一种快速提高灯盏花中灯盏乙素含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和植物学技术领域，特别涉及到快速提高灯盏花中灯盏乙素 含量的方法。
【背景技术】
[0002] 灯盖花是菊科植物短葶飞蓬Erigeronbreviscapus(Vant. )Hand-Mazz的干燥全 草，又名灯盏细辛、东菊，主要分布于我国西南地区，尤以云南较多。短葶飞蓬中提取的黄酮 类混合物灯盏花素素由灯盏甲素，灯盏乙素和咖啡酰奎宁酸之类组成。普遍认为灯盏乙素 (5, 6, 4-三羟基黄酮-7-葡萄糖醛酸苷）是其主要活性物质。具有抗缺血损伤、抗血小板聚 集、改善器官血流动力学和微循环等多方面作用，对缺血性心脑血管疾病有显著疗效。
[0003] 在植物体内类黄酮的生物合成途径普遍存在，并产生极其丰富的次生代谢产物， 统称类黄酮化合物，野黄芩苷（灯盏乙素）也是其中的一员。在灯盏花中，通过上游苯丙 素途径，苯丙氨酸在L-苯丙氨酸解氨酶（PAL)，肉桂酸4-羟化酶（C4H)和4-香豆酰CoA 连接酶（4CL)催化苯丙氨酸生成对香豆酰辅酶A，再通过下游黄酮途径，通过查尔酮合成酶 (CHS)，查尔酮异构酶（CHI)，黄烷酮6-羟化酶（F6H)，黄酮合成酶II(FNSII)和UDP-葡萄 糖醛转移酶（F7GAT)催化生成灯盏乙素（图1)。
[0004] 但是自灯盏花被研发成为药品后，这一野生资源就被大量采摘，可观的经济利益 导致灯盏花资源过度开发，环境遭到严重破坏，野生资源日益减少，逐渐造成如今灯盏花资 源紧缺的现状。面对这一问题，云南在2002年就开始尝试灯盏花人工种植，但是由于对灯 盏花相关遗传研究滞后及其遗传背景狭窄等问题，杂交育种的难度极大，因此到目前为止 均为野生株系的栽培，后代稳定性差，给灯盏花规模化栽培以及GMP管理带来了巨大的挑 战。
[0005] 因此提高灯盏花中有效成分的含量，尤其是灯盏乙素的含量，对培育优异的灯盏 花资源具有重要意义。
[0006]目前尚无文献报道灯盏花植株培养提高灯盏乙素含量的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种快速提高灯盏花中灯盏乙素含量的方法，使用灯盏花植 株培养方法，提高灯盏花中有效成分--灯盏乙素的含量。
[0008] 本发明的主要技术方案是：将种子播种于土壤，取生长90天的灯盏花植株作为处 理对象，通过茉莉酸甲酯（MeJA)进行诱导，实现快速提高灯盏乙素含量的目的。
[0009] 本发明提供了一种快速提高灯盏花中灯盏乙素含量的方法，也即一种获得灯盏乙 素积累量最大的灯盏花植株的培养方法、或一种通过茉莉酸甲酯诱导提高灯盏花中有效成 分灯盏乙素的方法，该方法是生长80-100天（最优为90天）的长势良好的灯盏花植株作 为处理对象，将I. 5mM的MeJA溶液15mL/株均匀喷洒于灯盏花叶片上，培养3天以上；培养 过程中光照强度为2500-3500LUX，温度为25°C。
[0010] 本发明方法的具体步骤如下：
[0011] A.种子的萌发：将灯盏花种子播种于土壤，覆盖透明塑料薄膜保持水分，在光照 12小时/天，光照强度2500-3500LUX条件下培养，温度为25°C，待发芽后去除塑料薄膜，30 天后得到颜色有光泽呈鲜绿色，生长旺盛的幼苗；
[0012] B.移栽幼苗：每株幼苗移栽至独立的土壤环境，于同样条件下（光照12小时/天， 光照强度2500-3500LUX，温度25°C)培养60天（无塑料薄膜），选取长势良好的灯盏花植 株作为诱导对象；
[0013] C.茉莉酸甲酯诱导灯盏花植株：取长势相近的灯盏花植株（5-7片叶，ll-14cm 长），将I. 5mM的MeJA溶液15mL/株均匀喷洒于灯盏花叶片上，随后立即将整个植株套入透 明塑料袋中；
