经变性。如此，本发明的化合物能够显著地保护神经并在神经损伤后挽救神经元，因此特别可用于对脑卒中患者的投药。用于本发明方法中的化合物的合成方法在本领域是众所周知的。这样的合成方案在美国数个专利中给予描述5,281,715、5,767,134、4,447,427、5,869,676及5,721,259。在此，它们以全文引为参考。在另一个方面，本发明涉及可用于本发明方法中的2-甲醛縮氨基硫脲的药物组合物。本发明的药物组合物包含一种或多种所述化合物及药学上可接受的载体或稀释剂。在此，"药学上可接受的载体"包括任一和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂及延缓吸收剂和生理相容的类似物。载体的类型可根据打算的给药途径选择。在不同的实施方案中，载体适合于静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部、经皮或口服给药。药学上可接受的载体，包括无菌水溶液或分散系及适用于临时制备无菌注射溶液或分散系的无菌粉剂。这些介质及试剂用作药学活性物质是本领域众所周知的。除与活性化合物不相容以外，任何常规的介质或试剂都可考虑在本发明中的药物化合物中的使用。补充的活性化合物也能被添加到这种组合物中。本发明的药物组合物可通过任何手段给药以实现其预定目的，例如，通过非肠道、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、透皮或经颊途径。优选地，通过经口途径给药，并且可以是立即释放或延迟释放形式。给药剂量将根据接受者的年龄、健康和体重，同时进行的治疗的种类(如果有的话)，治疗频率，和所需作用的性质等的不同而异，并且通常由临床医师确定。本发明的药物组合物通过制药工业的普通技术生产，并且本发明不受这些技术的限制。将/优选将活性剂配制到用于经口给药的片剂或胶囊中，其使用本领域已知方法制备，例如使用湿法造粒和直接压片的方法。经口给用片剂使用本领域已知的任何适当的方法制备。例如参见Remington'sPharmaceuticalSciences,18thEdition,A.Gennaro,Ed.,MackPub.Co.(Easton,PA19卯)，Chapters88-91，其全文作为参考被引入。通常，将活性成分，即，一种或多种縮氨基硫脲，与药学可接受的赋形剂(例如粘合剂、润滑剂等)混合并压縮成片剂。优选地，通过为形成均匀粒子的湿法造粒技术或直接压片法制备所述剂型。或者，可将活性成分与先前制备的非活性粒子混合。然后将潮湿粒子千燥，并使用适当的筛分设备进行过筛以提供粉末，然后根据需要将该粉末填充进胶囊中或者压縮成基质片剂或锭剂。在一个方面，使用直接压片法制备片剂。直接压片法相对于湿法造粒法提供了许多潜在的优点，特别是关于生产容易性方面而言。在直接压片法中，将至少一种药学活性剂和赋形剂或其它组分通过不锈钢筛如40目的钢筛进行过筛。然后将过筛后的粒子加入到适当的掺混机中并掺混适当的时间。然后将掺混物在使用适当工具的旋转压片机上压縮成片剂。或者，可将药物组合物包含在含有微胶囊或小球的胶囊中。制备这些小球的方法是本领域已知的(参见Remington's,同上)。通过常规方法将小球填充进胶囊，例如明胶胶囊中。可注射的无菌溶液，可用所需的量将活性化合物掺入到药学可接受的液体介质中并过滤除菌而制备。通常，将活性化合物掺入到含有基本分散介质的无菌媒介物中来制备分散系。在无菌粉剂用于制备可注射无菌溶液的情况下，优选的制备方法是真空干燥及冰冻干燥，这将生成活性成分加上来自其前述无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉剂。所述药物组合物中的活性剂(即一或多种縮氨基硫脲)以治疗有效量存在。"治疗有效量"意指在剂量及所需时间段获得期望的治疗结果，该结果积极影响特定疾病状态的过程的有效量。当然，活性剂的治疗有效量可根据个体的疾病状态、年龄、性别、体重及该活性剂在个体引起期望反应的能力的不同而异。剂量方案可被调整以提供最佳的治疗反应。治疗有效量也指治疗上有益效果超过其毒性或有害性作用的量。在另一个实施方案中，活性剂以预防有效量被配制在组合物中。"预防有效量"意指在剂量及所需时间段获得期望的疾病预防结果的有效量。通常，预防剂量低于治疗有效量，这是因为该剂量用于对象发病之前或疾病的早期。