[0014]D.如上述条件，即光照12小时/天，光照强度2500-3500LUX，温度25°C下继续培 养3天后，即得灯盏乙素积累量最大的灯盏花植株。
[0015] 优选的，步骤A、B和D中的光照强度优选3000LUX。
[0016] 其中步骤C中，MeJA溶液配制方法为：取纯度大于95% (质量分数）的MeJA溶 于丙酮和水得到MeJA终浓度为I. 5mM(丙酮体积为总体积的1% )的溶液作为工作浓度。 MeJA-定要喷洒均匀，保证每片叶的正面反面都充分与其解除。套袋要迅速，以免MeJA挥 发流失过多。
[0017] 其中播种前需进行种子的处理，处理步骤具体为：将干燥灯盏花种子浸泡于纯水 中30min，去除漂浮表面的杂质。
[0018] 术语解释，本文中"Lux"是指光照强度。
[0019] 本文中"独立的土壤环境"是指将每株植株幼苗分开种植，但是其他条件包括土 壤，光照，温度都保持相同。
[0020] 本发明的有益效果如下：
[0021] 本发明克服了灯盏花中灯盏乙素含量较低，有效成分不稳定的问题。本发明经高 效液相-三重四极杆质谱（HPLC-MS/MS)实验证明，有效成分灯盏乙素含量显著提高。
[0022] 本发明的方法操作简单，能够培育出灯盏乙素含量高的灯盏花植株，满足了市场 需求。
【附图说明】
[0023] 图1灯盏花取样图，图中显示即为长势相近的灯盏花植株（5-7片叶，ll-14cm 长）。
[0024] 图2茉莉酸甲酯（MeJA)对灯盏乙素代谢的影响。图中方块Scutellarin为灯盏 乙素，其他化合物是代谢流中的化合物。结果表示三个生物学重复的平均结果。
[0025] 图3茉莉酸甲酯（MeJA)对基因表达影响。空白对照用白色表示，诱导组用黑色表 示，其中A、B、C和D分别表示基因CHI、CHS、F3H和FNSII在诱导前后表达量的变化。
【具体实施方式】
[0026] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0027] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商 所建议的条件。
[0028] 实施例1 :
[0029] 1.种子的处理：将干燥灯盏花种子30mg浸泡于纯水中30min，去除漂浮表面的杂 质，将筛选后的种子均匀铺于提前润湿的土壤中，再于表面覆盖一层土壤。
[0030] 2.发芽：在土壤上覆盖一层透明的塑料薄膜，以保存水分。置于光照强度为 3000LUX条件下培养，光照12小时/天，温度为25°C，待发芽后去除塑料薄膜，30天后得到 颜色有光泽呈鲜绿色，生长旺盛的幼苗。
[0031] 3.培养：将每株幼苗移栽至独立的土壤环境，继续同样条件培养60天。
[0032] 4?诱导：取长势符合要求（5-7片叶，ll-14cm长）的灯盏花植株（见图1)，将 I. 5mM的MeJA溶液均匀喷洒于灯盏花每张叶片上，每株喷洒15mL，随后立即套袋。在与步 骤2相同的条件下继续培养至第3天即得到灯盏乙素含量高的植株。
[0033] 实施例2 :LC_MS/MS测定灯盏花中灯盏乙素及其前提化合物含量
[0034] 1.取满足实例1中的灯盏花共27株，于诱导第0，1，2,3,4,5,6,7天起取样。
[0035] 2.对照品、标准品溶液的制备以及色谱分离条件
[0036] 用乙醇将标准品野黄芩苷（灯盏乙素），芹菜素-7-葡萄糖醛酸（灯盏甲素），野 黄芩素，芹菜素和芹菜素-7-葡萄糖苷（大波斯菊苷），稀释到5微克/毫升为工作液浓度。