组合物中活性化合物的量可根据个体的疾病状态、年龄、性别及体重等因素的不同而异。剂量方案可被调整，以提供最佳的治疗反应。本发明的剂量单位形式规格由以下指定并直接依赖于(a)活性化合物的独特性质及想获得的具体疗效；(b)对个体治疗敏感度方面，在组合这种活性化合物时技术上的内在局限。预期本发明的剂量单位将包含与目前在抗肿瘤治疗中使用的量(例如Triapine,VionPharmaceuticals,Inc.)几乎相同的量的活性剂。本发明的药物组合物可对需要本发明化合物的有益效果的的任何动物给药。所述动物优选是哺乳动物，最优选是人。本发明可通过下列的实施例进一步阐明，这些实施例不应解释为局限性。本申请中所有参考文献、专利及公布的专利申请特别地并以全文在此引作参考。实施例实施例1PAN-811与其它神经保护剂的神经保护效能比较本研究的目的是在阿尔茨海默病相关的氧化应激细胞模型中，比较PAN-811(3-氨基吡啶-2-羧醛縮氨基硫脲；C7H9N5S;MW495)与已知的神经保护剂，如维生素E，硫辛酸及银杏的神经保护能力。细胞的分离及培养初生皮层神经元从17日龄大鼠胚脑分离，以每孔5万个细胞接种到96孔板，在常规的神经基础培养基(neurobasalmedium)中培养2-3周。以不含抗氧化剂的新鲜神经基础培养基半量换液两次。用PAN-811、其它神经保护剂及过氧化氢处理PAN-811以lmg/ml(5mM)溶解于乙醇，并进一步以培养基稀释到O.l]uM、lpM及10pM的终浓度。其它已知的神经保护剂被溶解到合适的溶剂中，并稀释到指示的终浓度。神经元用PAN-8U、已知的神经保护剂或媒介物预处理24小时，然后进行过氧化氢(终浓度150pM)诱导的氧化应激。对照包括未处理的细胞(没有化合物及过氧化氢处理)、仅仅用化合物处理的细胞、暴露于过氧化氢但无化合物的细胞。未处理的细胞被用作对照来评价毒性及改进的存活率。每个分析重复三次。细胞功能的评价24小时后，使用标准的MTS分析(Promega)评价存活率及线粒体功能。遵循制造商的操作规程。材料神经基础培养基(Invitrogen);B27-AO(Invitrogen);PAN-811(VionPharmaceuticals,Inc.);过氧化氢(Calbiochem);乙醇(Sigma);维生素E(Sigma);硫辛酸(Sigma);银杏(CVS);MTS分析试剂盒(Promega)。实验以上述"研究设计"中描述的方法进行。PAN-811以lmg/ml(5mM)溶解于乙醇，并进一步以神经基础培养基稀释到O.lpM、lpM及10pM的终浓度。硫辛酸以240mM溶解于乙醇，并进一步以神经基础培养基稀释到10|iM、25pM及100pM的终浓度。维生素E以lOOmM溶解于乙醇，并进一步以神经基础培养基稀释到50nM、100pM、20(HiM及400pM的终浓度。银杏以6mg/ml溶解于去离子水，并进一步以神经基础培养基稀释到2.5pg/ml、5pg/ml、25pg/ml及250pg/ml的终浓度。在处理结束时，用lOOpl新鲜的预热神经基础培养基加上B27(-AO)更换培养基。培养板放回到细胞培养箱(37'C，5。/。C02)—小时。之后，每孔中加入2(Hil的MTS试剂，培养板再放回到细胞培养箱(37。C，5。/。C02)两小时。以BioRad读板机(型号550)记录每孔在4卯nm的吸收。仅含培养基的孔作为空白对照。每个数据点为3个单独分析孔的平均值。未处理的细胞被用作计算细胞存活率及神经保护能力的对照。两周龄原代培养物用于这一研究。结果参见图l。结果PAN-811在l-10pM浓度时，显示良好的神经保护能力，甚至是在苛刻的过氧化氢处理之下。维生素E及硫辛酸在苛刻处理之下，有最小的神经保护能力。银杏在苛刻处理之下，显示某种程度的神经保护。PAN-811在l-10nM终浓度时，显示显著的神经保护，甚至是在苛刻的过氧化氢处理之下。PAN-811的神经保护效能明显超出其它已知神经保护剂，维生素E、硫辛酸及银杏。实施例2PAN-811对神经细胞中产生活性氧(ROS)的影响本研究的目的是评价PAN-811在阿尔茨海默病相关的氧化应激细胞模型中减少ROS产生的能力。在本实施例中使用的材料与实施例1中使用的材料相同。初生皮层神经元从17日龄大鼠胚脑分离，以每孔5万个细胞接种到96孔板，在常规的神经基础培养基中培养2-3周。以不含抗氧化剂的新鲜神经基础培养基半量换液两次。初生皮层神经元由HBSS缓冲液冲洗一次，用IO^iM5-(及6-)氯甲基-2，，7，-二氯二氢荧光素二乙酸酯，乙酰酯(CM-H2DCFDA)孵育以预装载染料。之后细胞用HBSS缓冲液冲洗，用终浓度为0.1、1、5及10pM的PAN-811处理一小时，并进一步进行由300pM过氧化氢诱导的氧化应激两小时。每孔在485/520nm(Ex/Em)的c-DCF荧光以BMG极星(polarstar)读板机记录，并用于评价细胞内ROS的生成。装载了染料但未处理的细胞用作计算c-DCF荧光改变的对照。每一分析重复三次。结果每孔在485/520nm(Ex/Em)的c-DCF荧光以BMG极星读板机记录。含有细胞但无染料的孔作为空白对照。每个数据点是三个单独分析孔的均值。加了染料但未处理的细胞用作计算c-DCF荧光改变的对照。两周龄的原代培养物被用于本研究。CM-H2DCFDA是一种细胞渗透性的ROS指示剂，直到乙酸酯基团被细胞内酯酶去除并在细胞中出现氧化，CM-H2DCFDA方显示出荧光。它被广泛用于检测细胞内及动物体内活性氧(ROS)的生成。在此，按照研究设计中描述的方法，它被用作评价PAN-811对神经细胞内ROS生成影响的工具。如图2所示，PAN-811在降低过氧化氢诱导的ROS生成和神经细胞内基础水平的ROS生成上，展示了良好的能力。使用缓冲液及PGE-300/EtOH替代PAN-811的平行对照实验，显示对细胞内的ROS生成无影响。实验以不同批次细胞重复4次，获得类似的结果。代表性的实验参见图2。PAN-811在原代神经细胞内明显减低基础水平的ROS生成(~50%;在10pM)及过氧化氢诱导的ROS生成(~30%;在10pM)。参考文献GibsonGE，ZhangH，XuH，ParkLC,JeitnerTM.(2001).Oxidativestressincreasesinternalcalciumstoresandreducesakeymitochondrialenzyme(氧化应激增加内部钙储量和减少关键的线粒体酶).BiochimBiophysActa.Marl6;1586(2):177-89。ChignellCF，SikRH.(2003).Aphotochemicalstudyofcellsloadedwith2',7，-dichlorofuorescin:implicationsforthedetectionofreactiveoxygenspeciesgeneratedduringUVAirradiation(装载有2，，7，二氯荧光素的细胞的光化学研究在UVA照射中检测产生的活性氧的提示).FreeRadicBiolMed.Apr15;34(8):1029-34。实施例3PAN-811对缺氧或缺氧/低血糖症诱发的神经毒性是一种潜在的神经保护剂。目的本研究的目的是理解PAN-811是否能够在体外保护由缺氧或缺氧/低糖(H/H)导致的神经毒性。在相关的工作中，PAN-811对过氧化氢处理的原代神经元已显示明显的神经保护作用。本实施例中使用的材料与实施例1中所用的材料相同。LDH试验试剂盒得自Promega。(缩写BSS二平衡盐液；CABG-冠状动脉旁路移植术；d.i.v.-体外天数；EtOH-乙醇；H/I^缺氧/低糖；LDH-乳酸脱氢酶；MCAO中脑动脉闭塞；NB^4申经基质介质；NMDA二N-甲基-D-天冬氨酸；PEG二聚乙二醇)96孔培养板用于本实验。皮质神经元以每孔5万个细胞密度接种在聚-D-赖氨酸涂布的表面，培养在无血清培养基中(NB加上B27补充齐U)以获得高富集神经元的培养物。培养神经元14d丄v.以上，以增加细胞对兴奋氨基酸的易感性(Jiangetal.，2001)。6个重复孔作为一组处理以利于分析定量。如下表1所示，脑中葡萄糖浓度通常超过2.2mM。在缺血时，其浓度在中心核及半影分别下降到0.2mM及1.4mM。恢复循环后一至两小时，葡萄糖浓度回复到正常水平(Folbergrovdetal.,1995)。表1.葡萄糖浓度(mmol/kg)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>为理解葡萄糖浓度对缺氧诱导的神经毒性的影响，我们己经检测了不同剂量的葡萄糖。如图3所示，与正常情况下葡萄糖浓度为25mM相比，葡萄糖浓度下降到2.9mM没有导致神经细胞死亡。当葡萄糖浓度下降到0.4mM时，MTS分析显示有强烈的细胞死亡出现。