[0037] 将得到的灯盏花植株置于37°C恒温烘箱中干燥，干燥后研磨成粉，称取2.Omg，过 100目筛，70%乙醇ImL,超声提取两次，每次30min，15000rpm离心30min，滤液定容至2mL, 滤液用〇. 2yM微孔有机滤膜过滤，进样。
[0038]色谱柱：美国Agilent公司，AgilentZorbaxSBC18 3. 5um150X2.ImmID，米 用等梯度洗脱方式，流速〇. 3mL/min，进样量10iiL，流动相：乙腈-水（30:70)，柱温30°C， 分析时间2.Omin。
[0039] 3.质谱检测条件及LC-MS/MS测定丹参中酚酸类化合物的方法学考察
[0040] 采用ESI离子源、负离子检测，选择MRM工作方式进行一 /二级质谱分析。质谱检 测工作参数如下：气体流速（GasFlow)10L/min、气体温度（GasTemp)35(TC、喷雾器压力 (Nebulizer)40帕、毛细管电压（Capillary)4000V。优化的多反应监测（MRM)参数见表1。
[0041] 表1优化的多反应监测（MRM)参数
【主权项】
1. 一种快速提高灯盏花中灯盏乙素含量的方法，其特征在于，该方法如下：生长 80-100天的长势良好的灯盏花植株作为处理对象，将I. 5mM的茉莉酸甲酯溶液15mL/株均 匀喷洒于灯盏花叶片上，培养3天以上；培养过程中光照强度为2500-3500Lux，温度为25°C 〇
2. 根据权利要求1所述的一种快速提高灯盏花中灯盏乙素含量的方法，其特征在于， 该方法按照下述步骤进行： A、 种子的萌发：将灯盏花种子播种于土壤，覆盖透明塑料薄膜保持水分，在光照12小 时/天，光照强度2500-3500LUX条件下培养，温度为25°C，待发芽后去除塑料薄膜，30天后 得到颜色有光泽呈鲜绿色，生长旺盛的幼苗； B、 移栽幼苗：每株幼苗移栽至独立的土壤环境，于同样光照12小时/天，光照强度 2500-3500Lux，温度25°C条件下无塑料薄膜培养60天，选取长势良好的灯盏花植株作为诱 导对象； C、 茉莉酸甲酯诱导灯盏花植株：取长势相近的5-7片叶，ll-14cm长的灯盏花植株，将 I. 5mM的茉莉酸甲酯溶液15mL/株均匀喷洒于灯盏花叶片上，随后立即将整个植株套入透 明塑料袋中； D、 在光照12小时/天，光照强度2500-3500Lux，温度25°C条件下继续培养3天后，即 得灯盏乙素积累量最大的灯盏花植株。
3. 根据权利要求2所述的一种快速提高灯盏花中灯盏乙素含量的方法，其特征在于， 步骤A、B和D中的光照强度均为3000LUX。
4. 根据权利要求2所述的一种快速提高灯盏花中灯盏乙素含量的方法，其特征在于， 其中步骤C中，茉莉酸甲酯溶液配制方法为：取纯度大于95%的茉莉酸甲酯溶于丙酮和水 得到茉莉酸甲酯终浓度为I. 5mM的溶液。
5. 根据权利要求2所述的一种快速提高灯盏花中灯盏乙素含量的方法，其特征在于， 其中步骤A在播种前需进行种子的处理，处理步骤具体为：将干燥灯盏花种子浸泡于纯水 中30分钟，去除漂浮表面的杂质。
【专利摘要】本发明涉及一种快速提高灯盏花中灯盏乙素含量的方法，属于生物技术和植物学技术领域。发明的主要技术方案是：将种子播种于土壤，取生长90天的灯盏花植株作为处理对象，通过茉莉酸甲酯(MeJA)进行诱导，实现快速提高灯盏乙素含量的目的。本发明克服了灯盏花中灯盏乙素含量较低，有效成分不稳定的问题。本发明经高效液相-三重四极杆质谱(HPLC-MS/MS)实验证明，有效成分灯盏乙素含量显著提高。
【IPC分类】A01G1-00, A01G7-06, A01G7-04
【公开号】CN104541885
【申请号】CN201510006715
【发明人】张磊, 陈瑞兵, 黄鑫, 刘江华
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月7日