为模拟脑卒中的脑环境，我们建立了三种体外模型系统。极度H/H模型(0.4mM葡萄糖)是梗死中心核环境的模拟；轻度H/H模型(1.63mM葡萄糖)为MCAO期间半影区环境的模拟；而以单纯缺氧模型(正常神经元下，体外葡萄糖的浓度为25mM)来模拟重新灌流后半影区的环境，这是因为在重新灌流后缺氧而不是能量衰竭是造成可能的细胞死亡的主要原因。对于极度H/H及轻度H/H而言，通过将葡萄糖的浓度分别降低到0.4mM及1.63mM获得缺氧/低血糖症。在使用前，将BSS(116.0mMNaCl,5.4mMKC1,0.8mMMgS04'7H20，l.OmMNaH2P04,1.8mMCaC12*2H20,26.2mMNaHC03及0.01mM甘氨酸)或含有25mM葡萄糖的BBS脱气5分钟。缺氧下培养板中的培养基用BBS或含有葡萄糖的BBS置换。同时，常氧下培养板中的培养基由未脱气的BBS或含有葡萄糖的BBS置换。为造成细胞缺氧，将培养板置于密封的容器(模块培养室-101TM，Billups-Rothenberg，Inc.),施加真空20分钟以从培养基中去除氧及其它气体，然后以30psi的压力向容器内充填5%二氧化碳及95%氮气1分钟。以02指示器(FYRITE气体分析器，Bacharach，Inc)测定容器内氧气的含量为0。培养板置于室内6小时。作为实验对照，重复的培养板维持在正常培养条件下(5%二氧化碳及95%环境气体)同样长的时间。6小时后从容器内取出处理的培养板，以含有25mM葡萄糖的终止液[添加1X丙酮酸钠，10.0mMHEPES及1XN2补充的DMEM]，置换缺氧及常氧条件下培养物中的培养基，并培养在5%二氧化碳及95%环境气体的条件中。用不同浓度的PAN-811及媒介物作为阴性对照处理神经元。以MK801作为阳性对照。在H/H侵害后的24或48小时，以MTS及LDH分析(见下文)来评价线粒体功能及细胞死亡。在单纯缺氧模型中，以溶剂或PAN-811预处理神经元24或48小时。药物处理在缺氧24小时期间及之后仍在持续。在缺氧侵害之后的24或48小时，评价细胞形态及功倉巨(MTS及LDH分析)。形态评估的神经细胞死亡。在缺氧之前，神经元是健康的，具有相亮(phase-brilliant)的体细胞(箭头头部)及完整的神经突起(空心箭头)。背景上，这些突起及其分枝形成致密的网络。缺氧导致细胞体的皱縮及神经突起与网络的崩溃。5nM剂量的PAN-811及谷氨酸盐NMDA受体拮抗剂MK801有效地避免了神经细胞的死亡，并部分保存了神经突起。MTS分析是一种测定代谢活性细胞中线粒体功能的比色分析。该检测间接反映细胞存活率。MTS四唑化合物在代谢活性细胞的线粒体中，被还原为有色的可溶于组织培养基的甲月替(fomiazan)产物，其在490nm的吸收可被检测。将20^1的MTS试剂(Promega)加到含有样品的lOOpil培养基的96孔培养板的孔中。在增湿、5%二氧化碳、37°C条件下，孵育培养板1到2小时，直至充分呈现颜色。以Bio-Rad96孔读板机记录在490nm处的吸收。乳酸脱氢酶(LDH)分析是基于乳酸脱氢酶作用使NAD还原。得到的还原NAD(NADH)用于四唑盐染料的化学计量转换。如果分析从不同处理培养物取出的无细胞培养基等份，则活性可用作相关细胞死亡以及细胞膜完整性的指示。将50|11等份的培养基由每孔测试的96孔培养板的孔中转移到未用过的培养板中的孔，并补入25pl等量混合的底物、酶及染料(Sigma)。在室温下孵育20到30分钟，之后于490nm波长处进行分光光度测定。结果单纯缺氧模型以PAN-811在缺氧前预处理皮质神经元48小时。PAN-811于24小时缺氧期间及缺氧之后的48小时保留存在。如图4所示，2)tiM剂量的PAN-811完全阻止了细胞死亡，但在50pM出现细胞毒性。用2jiMPAN-811、1:80绿茶或5pMMK801于缺氧24小时之前、期间和之后处理皮层24小时。在检测的试剂中，PAN-811显示了最高的效力，完全阻止神经细胞死亡及线粒体机能障碍。轻度H/H模型在受侵害之前及期间，PAN-811保护神经元免受轻度H/H诱导的神经毒性培养胚胎(E17)大鼠皮质神经元15天，以PAN-811及媒介物在缺氧/低血糖症之前24小时和缺氧/低血糖症期间(6小时)处理。在接受侵害后17小时，通过MTS及LDH分析评价结果。PAN-811在浓度为5pM时，完全保护了缺氧/低血糖症诱导的线粒体机能障碍及神经细胞死亡，而1:1520倍稀释的PEG:EtOH(相当于媒介物在5pMPAN-811中的量)，没有形成这种保护。代表性数据见图5。下面的表2总结了6次实验的结果，浓度范围覆盖2-50jiM。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>**在03年7月13日及03年7月25日实验中，检测范围的起始浓度为5pMPAN-811在受侵害期间，特别是侵害之后，保护细胞免受轻度H/H诱导的神经毒性神经元培养15天后，用PAN-811或媒介物PEG:EtOH(7:3)于6小时H/H之前处理24小时(之前组)。或者，神经元培养16天后，用上述试剂在6小时H/H期间处理(期间组)，在6小时H/H期间及H/H之后的48小时阶段处理(期间及之后组)，或在H/H之后的48小时阶段处理(之后组)。在H/H阶段之后48小时，进行LDH分析。图6中的结果表明，在H/H期间，特别是H/H之后处理神经元，PAN-811保护神经细胞死亡，但在H/H之前处理神经元，保护作用微不足道。极度H/H模型PAN-811在浓度《50iiM，未见神经保护作用(未示资料)。PAN-811在2pM时，对单纯缺氧及轻度H/H诱导的神经毒性有完全的保护作用。PAN-811在100pM时，对极度H/H诱导的神经细胞死亡仅有部分阻止作用。因此，PAN-811不太可能与能量代谢有关。当缺氧或局部缺血侵害期间或之后给药，PAN-811显著保护神经细胞免于死亡。PAN-811的效力明显高于MK801和/或绿茶。在长时间暴露(120小时)的情况下，5(HiM的PAN-811是神经毒性的。参考文献Jiang,Z.-G.,Piggee,C.A.，Heyes,M.P.,Murphy,C.M.,Quearry，B.，Zheng，J.，Gendelman，H.E.，andMarkey，S.P.GlutamateisaprincipalmediatorofHIV-l-infectedimmunecompetenthumanmacrophageneurotoxidty(谷氨酸盐是HIV-l感染的免疫活性人巨噬细胞神经毒性主要介质)丄Neuroimmunology117(12):97-107，2001。Folbergrov&,J.，Zhao,Q.，Katsura,K.,andSiesj6，B.K.N-tert-butyl-phenylnitroneimprovesrecoveryofbrainenergystateinratsfollowingtransientfocalischemia(N-叔丁基苯基硝酮改善大鼠在短暂的局部缺血后脑能量状态的恢复).Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:5057-5061,1995。Touzani，O.，Roussel,S.，andMacKenzie，E.T.Theischemicpenumbra.(局部缺血半影)Curr.Opin.Neurol.14:83-88,2001。实施例4在短暂的局部脑缺血的体内模型中，PAN-811显示显著的神经保护作用在氧化应激及缺血的体外模型中，PAN-811已显示显著的神经保护作用。对该化合物的现有工作与已知的毒性谱及药代动力学数据，强烈表明PAN-811用于治疗脑卒中的潜力。使用的材料与上述实施例中使用的材料相同。在本实施例中，MCAO用作中脑动脉闭塞的縮写。在着手体内研究前，在数种神经变性的细胞模型中检测PAN-Sll。由胚龄为15日龄的Sprague-Dawley大鼠胚胎制备富集的神经元培养物。以无菌技术，从子宫中取出鼠胚，置于无菌神经元培养基中。在解剖镜下，从各胚胎中取出脑组织，小心去除脑膜及血管。在显微镜下通过大致解剖分离小脑，仅小脑组织用于培养。研碎组织，游离细胞，以每孔5Xl()S细胞的密度接种到聚-L-赖氨酸预涂布的48孔培养板上。培养物在含有等量Eagle氏基础培养基(无谷氨酰胺;)和Ham氏F-12k培养基的溶液中维持，该溶液补充有10%热灭活的马血清、10%胎牛血清、600^/ml葡萄糖、100|ag/ml谷氨酰胺、50U/ml青霉素及50pg/ml链霉素。48小时后，加入l(HiM阿糖胞苷，以抑制非神经细胞的分裂。培养7天的细胞，用于实验。用不同浓度(0-100iiiM)的PAN-811处理细胞24小时。以MTT分析确定细胞存活率。对4种兴奋毒性的体外模型进行研究。暴露细胞于H/H条件3小时，或以lOOjiM谷氨酸盐、l(iMstaurosporine、lOpM藜芦定(veratridine)处理45分钟。所有细胞与或不与10pMPAN-811的Locke氏溶液共同处理。在各兴奋毒性暴露结束时，更换条件培养基(原始培养基)。将细胞孵育在无外加葡萄糖的Locke氏溶液，5%二氧化碳及95%氮气饱和的增湿密闭容器中3小时来诱导H/H。兴奋毒性侵害24小时后，评价细胞存活率。应用以3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑盐(MTT，SigmaChemicalCo.Ltd.,St.Louis,Mo)为基础的四唑盐比色分析，定量评价细胞损伤。简言之，将染料添加到各孔(终浓度1.5mg/ml)，细胞用MTT酸化的异丙醇(0.1NHC1的异丙醇)孵育细胞，然后用96孔读板机测定各样品在540nm的吸收强度。值表示为维持在各板上的媒介物处理的对照细胞的百分比，并计算细胞存活率百分数的变化。体内研究36只雄性Sprague-Dawley大鼠(270-330克，CharlesRiverLabs,Raleigh,VA)用于本项研究。以5%氟烷诱导麻醉，和在2%氟垸的氧气中维持。以恒温加热系统(HarvardApparatus,SouthNatick,MA)，使体温在整个手术过程中保持在正常温度(37il。C)。食物及水于手术前后随意摄取，动物在12小时明暗周期环境中，分笼饲养。麻醉后，使用中脑动脉闭塞(MACO)的丝阻方法(filamentmethod)来实现短暂局部缺血并重灌流。简言之，分离右侧外颈动脉并凝结其分支。以3-0未涂布的圆头单丝尼龙缝合线，经外颈动脉插入内颈动脉，并向前推进(由颈动脉分叉算起约22mm)直至遇到轻微阻抗，这样封闭了MCA的起端。血管内缝合线留在原处2小时，然后收回以允许血液重新灌流到MCA。MCAO手术后，动物放到维持22'C室温的恢复笼中。在2小时缺血阶段及缺血后最初6小时，也用75瓦加热灯直接放在每个笼子的顶部，以保证整个试验中动物的体温恒定在正常体温。在MCAO之前，经静脉内注射，以每公斤体重1毫克PAN-811处理大鼠10分钟。制备PAN-811的70。/。PEG300，30。/。EtOH的储液。在注射前，用无菌盐水将该储液稀释5倍(终浓度为lmg/ml)。对每只大鼠脑而言，缺血性脑损伤的分析被测量为总的梗死体积的函数。这从氯化2,3，5-三苯基四氮唑(TTC)染色7个冠状切片(2毫米厚)获得。脑切片采集区由额极l毫米处开始，终止于皮质小脑接合处的嘴端。使用计算机辅助影像分析计算梗死体积。简言之，每一TTC染色的前脑切片的后表面被数字化成像(LoatsAssociates,Westminster,MD)，并定量缺血损伤的面积(以平方毫米计)。结果体外研究PAN-811的神经毒性结果见图l。实际上，PAN-811在浓度最高为100pM时，仅有轻微的毒性。在检测的最高浓度，最大毒性仅为8.7%(见图7)。PAN-811的神经保护PAN-811显示明显地保护神经元免受不同兴奋毒的侵害(图2)。以10pMPAN-811预处理神经元保护缺氧/低糖(保护约92。/。)，100pM谷氨酸盐(保护约75%)，lnMstaurosporine蛋白激酶C抑制剂及细胞凋亡诱导齐U(保护约47。/。)及l(HiM藜芦定钠通道阻断剂(保护约39。/。)处理3小时诱导的损害(见图8)。体内研究本实验的结果见表3。36只大鼠用于本试验，而ll只大鼠因以下原因被排除在外4只在无出血并发症下死于严重卒中，4只出现亚急性出血(SAH)(24小时内有3只死亡)、l只由于手术中突发火灾演习、l只鼠由于统计定为无关项、另l只死于过量的氟垸。在这7只死亡的大鼠(4只无SAH，和3只有SAH下死于严重卒中)中，6只是未处理(媒介物)的大鼠，仅1只是PAN-811处理的。媒介物处理的大鼠的平均梗死体积为292.96mm3，范围在198.75-355.81。PAN-81l处理的大鼠的平均梗死体积为225.85mm3，范围在42.36-387.08。这显示23。/。的神经保护(p〈0.05)。由于原因未知，在对照组观察到比正常测量更严重的损伤。因此，PAN-811处理动物的梗死尺寸也比预计的神经保护要显著得多。尽管如此，在两组中的差异性是极好的(SEM为10X或更少)，差异性结果与先前发表的研究一样好，如果不是更好的话。在体外及体内模型系统中，PAN-811的耐受良好，并且相对无毒。以10lnMPAN-811预处理神经元，明显保护神经元免受导致神经变性的兴奋毒性的侵害。在短暂局部脑缺血前10分钟以单剂量(lmg/ml)的PAN-811预处理大鼠，可减小23%的平均梗死体积。参考文献WilliamsAJ,DaveJR,PhillipsJB,LinY,McCabeRT，andTortellaFC.(2000)Neuroprotectiveefficacyandtherapeuticwindowofthehigh-affinityN-methyl-D-aspartateantagonistconantokin-G:invitro(primarycerebellarneurons)andinvivo(ratmodeloftransientfocalbrainischemia)studies(高亲和性N-甲基-D-天冬氨酸盐拮抗剂conantokin-G的神经保护功效和治疗窗口体夕卜(原代小脑神经元)和体内(短暂局部脑缺血大鼠模型)研究).JPharmacolExpTher.294(l):378-86.表3媒介物处理PAN-811处理大鼠编号梗死体积大鼠编号梗死体积R28198.75R2142.36R17208.03Rl126.42R2267.38R30143.74Rll270.89R24158.83R34282.51R3196.18R19308.19R26200.08R27308.45R23218.54R36334.81R20221.46RIO339.85R25224.32R4347.89R31255.36R32355.81R5267.40R13344.47R16375.59R8387.08均值292.96均值225.85标准差53.60标准差96.67标准误16.16标准误25.84数量11数量14P值0.05%保护23%表3:媒介物和PAN-811处理的大鼠的梗死体积(以mmS表示)。大鼠在MACO前用lmg/mlPAN-811处理10分钟，手术之后24小时测定梗死体积。实施例5PAN-811保护神经元免受过氧化氢诱导的氧化应激本研究的目的是在阿尔茨海默病相关的氧化应激细胞模型中，评价PAN-811作为神经保护剂的功效。神经保护及细胞毒性被测定。不同的溶剂被检测，以确定是否合适作为投递PAN-811的媒介体。使用的材料与其它实施例中使用的材料相同。初生皮层神经元从17日龄大鼠的胚脑分离，并以每孔5万个细胞接种到96孔板，在常规的神经基础培养基中培养2-3周。以不含抗氧化剂的新鲜神经基础培养基半量换液两次。PAN-811以lmg/ml(~5mM)溶解于乙醇或DMSO中，以5mg/ml(25mM)溶解于PEG-300/乙醇(70。/。/30。/q)中，并进一步以培养基稀释到lpM、5pM、20pM及50juM的终浓度。神经元用PAN-811或媒介物处理24小时，之后进行由过氧化氢(终浓度60-70)iiM)诱导的氧化应激。对照包括未处理的细胞(没有PAN-811及过氧化氢处理)、仅仅用PAN-811处理的细胞和暴露于过氧化氢但没有PAN-811的细胞。未处理的细胞用作对照以评价神经元毒性及改进的存活率。每个分析重复3次。等体积的溶剂(乙醇、DMSO与PEG-300/乙醇)被加到细胞中以测定溶剂对分析的影响。24小时后，使用标准的MTS分析(Promega)评价培养物的存活率及线粒体功能。遵循制造商的操作规程。结果实验1实验以上述研究设计中描述的方法进行。在处理结束时，用ioopi新鲜的预热神经基础培养基加上B27(-AO)更换所有的处理和培养基。培养板被放回到37。C，5%002的细胞培养箱一小时，然后每孔中加入2(^1的MTS试剂，培养板继续在37°C，5%(302的细胞培养箱中培养两小时。以BioRad读板机(型号550)记录每孔在490nm的吸收。仅含培养基的孔作为空白对照。每个资料点是三个单独分析孔的平均。未处理的细胞被用作计算细胞存活率及神经保护能力的对照。三周龄的原代培养物用于这一研究。结果参见图9。实验2实验以实验1的相同方法进行。两周龄的原代培养用于这一研究。结果请见图10。在这些实验中，所有三种溶剂在相当于PAN-811终浓度l-10pM的稀释度时，对本分析系统有最小的影响。DMSO在相当于PAN-811终浓度20pM或以上的稀释度时，显示一定水平的神经保护。乙醇和PEG-300/乙醇在相当于PAN-811终浓度50pM的稀释度时，显示一定水平的神经保护能力。PAN-811在l-10pM时，显示好的神经保护。与单独乙醇比较，PAN-811在PEG-300/乙醇中有较好的溶解性。PAN-811在l-10pM的终浓度时，显示良好的神经保护能力。PEG-300/乙醇在相当于PAN-811l-20^M的稀释度时，对分析系统有最小的干扰，因此是被检3种溶剂中最好的PAN-811溶剂。本领域技术人员很容易得知本发明非常适合于实现目标，并获得最终结果和所述优点以及其中内在的东西。对本领域技术人员显而易见的是，在实施本发明时，可有不同的修饰及变更而无需背离本发明的精神及范围。对本领域技术人员而言可以在包含权利要求书中限定的本发明实质的范围内进行这里所述的修改和其他的应用。权利要求1.缓解、治疗或预防由缺血状况引起的神经元损伤的方法，该方法包括对有需要的病人投药治疗有效量的式I的化合物或其药学可接受的盐或前药其中HET是含1或2个选自N和S的杂原子的5或6元杂芳基残基，并且任选地被氨基取代；并且R为H或C1-C4-烷基。2.权利要求1的方法，其中对所述病人投药的所述化合物或其盐或前药由式II表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中R是H或CrCr烷基；并且R1、R2和R3独立地选自H和氨基。3.权利要求1的方法，其中对所述病人投药的所述化合物或其盐或前药由式III表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中R是H或d-C4-烷基；并且Ri和R2独立地选自H和氨基。4.权利要求1的方法，其中对所述病人投药的所述化合物或其盐或前药由式IV表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>IV其中R是H或Q-Cr烷基。5.权利要求1的方法，其中对所述病人投药的所述化合物或其盐或前药由式V表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>V其中R是H或d-C4-烷基。6.权利要求1的方法，其中对所述病人投药的所述化合物或其盐或前药由式VI表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R是H或Q-CV烷基。7.权利要求1的方法，其中对所述病人投药的所述化合物或其盐或前药由下式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>8.权利要求2的方法，其中R是甲基，并且RpR2和R3是H。9.权利要求3的方法，其中R是甲基并且Ri和R2是H。10.权利要求4的方法，其中R是甲基。11.权利要求5的方法，其中R是H。12.权利要求6的方法，其中R是H。13.式I的化合物，其中HET是含1或2个选自N和S的杂原子的5或6元的未取代的杂芳基残基；并且R为H或d-C4-垸基。14.权利要求13的化合物，其中HET是吡啶、哌嗪、噻唑或咪唑。15.权利要求14的化合物，其中R是甲基。16.药物组合物，其包括权利要求13、14或15所述的一种或多种化合物以及药学可接受的载体。全文摘要本发明涉及通过以某些缩氨基硫脲化合物投药给需要的病人来治疗或预防缺血相关(如神经细胞缺氧和/或低糖)疾病的方法。更特别地，本发明涉及预防或治疗某些缺血相关疾病的方法，所述疾病包括但不限于阿尔茨海默病，帕金森氏综合症，和由于如下所述状况导致的缺血疾病冠状动脉旁路移植术、心搏停止导致的弥漫性脑缺血、病灶性脑梗塞、脑出血、出血性梗塞、高血压性出血、由颅内血管畸形破裂造成的脑出血、颅内动脉瘤破裂造成的蛛网膜下腔出血、高血压性脑病、颈动脉狭窄或阻塞造成的脑缺血、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓损伤、脑血管疾病例如，动脉粥样硬化、脉管炎、斑变性、心肌梗塞、心肌缺血及室上性心动过速。文档编号A61K31/17GK101365436SQ200680042845公开日2009年2月11日申请日期2006年11月20日优先权日2005年11月18日发明者侯赛因·A·甘巴里,姜志钢,毕坚·阿尔玛森,潘魏英,迈克尔·S·莱博维茨申请人:万能药制药公司